象皮生肌膏對糖尿病皮膚潰瘍修復(fù)的效果及其機(jī)理探究

雷宇　周忠志　蘭宏偉　王婷婷　黃新靈

[摘要]目的：研究象皮生肌膏對糖尿病模型大鼠皮膚潰瘍的修復(fù)作用，初步探究象皮生肌膏的作用機(jī)理。方法：選取80只清潔級雄性SD大鼠，隨機(jī)分成4組，正常組、模型組、貝復(fù)新組、象皮生肌膏組。各組分別在治療7、14 d后觀察各組皮膚潰瘍的修復(fù)狀況、檢測皮膚潰瘍組織中IL-6和TNF-α的表達(dá)情況。結(jié)果：象皮生肌膏組和貝復(fù)新組大鼠潰瘍創(chuàng)面的修復(fù)率較模型組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而且象皮生肌膏組修復(fù)率較貝復(fù)新組更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與正常組相比，模型組內(nèi)IL-6、TNF-α的含量顯著增加（P<0.01）。與模型組相比，象皮生肌膏組及貝復(fù)新組創(chuàng)面組織勻漿中的IL-6、TNF-α的含量顯著下降（P<0.01），且象皮生肌膏組較貝復(fù)新組各指標(biāo)含量下降更明顯（P<0.05）。結(jié)論：象皮生肌膏可以加快糖尿病皮膚潰瘍的修復(fù)，其作用機(jī)理可能是調(diào)控創(chuàng)面炎性因子IL-6、TNF-α的含量，減少炎性細(xì)胞的聚集，加快皮膚潰瘍創(chuàng)面的修復(fù)。

[關(guān)鍵詞]象皮生肌膏;糖尿病;皮膚潰瘍;炎癥因子;白細(xì)胞介素-6;腫瘤壞死因子-α

[中圖分類號(hào)]R587.2? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2022）01-0089-03

Effect of Xiangpi Shengji Ointment on IL-6 and TNF-α in Diabetic Skin Ulcer

LEI Yu1，2，ZHOU Zhongzhi1，LAN Hongwei1，WANG Tingting1，HUANG Xinling1

（1.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，Hunan，China;2.College of Traditional Chinese Medicine，Changsha Medical University，Changsha 410219，Hunan，China）

Abstract： Objective To observe the effect of Xiangpi Shengji ointment on promoting the healing of diabetic skin ulcer and to study its effect on the inflammatory factors IL-6 and TNF-α in diabetic skin ulcer. Methods Selected 80 clean male SD rats，they were randomly divided into 4 groups：normal group， model group， Berfuxin group and Xiangpi Shengji ointment group. The repair status of skin ulcer and the expression of IL-6 and TNF-α in skin ulcer tissue were observed at 7 and 14 days after intervention. Results The repair rate of ulcer wound in Xiangpi Shengji ointment group and beifuxin group was significantly higher than that in model group （P<0.01）， and the repair rate in Xiangpi Shengji ointment group was higher than that in beifuxin group （P<0.05）. Compared with the normal group， IL-6 and TNF in the model group- α The content of was significantly increased （P<0.01）. Compared with the model group， IL-6 and TNF in the wound tissue homogenate of Xiangpi Shengji ointment group and beifuxin group- α The content of all indexes in Xiangpi Shengji ointment group decreased significantly （P<0.01）， and the content of all indexes in Xiangpi Shengji ointment group decreased more significantly than that in beifuxin group （P<0.05）. Conclusion Xiangpi Shengji ointment can accelerate the repair of diabetic skin ulcer. Its mechanism may be to regulate the content of IL-6 and TNF-α， reduce the aggregation of inflammatory cells， and promote the repair of skin ulcer.

Key words： xiangpi shengji ointment; diabetes; skin ulcer; flammatory cytokines; interleukin-6; tumor necrosis factor-α

糖尿病是臨床中常見的慢性疾病，患者除了有“三高一低”的常見癥狀外，常常合并一些皮膚潰瘍，且病情易反復(fù)，纏綿難愈，極大地降低了患者的生活質(zhì)量。為尋求安全有效治療糖尿病導(dǎo)致的皮膚潰瘍的方法便成為臨床工作中亟需解決的問題。目前臨床上也有很多治療此疾病的藥物或方法，效果也各有優(yōu)劣。筆者醫(yī)院根據(jù)多年診治經(jīng)驗(yàn)研發(fā)了象皮生肌膏，此藥已通過藥監(jiān)局的審批，專用于治療各種皮膚潰瘍。筆者課題組多年研究結(jié)果證實(shí)[1-2]，象皮生肌膏能夠抗炎殺菌，減輕創(chuàng)面疼痛感，促進(jìn)局部潰瘍的修復(fù)。本次研究構(gòu)建糖尿病大鼠皮膚潰瘍模型，進(jìn)一步探究象皮生肌膏對模型大鼠局部皮膚創(chuàng)面的修復(fù)效果及其作用機(jī)理。具體結(jié)果如下。

1? 資料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠80只，雄性，清潔級，體重160～200 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑：①象皮生肌膏：象皮粉、當(dāng)歸、醋龜甲、生地黃、生石膏、爐甘石、血余炭等;②陽性對照藥：貝復(fù)新（珠海億勝生物制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字S20040001）;③造模藥：鏈脲佐菌素。大鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒（上海仁捷生物科技公司，批號(hào)Jul 2017），大鼠TNF-α ELISA檢測試劑盒（上海仁捷生物科技公司，批號(hào)Sep 2017），IL-6抗體（ab9324，abcam公司，批號(hào)GR35435-1）、TNF-α抗體（ab9579，abcam公司，批號(hào)GR35446-1）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀（BioTek公司）、5415R高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）、倒置顯微鏡（Olympus 公司）、電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）、Western blot儀器（美國Bia-Rad公司）等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 模型制備與分組：將80只清潔級雄性SD大鼠隨機(jī)分成4組：正常組、模型組、貝復(fù)新組、象皮生肌膏組。造模方式按照劉光源的方法構(gòu)建糖尿病大鼠模型[3]——大鼠使用高脂乳劑以每只2 ml/d的劑量連續(xù)灌胃14 d，然后根據(jù)40 mg/kg的劑量給大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（Sterptozotocin，STZ）使大鼠隨機(jī)糖尿大于16.7 mmol/L。構(gòu)建糖尿病模型成功的大鼠，參照文獻(xiàn)辦法[4]構(gòu)建糖尿病皮膚潰瘍模型—先給予糖尿病大鼠麻醉，腹腔注射10%水合氯醛，根據(jù)每只大鼠3.5 ml/kg的劑量進(jìn)行麻醉。再按照全層皮膚缺損標(biāo)準(zhǔn)，在背部兩側(cè)對稱部位剃毛形成2個(gè)4 cm×4 cm正方形裸皮區(qū)域。消毒裸皮區(qū)皮膚，隨后用打孔器在大鼠的皮膚消毒區(qū)域造2個(gè)半徑為0.5 cm的圓形創(chuàng)面，深至皮下，造成糖尿病全層皮膚缺損模型。

1.4.2 干預(yù)治療：正常組不予任何處理，正常飼養(yǎng)即可;模型組造模后不做任何干預(yù);貝復(fù)新組造模后創(chuàng)面局部涂擦貝復(fù)新凝膠;象皮生肌膏組造模后創(chuàng)面局部涂擦象皮生肌膏。各組干預(yù)治療結(jié)束后，創(chuàng)面局部用紗布包扎，再用繃帶固定。每日治療1次，共治療14 d。治療結(jié)束后取創(chuàng)面組織進(jìn)行檢測。

1.5 檢測方法

1.5.1 創(chuàng)面修復(fù)率：于治療7 d、14 d后，分別拍照記錄每組大鼠的皮膚創(chuàng)面修復(fù)狀況，并使用干凈透明的塑料薄膜覆蓋在每組大鼠的皮膚創(chuàng)面，再用鉛筆標(biāo)記創(chuàng)面邊緣，記下每組大鼠的創(chuàng)面面積，計(jì)算出每組大鼠的創(chuàng)面修復(fù)率。創(chuàng)面修復(fù)率=（創(chuàng)面初始面積-創(chuàng)面面積）/創(chuàng)面初始面積×100%。

1.5.2 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測各組創(chuàng)面組織中IL-6、TNF-α的含量：于治療7 d、14 d后，分別取每組大鼠的相同位置的創(chuàng)面組織，洗凈后剪碎，與預(yù)冷的生理鹽水以1：9的體積比例制備10%組織勻漿，4 ℃，3 000 r/min離心10 min，用ELISA試劑盒檢測每組樣品上清液中IL-6、TNF-α的含量。將制備好的樣品放入酶標(biāo)儀中，檢測每組樣本在波長450 nm的OD值，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每組樣本中IL-6、TNF-α的含量。

1.5.3 Western Blot檢測各組創(chuàng)面組織中IL-6、TNF-α蛋白的表達(dá)：于治療14 d后，取各組大鼠的相同位置的創(chuàng)面組織，洗凈后剪碎，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書提取并測定蛋白濃度，采用Western Blot檢測每組大鼠樣品中IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)量，其中IL-6、TNF-α，一抗按照1：1 000進(jìn)行稀釋，二抗按照1：5 000進(jìn)行稀釋。以GAPDH作為內(nèi)參照蛋白，計(jì)算出每組樣本中IL-6、TNF-α蛋白的相對表達(dá)量。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料服從正態(tài)分布采用（xˉ±s）;多組間的比較，用單因素方差分析，若滿足方差齊性，用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，若方差不齊，則用Dunnet T3檢驗(yàn)。不服從正態(tài)分布，采用比較秩和檢驗(yàn)。P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 各組大鼠創(chuàng)面修復(fù)率比較：治療7 d和14 d后，查看每組大鼠皮膚創(chuàng)面修復(fù)情況，結(jié)果如圖1。然后計(jì)算各組大鼠局部皮膚創(chuàng)面的修復(fù)率：與模型組相比，象皮生肌膏組和貝復(fù)新組大鼠局部皮膚的創(chuàng)面修復(fù)率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且象皮生肌膏組較貝復(fù)新組修復(fù)率更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）結(jié)果如表1。

2.2 各組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6、TNF-α含量比較：治療7 d和14 d后，使用ELISA檢測各組大鼠創(chuàng)面組織勻漿中炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá)水平。與正常組相比，模型組內(nèi)IL-6、TNF-α的含量顯著增加，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組相比，象皮生肌膏組及貝復(fù)新組創(chuàng)面組織勻漿中的IL-6、TNF-α的含量顯著下降，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且象皮生肌膏組較貝復(fù)新組各指標(biāo)含量下降更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果如表2～3。

2.3 各組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)量比較：治療后14 d，采用Western Blot檢測各組大鼠創(chuàng)面組織中炎癥因子IL-6、TNF-α蛋白的相對表達(dá)量。與正常組相比，模型組內(nèi)的IL-6、TNF-α蛋白相對表達(dá)量升高顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，象皮生肌膏組及貝復(fù)新組創(chuàng)面組織勻漿中的IL-6蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果如圖2。

3? 討論

中醫(yī)糖尿病又名“消渴病”，主要是上中下三焦陰虛，陰損及陽可導(dǎo)致臟腑陰陽失調(diào)，氣血兩虛，脾虛運(yùn)化水液失常，化濕成痰;血液無氣推動(dòng)運(yùn)行緩慢，形成瘀血。此外，患者陰虛燥熱，日久體虛，若干熱熾盛，積毒成膿，加之正氣虛衰無以抗邪，則可發(fā)為癰疽癤瘡，即“瘡瘍”、“脫疽”、“筋疽”，臨床將其稱為糖尿病皮膚潰瘍。臨床治療糖尿病皮膚潰瘍以清熱解毒、養(yǎng)陰益氣、活血化瘀為主[5]。

象皮生肌膏是筆者醫(yī)院的院內(nèi)制劑，方中象皮粉是君藥，主要有清熱解毒、化瘀止血的作用;生石膏、爐甘石是臣藥，可消腫止痛、斂瘡生肌;當(dāng)歸、血余炭、生地黃、醋龜甲四味藥，作為佐藥，能夠補(bǔ)血活血、滋陰清熱、益氣補(bǔ)虛。大量的臨床實(shí)踐證明，象皮生肌膏治療糖尿病皮膚潰瘍，患者的治愈率較好。前期的研究結(jié)果也證實(shí)，象皮生肌膏有局部抗炎、殺菌，改善血液循環(huán)、加快創(chuàng)面修復(fù)的功效。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，象皮生肌膏組治療7 d和14 d后，與模型組相比大鼠潰瘍局部創(chuàng)面修復(fù)的速率顯著增加（P<0.01），象皮生肌膏能增加糖尿病潰瘍的創(chuàng)面修復(fù)。

糖尿病是一種常見的慢性低炎癥性疾病，糖尿病潰瘍是其常見的并發(fā)癥，而潰瘍創(chuàng)面愈合慢的原因一直無法完全解釋[6]。創(chuàng)面愈合的過程非常復(fù)雜，包括創(chuàng)面炎癥反應(yīng)、血管新生、基質(zhì)形成和膠原合成，涉及多種可溶性介質(zhì)之間的作用，如生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子、細(xì)胞外基質(zhì)和不同細(xì)胞因子之間的協(xié)調(diào)作用[7-8]。慢性持續(xù)性炎癥、細(xì)胞相關(guān)因子的缺少、肉芽組織的生成減少、血液循環(huán)受損等是創(chuàng)面難以愈合的主要原因。

炎癥反應(yīng)是影響糖尿病皮膚創(chuàng)面潰瘍愈合的重要因素，其中IL-6和TNF-α是炎性細(xì)胞分泌的炎性因子，其高表達(dá)會(huì)使得各種炎癥細(xì)胞聚集于創(chuàng)面，導(dǎo)致發(fā)生劇烈的的炎性反應(yīng)，使得創(chuàng)面的愈合時(shí)間加長。IL-6是由內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞等分泌產(chǎn)生的一種多功能性炎性因子，它的過度表達(dá)可引起組織的修復(fù)能力下降。研究顯示[9]，IL-6與胰島素抵抗具有相關(guān)性，其表達(dá)程度與胰島素抵抗成負(fù)相關(guān)，即IL-6表達(dá)減少，組織創(chuàng)面的修復(fù)增加。TNF-α是由單核-巨噬細(xì)胞分泌的一種炎性因子，其正常表達(dá)時(shí)能夠調(diào)整人體的免疫系統(tǒng)，發(fā)揮免疫作用，而TNF-α的大量釋放反而會(huì)引起機(jī)體病理性損害，破壞機(jī)體的免疫平衡。當(dāng)皮膚破潰時(shí)外周血單核細(xì)胞相對比較活躍，抗炎因子分泌明顯減少，而促炎細(xì)胞因子分泌增加，活化的單核細(xì)胞能夠分泌TNF-α，使TNF-α水平增加[10]，促進(jìn)局部炎癥不斷加劇。在本實(shí)驗(yàn)中，治療7 d和14 d后分別檢測創(chuàng)面組織中炎癥因子IL-6和TNF-α的蛋白含量，發(fā)現(xiàn)模型組創(chuàng)面組織中的TNF-α、IL-6含量顯著增高，提示皮膚創(chuàng)面組織中有炎癥細(xì)胞聚焦，其炎癥反應(yīng)處于過激狀態(tài);而與模型組比較，象皮生肌膏組創(chuàng)面治療7 d和14 d后創(chuàng)面愈合速率顯著升高（P<0.01），象皮生肌膏能明顯加快糖尿病性潰瘍大鼠創(chuàng)面修復(fù)速率;象皮生肌膏組組織創(chuàng)面中IL-6、TNF-α的含量均顯著低于模型組（P<0.01），提示象皮生肌膏能夠降低創(chuàng)面組織中炎癥細(xì)胞因子IL-6、TNF-α的含量，減輕創(chuàng)面局部的炎癥反應(yīng)，并減輕創(chuàng)面組織炎性細(xì)胞的聚集。

綜上，象皮生肌膏可以促使糖尿病性潰瘍創(chuàng)面修復(fù)加快，其作用機(jī)理可能是調(diào)控創(chuàng)面炎性因子IL-6、TNF-α的含量，減輕創(chuàng)面組織炎性細(xì)胞的匯集，促進(jìn)皮膚潰瘍創(chuàng)面的修復(fù)，但較為詳細(xì)的作用機(jī)理需要更深入的探討。

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[收稿日期]2020-12-22

本文引用格式：雷宇，周忠志，蘭宏偉，等.象皮生肌膏對糖尿病皮膚潰瘍修復(fù)的效果及其機(jī)理探究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2022，31（1）：89-92.