LncRNA IGFBP7-AS1對腦膠質瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及機制

楊光偉 鄧楠

(1西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院神經外科,四川 瀘州 646000；2 瀘州市人民醫(yī)院神經內科)

腦膠質瘤是一種常見的原發(fā)性顱內腫瘤，易復發(fā)，預后較差〔1〕。膠質瘤的治療有手術、放療、化療等方法，但治療效果不佳〔2〕。膠質瘤的發(fā)病機制尚不十分明確，從基因水平探討膠質瘤的發(fā)病機制，從而進行基因治療膠質瘤日益受到關注。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類轉錄本超過200個核苷酸但不編碼蛋白質的，依據(jù)其相對于蛋白編碼基因的位置，可分為正義、反義、基因內、基因間LncRNA〔3〕。研究顯示，LncRNA可參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔4～6〕。如敲減LncRNA HOXC-ASl可通過下調HOXC8表達抑制膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲〔7〕。研究顯示，反義LncRNA胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP)7-AS1在膠質瘤組織中表達升高〔8〕，但其對膠質瘤細胞生物學行為的影響還未知。本研究主要探討敲減LncRNA IGFBP7-AS1對膠質瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及可能的調控機制。

1 材料與方法

1.1細胞和實驗試劑 正常星形膠質細胞HA1800和腦膠質瘤細胞系U251、A172、U87均購自中國科學院上海細胞所；胎牛血清(FBS)和RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(MTT)、兔抗人IGFBP7單克隆抗體均購自美國Sigma公司；逆轉錄試劑盒和聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒均購自美國Fermentas公司；鼠抗人B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體均購自美國Cell Signaling公司；Trizol試劑和LipofectamineTM2000試劑盒均購自美國Invitrogen公司；IGFBP7-AS1的si-RNA及陰性對照、IGFBP7過表達載體均購自上海吉凱基因公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒購自上海碧云天生物技術公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和分組轉染 正常星形膠質細胞HA1800、腦膠質瘤細胞系U251、A172、U87細胞復蘇后，加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、CO2體積分數(shù)5%、濕度97%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d更換新鮮的培養(yǎng)基。細胞融合至80%時，胰酶消化，進行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的U87細胞，接種于6孔板中，待細胞融合至60%時，參照LiPofectamineTM2000試劑盒操作說明，分別轉染IGFBP7-AS1的si-RNA(si-IGFBP7-AS1組)、si-RNA陰性對照(si-con組)、共轉染si-IGFBP7-AS1與IGFBP7過表達載體(si-IGFBP7-AS1+pcDNA-IGFBP7組)、si-IGFBP7-AS1與空載體(si-IGFBP7-AS1+pcDNA-control組)。轉染后48 h，qRT-PCR檢測IGFBP7-AS1、Western印跡檢測IGFBP7蛋白評價轉染效果。收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2qRT-PCR檢測IGFBP7-AS1表達 各組轉染后的細胞，預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，加入Trizol試劑，提取總RNA。微量核酸儀檢測細胞RNA的純度和濃度后，將其逆轉錄為cDNA。然后以cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR擴增條件：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)。采用2-△△Ct法計算IGFBP7-AS1的相對表達水平。

1.2.3Western印跡法檢測蛋白表達 細胞中加入蛋白裂解液，提取總蛋白，BCA法測定蛋白含量。取適量蛋白，100℃煮沸5 min。變性后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳結束后，濕轉至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶中封閉1 h。加入IGFBP7、Bcl-2和Bax抗體，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5 min。然后加入辣根過氧化酶標記的二抗，37℃孵育1 h。TBST再次洗膜后，加入電化學發(fā)光(ECL)顯影液，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。

1.2.4四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測細胞增殖 各組轉染后的U87細胞，以每孔1×103個接種于96孔板中。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μl濃度為5 mg/ml的MTT，培養(yǎng)箱中孵育4 h。吸棄培養(yǎng)基，加入150 μl二甲基亞砜，混合均勻后于酶標儀490 nm處測定吸光度值(A)。

1.2.5Transwell檢測細胞的遷移和侵襲 各組轉染后的U87細胞，PBS清洗后，加入不含F(xiàn)BS的細胞RPMI1640培養(yǎng)基，調整細胞濃度為5×104個/ml。細胞遷移實驗：取100 μl細胞懸液，加入Transwell上室。下室加入500 μl含F(xiàn)BS的RPMI1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，多聚甲醛固定細胞，結晶紫染色，棉簽擦去小室內膜細胞。倒置顯微鏡觀察，隨機選取5個視野，計數(shù)。細胞侵襲實驗：預先將基質膠用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋(比例1∶8)，鋪于Transwell上室，自然晾干。然后再取100 μl細胞懸液，加入鋪有基質膠的上室，后續(xù)操作同細胞遷移實驗。

1.2.6流式細胞儀檢測細胞凋亡 各組轉染后的U87細胞，以每孔1×104個接種于24孔板中。培養(yǎng)48 h后，胰酶消化，預冷的PBS清洗細胞2次。取1.0×106個細胞，1 000 r/min離心5 min，吸棄PBS。參照Annexin V-FITC/PI試劑盒操作說明，加入400 μl結合緩沖液，移液器輕輕吹打，混懸細胞。加入10 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育15 min。再加入5 μl PI，室溫避光孵育5 min。最后加入100 μl結合緩沖液，混勻后流式細胞儀檢測。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1IGFBP7-AS1在腦膠質瘤細胞系中的表達 與正常星形膠質細胞HA1800中IGFBP7-AS1表達水平(1.00±0.12)比較，腦膠質瘤細胞系U251、A172、U87顯著升高〔(4.12±0.45)、(3.98±0.37)、(3.89±0.41)，P<0.05〕。

2.2敲減IGFBP7-AS1對膠質瘤細胞U251增殖、遷移和侵襲的影響 si-IGFBP7-AS1組IGFBP7-AS1水平顯著低于si-con組(P<0.05)，表明si-IGFBP7-AS1轉染成功，U251細胞中IGFBP7-AS1敲低。與si-con組比較，si-IGFBP7-AS1組U251細胞A值、遷移和侵襲數(shù)顯著降低(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 敲減IGFBP7-AS1對U251細胞侵襲和遷移的影響(結晶紫染色，×200)

2.3敲減IGFBP7-AS1對U251細胞凋亡的影響 與si-con組比較，si-IGFBP7-AS1組U251細胞凋亡率和Bax蛋白表達顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見表1，圖2，圖3。

圖2 敲減IGFBP7-AS1對U251細胞凋亡的影響

圖3 敲減IGFBP7-AS1對U251細胞凋亡相關蛋白表達的影響

2.4敲減IGFBP7-AS1對U251細胞中IGFBP7表達的影響 與si-con組U251細胞IGFBP7蛋白表達水平(1.00±0.13)比較，si-IGFBP7-AS1組(0.32±0.04)顯著降低(P<0.05)。見圖4。

1～4：si-con組;si-IGFBP7-AS1組;si-IGFBP7-AS1+pcDNA-control組;si-IGFBP7-AS1+pcDNA-IGFBP7組圖4 Western印跡檢測U251細胞中IGFBP7的表達

2.5過表達IGFBP7逆轉敲減IGFBP7-AS1對U251細胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用 si-IGFBP7-AS1+pcDNA-IGFBP7組U251細胞IGFBP7蛋白表達水平(0.91±0.05)顯著高于si-IGFBP7-AS1+pcDNA-control組(0.34±0.05，P<0.05)，表明轉染成功。見圖4。與si-IGFBP7-AS1+pcDNA-control組比較，si-IGFBP7-AS1+pcDNA-IGFBP7組U251細胞A值、遷移和侵襲數(shù)顯著升高(P<0.05)。見表2。

2.6過表達IGFBP7逆轉敲減IGFBP7-AS1對U251細胞凋亡的促進作用 與si-IGFBP7-AS1+pcDNA-control組比較，si-IGFBP7-AS1+pcDNA-IGFBP7組凋亡率和Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見表2，圖5。

1～2：si-IGFBP7-AS1+pcDNA-control組;si-IGFBP7-AS1+pcDNA-IGFBP7組圖5 U251細胞中凋亡相關蛋白的表達

3 討 論

隨著對LncRNA研究的深入，發(fā)現(xiàn)LncRNA參與調控細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用〔9〕。

細胞的異常增殖可引起腫瘤的發(fā)生〔10〕。誘導腫瘤細胞凋亡是腫瘤治療的主要作用機制。本研究結果說明IGFBP7-AS1影響膠質瘤細胞的惡性生物學行為，是膠質瘤治療的潛在作用靶點。Bax是一種促凋亡蛋白，Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，兩者參與細胞凋亡過程。Bax表達升高可促進細胞凋亡，而Bcl-2表達升高則抑制細胞凋亡〔11〕。敲減IGFBP7-AS1抑制了膠質瘤細胞Bcl-2蛋白表達，促進了Bax蛋白表達，與相關研究報道結果一致〔12〕，提示IGFBP7-AS1通過調控胞Bcl-2和Bax蛋白表達誘導膠質瘤細胞凋亡。

IGFBP7是一種可調節(jié)細胞增殖、黏附及血管形成的可溶性蛋白，參與結腸癌、多發(fā)性骨髓瘤等腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔13，14〕。Jiang等〔15〕研究顯示，IGFBP7表達與膠質瘤腫瘤等級、患者總體存活率相關，抑制IGFBP7表達可抑制膠質瘤細胞的增殖和遷移。本研究結果提示IGFBP7-AS1通過下調IGFBP7表達影響膠質瘤細胞的惡性生物學行為，原因可能是IGFBP7-AS1水平降低可通過影響IGFBP7基因啟動子區(qū)域的組蛋白去乙酰化酶的富集，使IGFBP7基因啟動子區(qū)域的組蛋白乙酰化水平發(fā)生改變，從而抑制IGFBP7基因轉錄〔16〕。