供體豬心在UW 液中的保存時(shí)間和溫度對(duì)其組織結(jié)構(gòu)的影響

王翔宇，宋江平，舒松仁，任杰，鄭哲，胡盛壽，馬艷

心力衰竭被認(rèn)為是現(xiàn)代社會(huì)的一種流行病，全球患病人數(shù)超過(guò)3 770 萬(wàn)[1]，且隨著社會(huì)老齡化的進(jìn)程以及基于循證醫(yī)學(xué)的治療方案的實(shí)施，慢性心力衰竭的患病率仍在不斷上升，許多患者進(jìn)展到終末期心力衰竭，給全球經(jīng)濟(jì)造成巨大負(fù)擔(dān)[2-4]。目前，心臟移植被認(rèn)為是終末期心力衰竭患者的最佳選擇，在心臟移植50 多年的歷史中[5]，心肌保護(hù)液的發(fā)明和改進(jìn)對(duì)于擴(kuò)大移植心臟供體池、提高心臟移植手術(shù)成功率和患者術(shù)后的遠(yuǎn)期存活率有重要意 義[6]。國(guó)際上常用的心肌保護(hù)液有HTK 液（histidine-tryptophan-ketoglutarate cardioplegia）、Celsior 液、UW 液（University of Wisconsin solution）。最近的一項(xiàng)Meta 分析表明，與Celsior 液相比，UW液保存可減少器官缺血性壞死；與HTK 液相比，用UW 液保存器官時(shí)，受體存活率更高[7]。在供體心臟的運(yùn)輸過(guò)程中，心肌保護(hù)液的溫度和心臟的冷缺血時(shí)間是影響心臟結(jié)構(gòu)和功能的重要因素。目前臨床上靜態(tài)低溫（4℃）保存是器官體外保存的常用方法，主要是因?yàn)榈蜏乜梢砸种萍?xì)胞的生物化學(xué)活動(dòng)，導(dǎo)致心臟對(duì)能量的需求降低[8]，從而盡可能延長(zhǎng)心臟可以耐受的冷缺血時(shí)間[9]。但目前供體心臟可耐受的冷缺血時(shí)間仍然是限制移植心臟供體池容量的重要因素，冷缺血時(shí)間超過(guò)4 h 會(huì)顯著增加受體心臟移植后死亡率[10]。研究表明，亞常溫保存（如21℃，結(jié)合特制的心臟保存液）[11]以及過(guò)冷保存（使用特制保存液和制冷系統(tǒng)，低于0℃時(shí)仍然不凝固）[12]可有效延長(zhǎng)供體心臟可耐受的冷缺血時(shí)間；但尚未有研究比較UW 液在傳統(tǒng)低溫保存、亞常溫保存及過(guò)冷保存條件下對(duì)供體心肌結(jié)構(gòu)的影響。本研究試圖通過(guò)病理染色的方式，探究UW 液的不同保存溫度和外置時(shí)間對(duì)供體心臟結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：中華小型豬18 頭，8～17 月齡，體重26.50（25.80，27.65）kg，購(gòu)自國(guó)家心血管病中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

實(shí)驗(yàn)試劑及儀器：UW 液（ViaSpan,DuPont Pharmaceuticals，美國(guó)），全自動(dòng)病理染色機(jī)（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)），全自動(dòng)數(shù)字玻片掃描系統(tǒng)（蔡司，德國(guó)）。

麻醉方法：參照Wei 等[13]發(fā)表的文獻(xiàn)，通過(guò)肌內(nèi)注射由阿托品（0.05 mg/kg）、舒泰（3 mg/kg）、甲苯噻嗪（1.5 mg/kg）組成的混合物進(jìn)行麻醉。通過(guò)耳緣靜脈放置22 G 靜脈導(dǎo)管，給予乳酸林格液以維持血容量，必要時(shí)靜脈注射異丙酚（2 mg/kg）。

供體豬心的獲?。焊鶕?jù)現(xiàn)行的中國(guó)心臟移植供體心臟的獲取規(guī)范[14]，在豬達(dá)到良好的麻醉狀態(tài)后，由專業(yè)的心臟移植團(tuán)隊(duì)按照下述流程開(kāi)展供體豬心獲?。海?）消毒鋪巾；（2）切皮：使用電刀切皮，并根據(jù)供體狀態(tài)來(lái)補(bǔ)充血容量，必要時(shí)給予升壓藥物靜脈注射；（3）鋸胸骨：劈開(kāi)胸骨后，將胸骨牽開(kāi)器撐開(kāi)，并在牽開(kāi)器兩側(cè)各墊一塊打開(kāi)的無(wú)菌治療巾，切開(kāi)雙側(cè)胸膜；（4）阻斷：先阻斷上下腔靜脈，再阻斷升主動(dòng)脈，然后立刻行肺靜脈及下腔靜脈切開(kāi)減壓；負(fù)壓吸引溫血水，冰屑包裹心臟降溫；（5）灌注：用托馬斯液灌注，監(jiān)測(cè)并記錄灌注壓力，同時(shí)用手感知主動(dòng)脈根部和左心室，在保證充分灌注的同時(shí)避免左心室高張力，灌注至心臟完全停跳并觸摸柔軟；（6）切取供體心臟：心臟灌停后，向心包腔添加無(wú)菌冰屑以降溫；左手輕輕撩起心臟，以此離斷下腔靜脈和左右肺靜脈；游離至左心房頂及左右肺動(dòng)脈水平時(shí)，將心臟放回心包腔，用冰屑心臟包裹以降溫；再游離弓近端和上腔靜脈，分別離斷后顯露左右肺動(dòng)脈，將肺動(dòng)脈離斷后沿組織間隙游離到左心房頂水平，最后將心臟大血管完整取下；（7）供體心臟檢查：將供體心臟置于裝滿冰屑的容器，檢查心臟有無(wú)損傷、結(jié)構(gòu)異常及冠狀動(dòng)脈病變等，然后用UW 液灌注，此時(shí)也要密切關(guān)注主動(dòng)脈根部壓力情況，以保證左心室無(wú)異常充盈；（8）外科醫(yī)生更換無(wú)菌手套后，用3 000 ml 冰生理鹽水（0℃～4℃）沖洗心臟。

供體豬心在UW 液中的保存方法：在包裝袋內(nèi)注入500 ml 的UW 液，將獲取的供體豬心分別放入包裝袋中，然后整體放入設(shè)置成不同溫度（21℃、4℃、-4℃）的冰箱中。根據(jù)存放的溫度以及供體豬心的外置時(shí)間，將取下的豬心保存在9 種條件下，分別為21℃、3 h，2℃、6 h，21℃、9 h，4℃、3 h，4℃、6 h，4℃、9 h，-4℃、3 h，-4℃、6 h，-4℃、9 h，每種保存條件下保存2 個(gè)豬心。

豬心心臟組織取材：在相應(yīng)的溫度和時(shí)間下保存后，借鑒移植心臟標(biāo)準(zhǔn)化取材流程[15]，對(duì)豬心進(jìn)行組織取材：（1）心臟稱重、拍照；（2）將心臟解剖為6 個(gè)部分：左心室前壁、左心室側(cè)壁、左心室后壁、室間隔、右心室前壁、右心室后壁；（3）測(cè)量主動(dòng)脈瓣周徑、肺動(dòng)脈瓣周徑、左心室室壁厚度、右心室室壁厚度、室間隔厚度；（4）石蠟病理標(biāo)本的制備：在左心室前壁取一塊全層組織，并用10%福爾馬林保存。

病理組織切片制備：上述心肌組織經(jīng)酒精梯度脫水后，包埋于石蠟中，用輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)制作5 mm 厚的病理切片，置于載玻片上。

HE 染色及圖像分析：將恒溫?cái)偲酒瑱C(jī)溫度設(shè)置成68℃，再將載玻片在其上放置45 min，之后在全自動(dòng)機(jī)中進(jìn)行HE 染色。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用 SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（P25，P75）表示。

2 結(jié)果

18 頭中華小型豬及其心臟基本特征：本研究共納入18 頭中華小型豬，編號(hào)為P1-P18，各豬的UW 液保存條件、月齡、體重及心臟質(zhì)量見(jiàn)表1。豬心臟解剖實(shí)物圖見(jiàn)圖1。

表1 18 頭中華小型豬及其心臟基本特征

圖1 編號(hào)P13 中華小型豬心臟解剖實(shí)物圖

不同UW 液保存條件下中華小型豬心肌組織的HE 染色結(jié)果（圖2）：在21℃的UW 液中保存3 h 時(shí)，豬心心肌細(xì)胞即出現(xiàn)水腫（圖2 黑色箭頭），少量心肌細(xì)胞核溶解（即心肌細(xì)胞壞死，圖2 藍(lán)色箭頭），并伴有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2 紅色箭頭），保存6 h時(shí)出現(xiàn)部分心肌細(xì)胞壞死，保存9 h 時(shí)發(fā)生大面積心肌細(xì)胞壞死。在4℃的UW 液中保存3 h 時(shí)，豬心心肌細(xì)胞出現(xiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，保存6 h 時(shí)出現(xiàn)少量心肌纖維溶解（圖2 黃色箭頭），保存3 h 和6 h 時(shí)均未發(fā)現(xiàn)明顯的心肌細(xì)胞水腫和壞死，但保存9 h 時(shí)出現(xiàn)明顯的心肌細(xì)胞壞死。在-4℃的UW 液中保存3 h 時(shí)，豬心心肌細(xì)胞間的正常連接即被破壞，導(dǎo)致心肌細(xì)胞分離（圖2 白色箭頭），保存6 h 時(shí)出現(xiàn)明顯的心肌細(xì)胞壞死，保存9 h 時(shí)心肌壞死面積增大。

圖2 不同UW 液保存條件下中華小型豬心肌組織的HE 染色圖片（×40）

3 討論

供體心臟在移植前的保存過(guò)程中的缺血性損傷是影響移植后心臟功能和受體存活時(shí)間的重要因素，而心肌保護(hù)液的溫度以及供體心臟在保護(hù)液中的保存時(shí)間可影響缺血性損傷的程度[16]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)用3 種不同溫度的UW 液保存豬心，每種溫度下分別保存3 h、6 h、9 h，然后對(duì)豬心進(jìn)行組織取材及病理染色。HE 染色結(jié)果顯示，在3種不同溫度下，豬心在保存過(guò)程中的缺血性損傷均隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)而加重，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞水腫程度加深、心肌組織溶解和壞死面積變大。在21℃的UW 液中保存3 h 時(shí)，豬心心肌細(xì)胞即出現(xiàn)明顯的水腫，而在4℃和-4℃的UW 液中保存3 h 時(shí)，豬心心肌細(xì)胞并未出現(xiàn)水腫。這可能與21℃下心肌細(xì)胞的代謝水平較高有關(guān)，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，溫度每升高10℃，心肌細(xì)胞的代謝水平約上升為原來(lái)的兩倍[17]，心肌細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷消耗加快，導(dǎo)致細(xì)胞膜鈉鉀泵的功能無(wú)法維持，造成細(xì)胞水腫。在4℃的UW液中保存6 h 時(shí)，豬心心肌細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn)壞死，保存9 h 時(shí)壞死更加明顯。在-4℃的UW 液中保存 3 h 時(shí)，豬心心肌細(xì)胞間的距離已經(jīng)增大，說(shuō)明細(xì)胞之間的連接被破壞，這可能與低溫誘導(dǎo)的細(xì)胞膜損害以及組織內(nèi)冰晶的形成有關(guān)[18-19]，而心肌細(xì)胞之間的分離將導(dǎo)致心肌細(xì)胞無(wú)法同時(shí)興奮和收縮[20]，極大地?fù)p害心臟功能。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在3 種不同溫度的UW 液中保存3 h 后，豬心心肌組織中即出現(xiàn)少量炎癥細(xì)胞，但是炎癥細(xì)胞數(shù)量并不多，且并未隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增多，這可能與心臟離體后失去炎癥細(xì)胞的來(lái)源有關(guān)。后續(xù)研究可以將切除后的供體豬心在體外保存后，用受體豬的血來(lái)灌注供體心臟，或者將供體豬心移植到受體豬體內(nèi)，適當(dāng)時(shí)間后再取心臟組織進(jìn)行病理學(xué)研究，有助于更科學(xué)地評(píng)估不同體外保存條件對(duì)心肌炎癥細(xì)胞以及缺血/再灌注損傷的影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)臨床供體心臟的保存有一定的指導(dǎo)意義。首先，由于在不同溫度下保存的供體心臟的缺血性損傷均隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)而加重，所以在臨床工作中應(yīng)盡量縮短供體心臟的體外保存時(shí)間。其次，保存溫度低于0℃會(huì)導(dǎo)致心肌組織內(nèi)形成冰晶，進(jìn)而損害供體心臟的結(jié)構(gòu)和功能，故臨床工作中應(yīng)避免0℃以下保存供體心臟。由于保存溫度升高會(huì)加快細(xì)胞代謝速率，進(jìn)而縮短心臟可耐受的體外保存時(shí)間，故供體心臟在體外轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中應(yīng)保存于0℃以上的合適低溫范圍內(nèi)。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，體外保存時(shí)間延長(zhǎng)可加重供體心臟的缺血性損傷。21℃和-4℃的UW 液靜態(tài)保存均不利于心肌組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的維持。在4℃的UW液中靜態(tài)保存3 h 內(nèi)，不會(huì)造成豬心明顯的心肌細(xì)胞壞死，但保存超過(guò)6 h 時(shí)則會(huì)對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生明顯的缺血性損害，故臨床工作中應(yīng)盡量縮短供體心臟的體外轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間，并使之一直保存于0℃以上的合適低溫范圍內(nèi)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突