高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定畜肉中的唑類抗真菌藥物

◎ 何雯倩，韋 譽(yù)，鄔曉瑩，涂冬漫

（1.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 511442；2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東 廣州 511442；3.廣東省質(zhì)量監(jiān)督食品檢驗(yàn)站，廣東 廣州 511442）

唑類抗真菌藥物是一類用于治療真菌感染疾病的廣譜抗真菌藥，可作用于不同的真菌感染部位，對(duì)不同的真菌都具有較好的抗菌效果，而且對(duì)白色念珠菌作用尤其明顯[1-3]。我國由于畜牧業(yè)比較發(fā)達(dá)，所以此類抗真菌藥物也被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)，以提高產(chǎn)量，但同時(shí)也為終端產(chǎn)品的質(zhì)量安全帶來一定的安全隱患。有研究指出，唑類抗真菌藥物對(duì)肝臟、腎上腺和性腺都有較強(qiáng)的毒性[4-6]，而且也能對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重的損傷[7]。因此，對(duì)唑類抗真菌藥物的濫用情況進(jìn)行有效監(jiān)管，并建立相應(yīng)的高效、高通量檢測(cè)手段尤其必要。

目前，有關(guān)抗真菌藥物的分析研究主要集中在儀器分析，以色譜法[8-9]及質(zhì)譜法為主，但色譜法檢出限較高，選擇性差，對(duì)于多組分的分析，分離難度大，結(jié)果容易受雜質(zhì)影響。氣相色譜-質(zhì)譜法[10-11]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-15]則具有選擇性高、檢出限低，且能短時(shí)間分析多種化合物的優(yōu)點(diǎn)。本文使用純?nèi)軇┨崛?，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了對(duì)畜肉中唑類抗真菌藥物同時(shí)快速檢測(cè)的分析方法，該方法具有操作簡單、分析時(shí)間短、定量準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)回收率及重復(fù)性經(jīng)方法學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果符合一般樣品測(cè)定的分析要求，可為同類型的相關(guān)分析方法開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品購自線下商場(chǎng)及超市。

克霉唑、聯(lián)苯芐唑、咪康唑和益康唑（純度大于98.0%，天津阿爾塔）；甲酸、甲醇、乙腈（HPLC級(jí)，美國Thermo Fisher公司）；氨水、氯化鈉（CNW，分析純，上海安譜公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

AB4500三重四極桿質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司）；島津LC-20AD液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司）；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)（法國Merck Millipore公司）；Promax 2020搖床（德國Heidolph Brinkman公司）；3-18k高速離心機(jī)（德國Sigma公司）；Heidolph Multi Reax渦旋振蕩器（德國Heidolph公司）；KQ-800DB超聲波清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：稱取適量克霉唑、聯(lián)苯芐唑、咪康唑、益康唑標(biāo)準(zhǔn)品于具塞容量瓶中，加入少量甲醇超聲溶解，并用甲醇稀釋至刻度定容，得到質(zhì)量濃度為1 000 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：將上述儲(chǔ)備溶液用甲醇稀釋至10 mg·L-1。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：按照優(yōu)化后的前處理方式，處理樣品，用所得陰性樣品基質(zhì)提取液將混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液稀釋成2.0 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1、50.0 μg·L-1、100.0 μg·L-1和200.0 μg·L-1的基質(zhì)工作曲線。

1.4 前處理方法

稱取2.0 g經(jīng)剁碎均質(zhì)后的樣品于50 mL離心管中，加入1 g氯化鈉和1 mL去離子水，渦旋1 min，再加入12 mL乙腈，渦旋30 s后，超聲提取15 min，以8 000 r·min-1離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至25 mL具塞比色管中。重復(fù)提取一次，合并提取溶液，用乙腈定容至刻度，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液作為供試品用LC-MS/MS測(cè)定。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件

Eclipse Plus C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：5mol·L-1甲酸銨+0.1%甲酸水溶液（A）、乙腈（B）；色譜柱溫度：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。洗脫程序如表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序表

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離源（ESI）；掃描方式：正離子模式；氣簾氣：25 psi；毛細(xì)管電壓：5 000 V；離子源溫度（TEM）：550 ℃；霧化氣（GAS1）：50 psi；加熱輔助氣（GAS2）：50 psi；碰撞氣（CAD）：medium；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜及質(zhì)譜條件優(yōu)化

克霉唑、聯(lián)苯芐唑、咪康唑、益康唑4種唑類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中，均含有穩(wěn)定的芳香結(jié)構(gòu)及叔胺基團(tuán)。由于芳香結(jié)構(gòu)含有大π鍵，性質(zhì)穩(wěn)定，因此在離子化的過程中，氫離子H+會(huì)因?yàn)橥鈱涌哲壍篮碗姾勺饔昧εc叔胺中N原子的孤對(duì)電子結(jié)合，從而形成穩(wěn)定的[M+H]+分子離子峰。因此在流動(dòng)相中加入甲酸可有效增加母離子的響應(yīng)強(qiáng)度，從而獲得更高的碎片響應(yīng)，同時(shí)在流動(dòng)相加入適量甲酸銨，可增強(qiáng)色譜柱對(duì)4種唑類化合物的保留，延長出峰時(shí)間，并且改善峰形。

為優(yōu)化質(zhì)譜電壓參數(shù)，通過流動(dòng)注射的方式將1.0 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)品溶液直接注入離子源，優(yōu)化質(zhì)4種唑類化合物的去簇電壓和碰撞能量。質(zhì)譜參數(shù)見表2，4種唑類化合物提取離子流色譜圖見圖1。

表2 4種唑類化合物的MS/MS參數(shù)表

圖1 4種唑類化合物標(biāo)準(zhǔn)提取離子流色譜圖

2.2 提取溶劑的選擇

考察不同溶劑對(duì)4種唑類化合物回收率的影響情況，結(jié)果如圖2所示。0.2%氨水-乙腈對(duì)4種唑類化合物的回收率只有50%左右，加入氨水的目的是為了針對(duì)唑類化合物中的胺基基團(tuán)進(jìn)行提取，但實(shí)際回收率較低，可能是由于堿性環(huán)境下，畜肉中的脂肪或者蛋白部分被水解，從而使更多短鏈分子被提取至有機(jī)相，導(dǎo)致回收率下降。甲醇和乙腈回收率較高，但綜合考量，乙腈的回收率均在90%以上，因此最終選擇乙腈作為提取溶劑。

2.3 不同提取方式的對(duì)比

實(shí)驗(yàn)選擇了超聲、渦旋、搖床3種不同的提取方式對(duì)樣品進(jìn)行提取，提取溶劑為乙腈，詳細(xì)結(jié)果見圖3。超聲的回收率總體上要略高于其他兩種提取方式，可能是由于渦旋和搖床的提取方式在提取過程中與樣品接觸面積較小，不利于提??；超聲的高頻振動(dòng)更有利于樣品在提取溶液中分散，接觸面積更大，因此提取效率更高，回收率也更高。因此，最終選用超聲提取方式。

圖2 不同溶劑的回收率對(duì)比圖

圖3 不同提取方式的回收率對(duì)比圖

2.4 提取時(shí)間的優(yōu)化

提取時(shí)間也是影響目標(biāo)物提取效率的因素，提取時(shí)間過短，目標(biāo)物未被充分提取，而提取時(shí)間過長，目標(biāo)物可能會(huì)被分解氧化或產(chǎn)生其他副反應(yīng)，且耗時(shí)長，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)效率低下。實(shí)驗(yàn)在重復(fù)提取兩次的情況下，分別對(duì)加標(biāo)樣品單次提取5 min、10 min、15 min、20 min，結(jié)果如圖4所示。隨著提取時(shí)間的增加，4種唑類化合物的回收率升高，但15 min以后，總體回收率增加不明顯，最終選擇提取時(shí)間為15 min，重復(fù)提取兩次。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的探討

畜肉中含有大量蛋白質(zhì)和脂肪，基質(zhì)干擾嚴(yán)重，會(huì)對(duì)定量結(jié)果造成嚴(yán)重影響，因此需要對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行研究并判定是否需要校正。實(shí)驗(yàn)分別選擇豬肉和牛肉樣品，考察基質(zhì)效應(yīng)。首先使用4種唑類化合物呈陰性的豬肉和牛肉樣品，按照1.4的前處理方法處理，得到空白基質(zhì)液，并使用此基質(zhì)液配制濃度為100 μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，所得的抑制或增強(qiáng)比例即為基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，豬肉樣品中，4種唑類化合物測(cè)得值為45.6～52.1 μg·L-1，基質(zhì)效應(yīng)抑制率為47.9%～54.4%；牛肉樣品中，4種唑類化合物測(cè)得值為35.4～49.9 μg·L-1，基質(zhì)效應(yīng)抑制率為50.1%～64.6%。說明牛肉中產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)要高于豬肉，但兩種基質(zhì)對(duì)4種唑類化合物所產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)均大于20%，即基質(zhì)負(fù)效應(yīng)明顯，因此需要使用基質(zhì)曲線進(jìn)行校正。

圖4 不同提取時(shí)間的回收率對(duì)比圖

2.6 曲線方程及靈敏度數(shù)據(jù)

使 用 空 白 基 質(zhì) 液 配 制2.0 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1、50.0 μg·L-1、100.0 μg·L-1和200.0 μg·L-1的混合基質(zhì)曲線，在優(yōu)化后的儀器條件下測(cè)定響應(yīng)值，通過響應(yīng)值和對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度擬合曲線，并計(jì)算出相關(guān)系數(shù)。另外，通過低濃度的加標(biāo)，以儀器信噪比的3倍（S/N=3）和10倍（S/N=10）確定檢出限和定量限。表3結(jié)果顯示，4種唑類化合物的相關(guān)系數(shù)R2均≥0.999，檢出限為5～10 μg·kg-1，定量限為15～30 μg·kg-1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，方法靈敏度高，方程定量結(jié)果準(zhǔn)確，可滿足畜肉中的4種唑類化合物的測(cè)定要求。

表3 曲線方程參數(shù)及方法靈敏度表

2.7 回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

為進(jìn)一步驗(yàn)證方法回收率及重復(fù)性，選擇4種唑類化合物呈陰性的豬肉為樣品進(jìn)行30 μg·kg-1、60 μg·kg-1、300 μg·kg-13水平加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)6組平行樣品，計(jì)算相應(yīng)的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。具體結(jié)果如表4所示，平均回收率在88.9%～99.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.92%～8.55%，說明方法經(jīng)基質(zhì)曲線校正后，定量結(jié)果準(zhǔn)確，回收率高，且重現(xiàn)性較好，可對(duì)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。

表4 回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)據(jù)表（n=6）

2.8 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用建立的方法測(cè)定市售的10個(gè)豬肉樣品和10個(gè)牛肉樣品，結(jié)果顯示樣品中均未檢出4種唑類化合物，但仍需加強(qiáng)市場(chǎng)監(jiān)督，降低風(fēng)險(xiǎn)。

3 結(jié)論

本文建立了溶劑超聲提取結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)畜肉中4種唑類化合物的分析方法。方法操作簡單，所需試劑耗材少，且高效快速。4種唑類化合物響應(yīng)高，峰形好，在短時(shí)間內(nèi)完全出峰，整體分析時(shí)間短。使用基質(zhì)曲線進(jìn)行校正，定量結(jié)果準(zhǔn)確。加標(biāo)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，方法回收率高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小，方法整體重現(xiàn)性較好，檢出限和定量限均能滿足畜肉中唑類化合物的測(cè)定要求，可應(yīng)用于市場(chǎng)快速檢測(cè)或?qū)嶒?yàn)室日常來樣檢驗(yàn)。