河南方城產(chǎn)裕丹參中酮類(lèi)成分的周期變化規(guī)律研究

趙麗娜，王一碩，張振凌

(1.鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院，鄭州 451460；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450008)

丹參作為一味中藥，為歷代醫(yī)家所推崇，“一味丹參散，功同四物湯”，指出其在治療心血管疾病中具有重要的地位。丹參為唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge)的干燥根及根莖，其主要功效為活血化瘀，調(diào)經(jīng)止痛，清心除煩，涼血消癰[1]。裕丹參，俗名血參，是傳統(tǒng)中藥材丹參的一種，其品質(zhì)優(yōu)異，療效顯著，古時(shí)因產(chǎn)于河南南陽(yáng)裕州(今為河南南陽(yáng)方城縣)而馳名。方城縣地理位置特殊，正處于桐柏山脈與伏牛山脈、淮河流域與長(zhǎng)江流域、北亞熱帶與南暖溫帶的分界線(xiàn)上，氣候環(huán)境獨(dú)特，孕育出的裕丹參具有枝條粗壯、顏色紫紅、品質(zhì)優(yōu)、療效好等特點(diǎn)，被醫(yī)圣張仲景稱(chēng)為“丹參之首”。丹參的有效成分包括脂溶性成分(二萜醌類(lèi))和水溶性成分(酚酸類(lèi))，均具有一定的生理活性[2]。2020版《中國(guó)藥典》丹參項(xiàng)下脂溶性成分以丹參酮類(lèi)成分作為質(zhì)控指標(biāo)[1]，包括丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ，因此本文以丹參酮類(lèi)成分作為丹參脂溶性成分的代表研究其動(dòng)態(tài)積累規(guī)律，為確定裕丹參最佳采收日期和產(chǎn)地加工方法，制定裕丹參藥材種植標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器、試劑與藥材

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀(日本島津)，Agilent SB-C18(4.6×250mm)；BS210S型萬(wàn)分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；AUW120D分析天平(日本島津)；DHG—9076A型恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海屹堯科技有限公司)；KQ-500DV型超聲波清洗器(世安科技股份有限公司)；SC-1000Y高速粉碎機(jī)(上海尚層科技有限公司)。

1.2 試劑

本實(shí)驗(yàn)所采用的實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水，具體實(shí)驗(yàn)試劑信息見(jiàn)下表1。

表1 試劑信息

1.3 藥材

本實(shí)驗(yàn)所用裕丹參樣品來(lái)源于河南省南陽(yáng)市方城縣華豐中藥材有限公司裕丹參種植基地，經(jīng)過(guò)河南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)科專(zhuān)家鑒定為雙子葉植物唇形科鼠尾草屬植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根及根莖。

2 實(shí)驗(yàn)方法與供試品溶液的制備

2.1 色譜條件

本實(shí)驗(yàn)采用C18色譜柱；柱溫為20℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.02%磷酸溶液，按下表2中色譜條件的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫。

表2 色譜條件

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)定丹參酮IIA對(duì)照品0.2mg，置10mL棕色量瓶中，加甲醇制成每1mL含20μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

將丹參樣品粉末粉碎后過(guò)三號(hào)篩，精密稱(chēng)定0.3g，置具塞錐形瓶中，精密加入50mL甲醇，密閉，稱(chēng)定重量后，超聲處理(功率140W，頻率42kHz)30min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線(xiàn)性關(guān)系的考察

精密吸取上述對(duì)照品貯備溶液4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL，加入高效液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，依次進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以進(jìn)樣體積(μL)為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行回歸分析，回歸方程Y=114825X-59067，R2=0.9993。結(jié)果表明丹參酮ⅡA在4～14 μL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

表3 丹參酮IIA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備

圖1 丹參酮IIA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液10μL，于0、2、4、8、16h加入高效液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，自動(dòng)進(jìn)樣，測(cè)定丹參酮ⅡA的含量，RSD為0.92%，表示溶液在16h內(nèi)供試品溶液保持穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性

取同一批次樣品5份，按照上述樣品的制備方法的方法制備溶液，進(jìn)樣量為10μL，加入高效液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，自動(dòng)進(jìn)樣，測(cè)定丹參酮ⅡA的含量，RSD為1.02%，結(jié)果表明重復(fù)性較好。

2.7 中間精密度試驗(yàn)

取同一樣品，在不同時(shí)間，不同分析人員進(jìn)行樣品測(cè)定，進(jìn)樣量為10μL，加入高效液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，自動(dòng)進(jìn)樣，測(cè)定丹參酮ⅡA的含量，RSD為0.75%，結(jié)果表明精密度較好。

2.8 樣品測(cè)定

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μL，加入高效液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，進(jìn)行自動(dòng)進(jìn)樣，測(cè)定結(jié)果以丹參酮ⅡA對(duì)照品為參照，以其相應(yīng)的峰為S峰，計(jì)算隱丹參酮、丹參酮Ⅰ的相對(duì)保留時(shí)間，相對(duì)保留時(shí)間及校正因子見(jiàn)表4，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±5%以?xún)?nèi)。以丹參酮ⅡA的峰面積為對(duì)照，分別乘以校正因子，計(jì)算隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的含量。

表4 相對(duì)保留時(shí)間及校正因子

3 不同產(chǎn)地加工方法對(duì)丹參中酮類(lèi)成分的影響

3.1 樣品處理

參考有關(guān)文獻(xiàn)記載[3-4]，將同一批新鮮丹參藥材除去泥沙，剪掉須根和莖葉，混勻，分成等份進(jìn)行了如下處理曬干、陰干、鮮切、發(fā)汗處理。具體處理方法見(jiàn)表5。

表5 不同干燥方法

3.2 含量測(cè)定

參照“2實(shí)驗(yàn)方法”項(xiàng)下色譜條件、供試品溶液的制備及樣品測(cè)定，對(duì)不同產(chǎn)地加工方法處理的丹參各供試品溶液，按照色譜條件，測(cè)定供試藥材中丹參酮ⅡA的含量，從而根據(jù)校正因子計(jì)算出隱丹參酮、丹參酮Ⅰ的含量，再計(jì)算出丹參酮ⅡA、隱丹參酮和丹參酮Ⅰ的總量，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 不同加工方法丹參酮類(lèi)成分含量

3.3 結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丹參酮ⅡA在曬干法處理中含量偏低。在陰干、鮮切、直接發(fā)汗等無(wú)光照條件下含量較高，這是由于丹參酮ⅡA的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光容易分解。實(shí)驗(yàn)證明丹參的最適宜炮制加工工藝應(yīng)以陰干法為主，但是缺點(diǎn)也很明顯，就是所耗費(fèi)的時(shí)間較長(zhǎng)，因此本次實(shí)驗(yàn)采用低溫烘干法處理鮮丹參藥材。

4 不同生長(zhǎng)時(shí)間對(duì)丹參中酮類(lèi)成分的影響

4.1 樣品采集

本實(shí)驗(yàn)所用裕丹參樣品來(lái)源于河南省南陽(yáng)市方城縣華豐中藥材有限公司裕丹參種植基地，經(jīng)過(guò)河南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)科專(zhuān)家鑒定為雙子葉植物唇形科鼠尾草屬植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根及根莖。從丹參育苗開(kāi)始計(jì)算生長(zhǎng)時(shí)間，分別于8月齡、9月齡、10月齡、11月齡、一年、一年半、二年、二年半采集丹參藥材樣品。

4.2 樣品處理

根據(jù)“3 不同產(chǎn)地加工方法對(duì)丹參中酮類(lèi)成分的影響”優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)條件，將采集的新鮮丹參藥材分別經(jīng)低溫烘干至含水量在30%時(shí)，搶水洗后直接切厚片，低溫烘干。

4.3 含量測(cè)定

參照“2 實(shí)驗(yàn)方法”項(xiàng)下色譜條件、供試品溶液的制備及樣品測(cè)定，對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)間采集處理的丹參各供試品溶液，按照色譜條件，測(cè)定供試藥材中丹參酮ⅡA的含量，從而根據(jù)校正因子計(jì)算出隱丹參酮、丹參酮Ⅰ的含量，再計(jì)算出丹參酮ⅡA、隱丹參酮和丹參酮Ⅰ的總量，結(jié)果見(jiàn)表7，圖2。

表7 不同采收日期裕丹參中酮類(lèi)成分的含量

圖2 不同生長(zhǎng)時(shí)期裕丹參中酮類(lèi)成分含量變化趨勢(shì)

5 討論

本實(shí)驗(yàn)將丹參藥材分別采用曬干、陰干、鮮切、直接發(fā)汗進(jìn)行相應(yīng)的加工處理，通過(guò)測(cè)定丹參酮類(lèi)成分含量比較不同產(chǎn)地加工方法對(duì)丹參有效成分產(chǎn)生的影響。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)比較，丹參酮ⅡA在陰干、鮮切、直接發(fā)汗等無(wú)光照條件下含量較高，這是由于丹參酮ⅡA是丹參中主要的脂溶性有效成分，但性質(zhì)不穩(wěn)定，在高溫或光照條件下易分解[5]，丹參產(chǎn)地加工工藝應(yīng)以陰干法為主，但是缺點(diǎn)也很明顯，就是所耗費(fèi)的時(shí)間較長(zhǎng)，建議采用低溫烘干法加工丹參藥材。丹參藥材搶水洗可較好的除去表面泥土，保證藥材的潔凈度，減少有害重金屬的污染。搶水洗對(duì)丹參酮類(lèi)成分影響不大，但對(duì)水溶性成分如酚酸類(lèi)有一定的降低作用。有些文獻(xiàn)記載，加工丹參時(shí)，除去泥土，但忌用水洗。中國(guó)藥典中也沒(méi)有規(guī)定泥土應(yīng)如何除去。根據(jù)產(chǎn)地加工多年的經(jīng)驗(yàn)主要采取干燥后抖掉泥土，也有將藥材集中堆放，采用淋水除去表面泥土，但這種方法顯然很影響質(zhì)量，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致發(fā)霉變質(zhì)。因此，關(guān)于丹參的產(chǎn)地加工、除去泥土的方法等還有待進(jìn)一步考察研究，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)采用搶水法除去泥沙后，切片，烘干，并采用低溫烘干機(jī)，控制溫度在30～40℃。使用烘干機(jī)不僅可以快速使藥材烘干，而且溫度比較可控且均一，可有效控制藥材的質(zhì)量，故而避免了一般烘房控溫時(shí)因受人為因素影響較多而引起藥材質(zhì)量的變化。實(shí)驗(yàn)中所使用的丹參藥材是河南省南陽(yáng)市栽培的藥材，已經(jīng)過(guò)多次的良種選育，質(zhì)量?jī)?yōu)異，是目前市場(chǎng)上銷(xiāo)售的主要丹參品種之一。根據(jù)《中國(guó)藥典》(2020版)規(guī)定，丹參按干燥品計(jì)算，含丹參酮ⅡA、隱丹參酮和丹參酮Ⅰ的總量不得少于0.25%。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明裕丹參中酮類(lèi)成分的總量在1%左右，是藥典含量的4倍，也進(jìn)一步證明了河南產(chǎn)裕丹參藥材的品質(zhì)。通過(guò)對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期裕丹參中酮類(lèi)成分含量的分析，結(jié)果表明裕丹參中丹參酮類(lèi)成分在不同生長(zhǎng)時(shí)期，含量變化較大，兩者均在生長(zhǎng)一年半后，每年11月份達(dá)含量的最高峰。因此，在確定丹參的采收期時(shí)必須綜合考慮，在丹參規(guī)?；a(chǎn)地加工及生產(chǎn)過(guò)程中，尤其在試行趁鮮切制加工過(guò)程中，必須進(jìn)行規(guī)范操作，制定嚴(yán)格的GAP管理制度，才能保證藥材的質(zhì)量和療效。丹參中丹參酮ⅡA和隱丹參酮的含量隨著生長(zhǎng)時(shí)間的推移，波動(dòng)性較大，但兩種成分變化趨勢(shì)十分相似，這可能與植物的生長(zhǎng)周期和這兩種物質(zhì)的合成途徑有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。近幾年來(lái)學(xué)者對(duì)丹參中丹酚酸類(lèi)成分所具有的藥理作用正在進(jìn)一步研究中[6-7]其可能對(duì)肝腎具有保護(hù)作用等。所以，丹參中酚酸類(lèi)成分的藥理活性研究對(duì)于增進(jìn)人體健康、防治疾病等方面至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)后續(xù)還應(yīng)進(jìn)一步充分研究丹參中酚酸類(lèi)化學(xué)物質(zhì)的變化規(guī)律，以期對(duì)丹參藥材不同產(chǎn)地加工方法與炮制一體化工藝研究[8-10]提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。