基于NF-κB/MAPK信號通路miR-125a-5p誘導(dǎo)乳腺癌MCF7細(xì)胞自噬的作用機(jī)制研究*

郭建美，楊穎博，李 杰

(1.河北省保定市第一中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 071000；2.河北省保定市第一中心醫(yī)院全科醫(yī)療一科 071000；3.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院乳腺外科，石家莊 050000)

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率及致死率均較高。近年來，隨著生活節(jié)奏加快及生活壓力提高，發(fā)病率逐年升高，且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢，給我國女性健康造成嚴(yán)重影響[1-2]。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞自噬關(guān)系密切，自噬與凋亡共同調(diào)控癌細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)。近年來，有研究表明，自噬在乳腺癌進(jìn)展過程中具有雙重調(diào)控作用，早期乳腺癌細(xì)胞自噬可抑制腫瘤增殖、侵襲或轉(zhuǎn)移[3]。因此，在乳腺癌發(fā)病早期尋找有效的手段誘導(dǎo)細(xì)胞自噬有助于抑制腫瘤進(jìn)展。近年來，微小RNA(micro RNA，miRNA)參與調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展已成為研究熱點(diǎn)[4]。有研究表明，miR-125a-5p在乳腺癌MCF7細(xì)胞系中呈低表達(dá)狀態(tài)，且參與了調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡過程，但關(guān)于其對細(xì)胞自噬的調(diào)控作用及相關(guān)作用機(jī)制研究較少見[5]。本研究以人乳腺癌MCF7細(xì)胞作為研究對象，建立了miR-125a-5p過表達(dá)細(xì)胞系，擬觀察miR-125a-5p對乳腺癌細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，旨在為乳腺癌的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑與儀器

hsa-miR125a-5p模擬物(hsa-miR125a-5p mimics)、對照模擬物(NC-mimics)均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；Lipofectamine 2000試劑盒由美國Invitrogen公司生產(chǎn)；單丹磺酰二胺(monodansyl cadaverine，MDC)、Hoechst均由美國Sigma公司生產(chǎn)，兔抗人自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ(microtubule associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3Ⅱ)多抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的免疫球蛋白G抗體由美國Abcam公司生產(chǎn)，兔抗人核因子-κB (nuclear factor kappa B，NF-κB)p65、磷酸化(phosphorylated，p)-NF-κB p65單抗、鼠抗人有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)p38、p-MAPK p38多抗、鼠抗人細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)、p-ERK1/2多抗均由美國Thermo Fisher公司生產(chǎn)，DMi8型倒置熒光顯微鏡由德國徠卡公司生產(chǎn)，7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀由美國ABI公司生產(chǎn)，PowerPro3AMP電泳儀由英國Cleaver公司生產(chǎn)。

1.1.2細(xì)胞株

人乳腺癌MCF7細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的杜氏改良Eagle培養(yǎng)基培養(yǎng)液，于37 ℃、5%二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對數(shù)期生長的乳腺癌MCF7細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后應(yīng)用重新接種至6孔板，細(xì)胞密度為1×104個(gè)/孔，分為miR-125a-5p組、miR-NC組和空白組。miR-125a-5p組、miR-NC組按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書步驟，將hsa-miR125a-5p mimics、NC-mimics分別轉(zhuǎn)染入miR-125a-5p組和miR-NC組，空白組不給予處理。

1.2.2轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證

收集轉(zhuǎn)染48 h后miR-125a-5p組和miR-NC組細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，測定光密度值260/280為1.8～2.0，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性后應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄法獲得互補(bǔ)鏈cDNA，并以之為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)，按SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒說明書設(shè)定反應(yīng)體系；反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)，以U6為內(nèi)參對照、2-ΔΔCT計(jì)算miR-125a-5p基因相對表達(dá)水平，確認(rèn)轉(zhuǎn)染效率。引物序列：miR-125a-5p，正向：5′-ACT GAT GAT GCC CAT GCC TG-3′，反向：5′-CTG CTG ATG CTC CTG AAG TG-3′；U6，正向：5′-CTA GCT GAT GCT GAT GCT ACC-3′，反向：5′-CCT GAT GCT GAT CCT GAT CGT-3′。

1.2.3乳腺癌MCF7細(xì)胞自噬檢測

1.2.3.1MDC及Hoechst雙染色觀察細(xì)胞自噬

將無菌蓋玻片放置于6孔板內(nèi)，以2×104個(gè)/mL接種轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，爬片培養(yǎng)24 h后傾去培養(yǎng)液，甲醇固定15 min，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌2次，加入0.05 mmol/L MDC染液孵育60 min；孵育至45 min時(shí)加入10 μg/mL的Hoechst33342染液5 μL，繼續(xù)同條件孵育60 min；用PBS洗滌2次，封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察和拍攝，以核周區(qū)域綠色自噬小點(diǎn)大于或等于8個(gè)計(jì)為陽性細(xì)胞，隨機(jī)選取10個(gè)視野。陽性細(xì)胞率=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.3.2Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ表達(dá)

取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞5×106個(gè)，用PBS洗滌，1 500 r/min(離心半徑12 cm)離心8 min，取沉淀細(xì)胞加入0.3 μL細(xì)胞裂解液，冰上孵育60 min，然后于4 ℃預(yù)冷離心機(jī)上以12 000 r/min(離心半徑10 cm)離心15 min，取上清液進(jìn)行蛋白定量；取待測蛋白樣品與Maker同時(shí)進(jìn)樣，80～120 V電壓下電泳約20 min，然后100 V電壓下轉(zhuǎn)膜90 min，將蛋白移至硝酸纖維素膜上，然后用5%脫脂奶粉封閉2 h，然后加入按比例稀釋的一抗(1∶1 000)，于4 ℃搖床孵育過夜，洗膜后加入按比例稀釋的二抗(1∶8 000)，常溫孵育1.5 h，再次洗滌后進(jìn)行曝光、顯影；以Beclin-1、LC3Ⅱ條帶灰度值與內(nèi)參β-actin比值代表蛋白相對表達(dá)水平。

1.2.4NF-κB/MAPK信號通路相關(guān)基因表達(dá)檢測

收集轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞，采用RT-qPCR檢測NF-κB/MAPK信號通路相關(guān)基因表達(dá)情況，包括NF-κB p65、ERK1/2、MAPK p38等，檢測方法與1.4項(xiàng)相同，以β-actin為內(nèi)參對照、2-ΔΔCT計(jì)算基因相對表達(dá)水平。引物序列：NF-κB p65，正向:5′-TCA TGC ATG TCG TAG TCG-3′，反向:5′-ATG CGT GAT GCT GAT GCT-3′；ERK1/2，正向:5′-TAG CTG ATG CGT AGT GCT AC-3′，反向:5′-CCT GTG ATG CTG ATG CCG TA-3′；MAPK p38，正向:5′-TAG CTA CGT GAT GCT GTG A-3′，反向:5′-CTA GTG CTG AAC TGG TCC T-3′；β-actin，正向:5′-CAT GAT GCA TGC TGA TGC TA-3′，反向:5′-AAT GCT GTA GCT ACT GAT CG-3′。

1.2.5NF-κB/MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測

收集轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞，采用Western blot法檢測NF-κB/MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況，包括p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-ERK1/2、ERK1/2、p-MAPK p38、MAPK p38等，檢測方法與1.2.4項(xiàng)相同，蛋白相對表達(dá)水平用待測蛋白條帶灰度值與β-actin灰度值比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 miR-125a-5p基因相對表達(dá)水平

空白組、miR-NC組、miR-125a-5p組細(xì)胞miR-125a-5p基因相對表達(dá)水平分別為0.44±0.08、0.42±0.07、1.27±0.16，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=95.650，P<0.05)；miR-125a-5p組miR-125a-5p基因相對表達(dá)水平高于空白組和miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.375、10.883，P<0.05)。

2.2 細(xì)胞自噬情況

空白組、miR-NC組、miR-125a-5p組細(xì)胞陽性率分別為(2.10±0.52)%、(2.30±0.47)%、(26.40±7.14)%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=56.893，P<0.05)；miR-125a-5p組細(xì)胞陽性率高于空白組和miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.590、7.531，P<0.05)；空白組細(xì)胞陽性率與miR-NC組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.638，P=0.541)，見圖1。

A：空白組；B：miR-NC組；C：miR-125a-5p組。圖1 各組細(xì)胞自噬情況比較(400×)

2.3 自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3組Beclin1、LC3Ⅱ蛋白相對表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；miR-125a-5p組Beclin1、LC3Ⅱ蛋白相對表達(dá)水平高于空白組和miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白組Beclin1、LC3Ⅱ蛋白相對表達(dá)水平與miR-NC組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1、圖2。

表1 各組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較

A：空白組；B：miR-NC組；C：miR-125a-5p組。圖2 Western blot法檢測各組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2.4 NF-κB/MAPK信號通路相關(guān)基因表達(dá)情況

3組NF-κB p65、ERK1/2、MAPK p38 mRNA相對表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組細(xì)胞NF-κB/MAPK信號通路相關(guān)基因的相對表達(dá)水平比較

2.5 NF-κB/MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3組p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2、p-MAPK p38/MAPK p38比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；miR-125a-5p組p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2、p-MAPK p38/MAPK p38均明顯高于空白組和miR-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白組p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2、p-MAPK p38/MAPK p38與miR-NC組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3、圖3。

表3 各組細(xì)胞NF-κB/MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較

續(xù)表3 各組細(xì)胞NF-κB/MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較

A：空白組；B：miR-NC組；C：miR-125a-5p組。圖3 Western blot法檢測各組細(xì)胞NF-κB/MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較

3 討 論

自噬是真核細(xì)胞自我保護(hù)的一種機(jī)制，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、物質(zhì)循環(huán)再利用等方面具有重要作用[6-7]。目前，自噬已成為研究腫瘤發(fā)生機(jī)制、抑制腫瘤增殖及化療耐藥的熱點(diǎn)。有研究表明，多種抗乳腺癌藥物可誘發(fā)細(xì)胞自噬，且自噬誘導(dǎo)劑可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡，且多種自噬相關(guān)蛋白或因子在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[8]。自噬雖然存在促進(jìn)和抑制腫瘤的雙重作用，但在乳腺癌的治療中，由于人表皮生長因子受體-2抑制劑的應(yīng)用而促進(jìn)自噬的發(fā)生，進(jìn)而增加細(xì)胞死亡率[9]。尋找有效促進(jìn)乳腺癌發(fā)展早期細(xì)胞自噬的靶點(diǎn)對乳腺癌的治療具有重要臨床意義。

miR-125a-5p屬于miR-125家族重要成員，定位于染色體19q13，參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。miR-125a-5p是miR-125a的成熟體，存在雙重生物學(xué)功能[10]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，miR-125a-5p在人肺癌A549細(xì)胞中低表達(dá)，有助于逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對順鉑的耐藥性[11]。另有研究表明，miR-125a-5p在雌激素受體陽性乳腺癌患者中低表達(dá)，過表達(dá)后對激素治療的抵抗作用減弱，敏感性增強(qiáng)[12]；但鮮見文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于其對乳腺癌細(xì)胞自噬的影響。本研究采用慢病毒轉(zhuǎn)染法促進(jìn)乳腺癌MCF7細(xì)胞中miR-125a-5p過表達(dá)，轉(zhuǎn)染后經(jīng)MDC及Hoechst雙染顯示，細(xì)胞陽性率高于空白組和miR-NC組，且過表達(dá)細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3Ⅱ蛋白相對表達(dá)水平明顯升高，提示過表達(dá)miR-125a-5p基因可誘導(dǎo)乳腺癌MCF7細(xì)胞發(fā)生自噬，分析其原因，可能是miR-125a-5p通過與下游某靶基因結(jié)合，從而激活或抑制某調(diào)控通路，最終導(dǎo)致該通路下游效應(yīng)分子Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)升高，促進(jìn)自噬的發(fā)生[13]。

此外，本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后miR-125a-5p組NF-κB/MAPK信號通路蛋白比值——p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2、p-MAPK p38/MAPK p38均高于空白組和miR-NC組，提示過表達(dá)miR-125a-5p基因可能通過激活NF-κB/MAPK信號通路相關(guān)蛋白磷酸化水平而促進(jìn)乳腺癌MCF7細(xì)胞自噬。MAPK屬于胞外刺激傳導(dǎo)蛋白激酶，可通過調(diào)節(jié)分子亞基磷酸化水平而激活ERK磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步激活核內(nèi)NF-κB，從而調(diào)控下游相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[14-15]。尹昭懿等[16]研究顯示，自噬抑制劑3-甲基腺苷可通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路相關(guān)蛋白MAPK p38、ERK1/2的磷酸化而促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞自噬，與本研究結(jié)果相似。LEONARDI等[17]研究表明，MAPK及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶均參與了調(diào)控乳腺癌細(xì)胞自噬過程。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-125a-5p后乳腺癌MCF7細(xì)胞自噬作用增強(qiáng)，其可能機(jī)制為miR-125a-5p表達(dá)上調(diào)后使NF-κB/MAPK信號通路激活，該通路中相關(guān)蛋白磷酸化隨之增強(qiáng)，從而介導(dǎo)癌細(xì)胞自噬增強(qiáng)。

綜上所述，過表達(dá)miR-125a-5p基因可誘導(dǎo)乳腺癌MCF7細(xì)胞發(fā)生自噬，可能與促進(jìn)NF-κB/MAPK信號通路相關(guān)蛋白磷酸化水平有關(guān)，為乳腺癌的臨床治療提供了新的思路；但miR-125a-5p基因能否通過其他通路誘導(dǎo)乳腺癌MCF7細(xì)胞發(fā)生自噬仍有待進(jìn)一步研究。