植物多糖結(jié)構(gòu)解析方法研究進展

景永帥，馬云鳳，李明松，楊金鑫，張瑞娟，張丹參，鄭玉光 ，吳蘭芳

（1.河北科技大學化學與制藥工程學院，河北石家莊 050018；2.河北中醫(yī)學院藥學院，河北石家莊 050200）

多糖（Polysaccharide）是由10個以上的單糖分子通過脫水形成糖苷鍵連接而成的高分子聚合物[1]。大量研究表明植物多糖具有多種生物活性，如調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、降血糖、抗氧化、調(diào)節(jié)腸道菌群等[2-3]。由于多糖來源廣泛、生物活性強、安全性高、毒副作用小等特點，已成為當前食品、保健品、醫(yī)藥等領域的研究熱點。

多糖豐富的生物活性與其復雜的結(jié)構(gòu)密不可分。多糖結(jié)構(gòu)分為一級、二級、三級和四級結(jié)構(gòu)，一級結(jié)構(gòu)包含分子量大小及分布、單糖組成及摩爾比、糖苷鍵連接方式、重復結(jié)構(gòu)單元和分支度等；二級、三級和四級結(jié)構(gòu)統(tǒng)稱為高級結(jié)構(gòu)，主要是多糖的構(gòu)象[4]。如此多變性的多糖結(jié)構(gòu)增加了其研究難度，并且目前多糖的結(jié)構(gòu)解析仍處于探索階段，存在諸多不足，如多糖本身分子量大、不具備紫外吸收能力、提純后直接檢測較為困難、缺乏用于定性定量分析的多糖對照品、結(jié)構(gòu)鑒定重復性差、檢測手段達不到自動化、標準化和微量化等[5-7]，這大大制約了多糖類產(chǎn)品的研發(fā)和應用。因此，亟需建立和完善多糖的結(jié)構(gòu)分析方法體系[8]。該文基于近年來植物多糖結(jié)構(gòu)解析方法的相關研究進展，對植物多糖總糖含量、單糖組成、糖苷鍵類型、分子量大小及其分布、高級結(jié)構(gòu)等方面的問題進行闡述和歸納，列舉了不同的測定方法，分析了常用方法的優(yōu)勢和弊端，并且對一些結(jié)構(gòu)分析的新興技術進行分析對比，以期為多糖的綜合利用和深入研究提供多元的思路和方法。植物多糖結(jié)構(gòu)解析常用方法如圖1所示。

圖1 植物多糖結(jié)構(gòu)解析常用方法Fig.1 Common methods for structure analysis of phytogenic polysaccharides

1 植物多糖初級結(jié)構(gòu)解析方法

1.1 植物多糖中總糖含量的測定

植物多糖總糖含量的測定方法有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色法、地衣酚-鹽酸法和滴定法等，其中，滴定法又包括斐林滴定法和碘量法等。植物多糖總糖含量測定方法的原理及優(yōu)缺點比較如表1所示。多糖的總糖含量與多糖純度相關，是多糖質(zhì)量控制的基本問題。張妍等[12]研究比較了苯酚-硫酸和蒽酮-硫酸法對麥冬多糖總糖含量測定的影響，發(fā)現(xiàn)兩種方法均具備操作簡單、快速、準確和條件易于控制等優(yōu)點，但是苯酚-硫酸法在測定時線性關系、精密度、重復性和加樣回收率等指標均優(yōu)于蒽酮-硫酸法，因此，苯酚-硫酸法更加適用于麥冬多糖含量的測定。張小貝等[13]采用DNS比色法測得徐菜薯1號、鄂菜薯1號、莆薯53三種菜用甘薯葉片中多糖總糖分別為20.68、22.17、22.72 mg/g。該法具有測定值穩(wěn)定，顯色反應后吸光值穩(wěn)定等優(yōu)點，還能高效準確的測定還原糖和多糖含量。陳立江等[14]采用間接碘量法和苯酚-硫酸法分別測定同一批樣品南瓜多糖的含量，其中，間接碘量法測定南瓜多糖的總糖含量平均值為53.14%，苯酚-硫酸法測定南瓜多糖的總糖含量平均值為52.86%，同時發(fā)現(xiàn)間接碘量法不僅能測出總糖含量，還能用于單糖含量的測定。在《中國藥典》2020年版中，玉竹、霍山石斛、金櫻子、枸杞、鐵皮石斛等的多糖含量均采用苯酚-硫酸法測定，百合、靈芝、昆布、海藻、黃精等的多糖含量采用蒽酮-硫酸法測定，由此可知，苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法是目前學者較為認可的多糖含量測定方法[15]。

表1 植物多糖總糖含量測定方法的原理及優(yōu)缺點比較Table 1 Principles, advantages and disadvantages of determination methods of total sugar content of phytogenic polysaccharides

1.2 植物多糖的單糖組成及比例的測定

植物多糖的單糖組成分析一般先進行酸水解，使多糖的糖苷鍵完全斷裂，水解后有些需要經(jīng)過中和、過濾、衍生化等處理，再利用化學、儀器分析技術進行測定。多糖中單糖組成的測定方法有氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）、高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）、紙色譜法（Paper Chromatography，PC）、薄層色譜法（Thin-Layer Chromatography，TLC）、高效毛細管電泳法（High Performance Capillary Electrophoresis，HPCE）等。植物多糖單糖組成的測定方法、優(yōu)缺點及應用見表2。進行測定后與標準圖譜對比分析，能夠同時分離和檢測樣品中存在的化合物，也顯示出了化合物的色譜模式和樣品的化學特性，靈敏度好，選擇性好，已被廣泛應用于多糖的真?zhèn)舞b別、質(zhì)量評價、保證植物及其相關產(chǎn)品的一致性和穩(wěn)定性等方面。

表2 植物多糖單糖組成的測定方法Table 2 Determination method of monosaccharide composition of phytogenic polysaccharides

1.3 植物多糖分子量大小及分布的測定

植物多糖分子量是研究多糖結(jié)構(gòu)特征的基礎，也是質(zhì)量控制的重要指標之一。不同來源的多糖分子量分布范圍不同，常用的測定方法有凝膠滲透色譜法（Gel Permeation Chromatography，GPC）、高效凝膠滲透色譜法（High Performance Gel Permeation Chromatography，HPGPC）、動靜態(tài)光散射儀、黏度法等，其分子量大小常用重均分子量、數(shù)均分子量和粘均分子量等表示。

1.3.1 凝膠滲透色譜法 GPC是根據(jù)在凝膠柱上不同相對分子質(zhì)量的多糖與洗脫量成一定關系的特性測定相對分子質(zhì)量的方法。該法具有操作簡單便捷、準確等優(yōu)點，已廣泛應用于實驗室中多糖樣品的相對分子質(zhì)量測定[28]。ZHAO等[29]研究了來自粳稻的三種均一多糖SJP1-1、SJP2-1和SJP3-1，結(jié)果顯示，它們的相對平均分子量分別為1.87×105、1.04×105和1.36×104Da。王巧娥等[30]對10批北京產(chǎn)地和10個不同產(chǎn)地的庫拉索蘆薈凝膠多糖進行GPC分析，根據(jù)得到的GPC圖譜，確定共有峰并導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”，建立了庫拉索蘆薈凝膠多糖的GPC指紋圖譜，并進行市售蘆薈產(chǎn)品的質(zhì)量評價以及常見摻假物檢測，發(fā)現(xiàn)庫拉索蘆薈凝膠產(chǎn)品同一產(chǎn)地的批間一致性和不同產(chǎn)地的產(chǎn)地間一致性均較好，市售的3種蘆薈產(chǎn)品均含有蘆薈凝膠多糖，但制作工藝不同，并有效鑒別出了β-環(huán)糊精、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖4種常見摻假物。表明該方法可以用于不同批次、不同產(chǎn)地的庫拉索蘆薈凝膠制品的內(nèi)在質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別。由此可知，建立GPC多糖指紋圖譜，操作簡單，且重復性良好，為辨別產(chǎn)品的真?zhèn)魏推焚|(zhì)評價提供了參考方法。

1.3.2 高效凝膠滲透色譜法 HPGPC是GPC和HPLC結(jié)合的產(chǎn)物，根據(jù)在凝膠柱上不同相對分子質(zhì)量的多糖與洗脫保留時間成一定關系的特性，先用各種已知相對分子質(zhì)量的多糖制成標準曲線，然后由樣品的保留時間從曲線中求得相對分子質(zhì)量。和GPC相比，HPGPC分析時間更短，操作更加方便，重復性更好，結(jié)果可信度更高，但對儀器設備要求也就更高。鄧樑鈞等[31]對短葶山麥冬多糖相對分子質(zhì)量分布及多糖含量、方法的準確性、精密度、穩(wěn)定性和專屬性等進行了研究，發(fā)現(xiàn)該方法簡單、快速、準確、重現(xiàn)性好、靈敏度較高且具有一定的專屬性，可作為短葶山麥冬多糖質(zhì)量控制的快速檢測方法。但是當以水做流動相測定多糖分子量時，糖鏈過度伸展，易造成吸附，使分子量檢測值過大[32]，因此閆光玲等[33]以NaNO3溶液為流動相測定金銀花多糖分子量，發(fā)現(xiàn)金銀花多糖組分LTP1、LTP4的圖譜峰型較寬，表明多糖組分純度不夠，需進一步純化，該實驗為金銀花多糖的深入研究奠定了基礎。XU等[34]以不同分子量的葡聚糖作為對照品制作標準曲線測定鐵皮石斛多糖相對分子量，將10批鐵皮石斛多糖提取物溶解后直接進樣，建立HPGPC特征指紋圖譜，結(jié)果表明10批樣品圖譜相似，具有同一主要特征峰，同時10批同屬其他樣品，圖譜差別巨大，不具有主要特征峰，可用于鐵皮石斛的鑒別和質(zhì)量控制。由此可見，HPGPC指紋圖譜是一種高效、穩(wěn)定、方便的多糖指紋圖譜的方法，可推廣到其他多糖類藥物的指紋圖譜中，在多糖指紋圖譜的構(gòu)建中具有較大潛力。

1.3.3 其他方法 除了以上常用的分子量測定方法，還有黏度法、超離心法、光散射法、滲透壓法等。黏度法是由于高聚物的相對分子質(zhì)量與特性黏度之間存在一定關系，即Mark-Houwink關系式。該法操作時將高聚物溶于某溶劑中，使用烏氏黏度計測定特性黏度值，再根據(jù)公式即可獲得平均相對分子質(zhì)量[35]。目前，分子量的測定方法均存在一定的不足，如：GPC法流速比較慢，而且每次緩沖液及流速均需一致，樣品黏度不宜太高，樣品需要過濾不能含有顆粒，否則可能會堵塞等；HPGPC法中對照品與樣品多糖結(jié)構(gòu)之間的差異，凝膠柱對多糖等大分子可能產(chǎn)生的吸附、擴散作用，多糖的濃度、黏度、測試的溫度等均會引起誤差；黏度法精準度差等[36]。而聯(lián)用技術不需用對照品作對照即可測定，是目前測定多糖相對分子質(zhì)量及分布較理想的方法之一。HPLC-靜態(tài)光散射技術可以依據(jù)高分子溶液光散射性質(zhì)與分子質(zhì)量、尺寸及濃度等相關特性，通過計算獲取絕對分子質(zhì)量、分子質(zhì)量分布、回轉(zhuǎn)半徑及構(gòu)象等多種結(jié)構(gòu)信息[37]。凝膠滲透色譜-多角度激光散射是用于測定聚合物、多糖、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子絕對分子質(zhì)量的新技術，無需標準物質(zhì)校正，可同時獲得樣品分子質(zhì)量分布和樣品構(gòu)象信息。胡衛(wèi)珍等[38]采用凝膠滲透色譜-多角度激光散射聯(lián)用技術研究鐵皮石斛多糖的分子量及其分布，并對不同種源間多糖分子質(zhì)量及其分布進行了分析比較，發(fā)現(xiàn)不同種源的鐵皮石斛多糖分子質(zhì)量及分布有所差異。結(jié)果表明，該法可為鐵皮石斛種源優(yōu)選、質(zhì)量評價提供一定的參考。蒸發(fā)光散射檢測器是一種通用型質(zhì)量分析檢測器，具有穩(wěn)定性好、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，流動相可以進行梯度洗脫，尤其適用于復雜多組分的分析[39]。張鑫等[40]通過高效凝膠色譜法與蒸發(fā)光散射檢測器聯(lián)用的分析方法建立的枸杞多糖分子量分布特征圖譜穩(wěn)定可靠，可以相對準確地表征枸杞多糖的分子量分布信息。

1.4 植物多糖的糖苷鍵類型及連接方式的測定

糖苷鍵是一種特定類型的化學鍵，連接糖苷分子中的苷元與糖基或糖基與糖基。測定糖苷鍵類型的方法主要有紅外光譜法（Infrared Spectroscopy，IR）、核磁共振波譜法（Nuclear Magnetic Resonnce Spectrometry，NMR）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）等儀器分析法，結(jié)合化學分析法還可以測定糖苷鍵連接位點、連接方式、糖苷的糖環(huán)形式以及不同糖苷鍵的構(gòu)成比例。多糖糖苷鍵的測定方法與其解決的問題如表3所示。

表3 植物多糖糖苷鍵的常用測定方法Table 3 Common determination methods of glycosidic bonds of phytogenic polysaccharides

1.4.1 紅外光譜法 紅外光譜是由分子的振動-轉(zhuǎn)動能級躍遷產(chǎn)生的，多糖中不同類型的糖苷鍵，在紅外光譜圖上的特征峰位置不同，因此，可以使用IR識別多糖中的各種官能團并確定多糖中各種單糖的糖苷鍵類型及糖構(gòu)型。JIA等[41]采用溴化鉀壓片法對玉米須多糖（CSP）進行傅里葉變換紅外光譜測定，圖譜顯示，在3400 cm-1處的寬帶對應于羥基的O-H伸縮振動峰，在2930 cm-1處的峰值是CH2基團的C-H伸縮振動的特征。在約1600、1410 cm-1處的譜帶分別對應于酯基或羧基中C=O和CO-的伸縮振動，這表明它們都含有糖醛酸，組分CSP20在798.4 cm-1處有峰，可能是由于α-吡喃糖的存在而產(chǎn)生的。ABUDUWAILI等[42]采用紅外光譜法對小果白刺果多糖進行結(jié)構(gòu)測定，圖譜顯示吸收帶大約在3400、2920 cm-1處為O-H和C-H鍵的伸縮振動，在1750 cm-1附近出現(xiàn)一個峰表明存在糖醛酸，此外，小果白刺果多糖組分NSP-1、NSP-3在870、900 cm-1的吸收峰表明它們分別存在α-吡喃糖、β-吡喃糖。由此可知，3200～2800、1400～1200 cm-1是初步判斷該化合物是不是糖類化合物的關鍵峰，960～730 cm-1為多糖的特征吸收峰，是鑒定多糖糖苷鍵的關鍵峰。

1.4.2 核磁共振波譜法 核磁共振波譜是由于處于強磁場的原子核吸收射頻輻射產(chǎn)生的，它是對各種有機、無機物成分、結(jié)構(gòu)進行定性分析的強有力工具之一。該法不破壞多糖樣品，能準確反映出多糖的真實結(jié)構(gòu)，且能對多糖進行回收，具有高度的重現(xiàn)性和特征性，可用來表征多糖結(jié)構(gòu)中糖苷鍵的類型。NMR的特點及在多糖結(jié)構(gòu)研究中的應用如表4所示。在1D-NMR中，使用較多的是1H和13C-NMR。在1H-NMR中，多糖的異頭氫出現(xiàn)在4.3～6.0 ppm之間，其中，4.3～4.8 ppm為β構(gòu)型，而5.0 ppm以上為α構(gòu)型。對于13C-NMR，95～105 ppm為異頭碳信號，其中，β構(gòu)型異頭碳會出現(xiàn)在101 ppm以上，而α構(gòu)型出現(xiàn)在95～103 ppm之間。研究發(fā)現(xiàn)竹蓀多糖的異頭氫信號大于5.0 ppm，異頭碳信號在91.8～100.0 ppm之間，為α構(gòu)型[43]，霍山石斛多糖的異頭氫信號在4.45～4.89 ppm之間，異頭碳信號在99.2～102.6 ppm之間，為β構(gòu)型[44]。

表4 NMR的特點及在多糖結(jié)構(gòu)研究中的應用Table 4 Characteristics of NMR and its application in polysaccharide structure study

多糖中相同原子的化學位移差別不大，尤其是C2-C5和H2-H5的信號集中區(qū)，在1D-NMR中會有嚴重的信號重疊，因此，需要借助2D-NMR技術對難以辨認的信號進行歸屬，獲取更多多糖分子的結(jié)構(gòu)信息。2D-NMR信息是不同糖殘基中C和H化學位移歸屬和糖連接順序推斷的主要依據(jù)，常用的2DNMR有H-H化學位移相關譜（H-H COSY，Heteronuclear，Heteronuclear-Correlation Spectroscopy）、總相關能譜法（TOCSY，Total Correlation Spectroscopy）、二維核奧弗豪澤增強譜（NOESY，Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy）等同核化學位移相關技術，以及異核多量子關系（HMQC，Heteronuclear Multiple Quantum Coherence）、異核單量子相干（HSQC，Heteronuclear Single Quantum Coherence）、異核多鍵相關（HMBC，Heteronuclear Multiple Bond Coherence）等異核化學位移相關技術[52]。XIA等[46]采用1D-NMR和2D-NMR技術測定麻黃莖多糖結(jié)構(gòu)，獲得1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、HSQC以及HMBC圖譜及相關數(shù)據(jù)，提出了麻黃莖多糖的初步結(jié)構(gòu)。然而，NMR分析仍存在一定的局限性，如測試溫度和內(nèi)標不統(tǒng)一，NMR數(shù)據(jù)需要甲基化和其他結(jié)果的支持，以及不能單獨完整分析出具有復雜結(jié)構(gòu)或高粘度的多糖的結(jié)構(gòu)。因此，需要探索和開發(fā)具有更好分辨力和靈敏性的NMR技術，使得其能更大程度的闡明大分子物質(zhì)結(jié)構(gòu)。

1.4.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法 GC-MS法可鑒定多糖糖苷鍵結(jié)構(gòu)，一般先通過碘甲烷甲基化多糖的游離羥基，之后水解、還原、乙?；谆a(chǎn)物，使其衍生為部分甲基化的糖醛酸乙酸酯，之后再通過GCMS分離鑒定。GC-MS因具有GC的高分辨率和MS的高靈敏度，此法快速、高效，廣泛應用于多糖的分離和鑒定。鄭恒光等[53]采用GC-MS分析杏鮑菇菇頭多糖的糖苷鍵連接方式，研究發(fā)現(xiàn)其主要連接方式為1, 3-糖苷鍵和1, 6-糖苷鍵。CHOUANA等[54]采用GC-MS分析黃芪多糖，結(jié)果表明其是由β-（1,4）-D-甘露吡喃糖基殘基的骨架組成，并且在O-6位被單個α-半乳糖吡喃糖殘基取代。HUANG等[55]采用1H NMR和13C NMR光譜結(jié)合GC-MS技術分析靈芝多糖，結(jié)果顯示該多糖的主鏈為1, 4-二取代-葡萄糖基吡喃糖和1, 4, 6-三取代-葡萄糖基吡喃糖基，而支鏈主要是由1, 6-二取代-葡萄吡喃糖基和1, 4-二取代-半乳糖吡喃糖基殘基組成。由此可知，GCMS可以分析糖苷鍵類型、多糖的單糖組成，但是，當多糖中存在羧基和硫酸根等酸性基團時，會影響其在甲基化溶劑中的溶解，且糖醛酸中羧基的存在會導致酸性多糖不易氣化和水解，限制了GC-MS進行結(jié)構(gòu)分析[56]。

2 植物多糖高級結(jié)構(gòu)解析方法

植物多糖的空間結(jié)構(gòu)十分復雜，提取方法、藥材部位或是來源產(chǎn)地不同，其空間結(jié)構(gòu)也會有所差異。對多糖空間結(jié)構(gòu)的研究既有助于闡釋構(gòu)效關系，同時也可以完成多糖的質(zhì)量控制。多糖高級結(jié)構(gòu)的研究方法主要有原子力顯微鏡法（Atomic Force Microscopy，AFM）、X-射線衍射法（X-Ray Diffraction，XRD）和圓二色譜法（Circular Dichroismspectrum，CD）等，同時還可以利用計算機模擬多糖的空間構(gòu)象，構(gòu)建多糖的立體結(jié)構(gòu)。

2.1 原子力顯微鏡法

原子力顯微鏡法是研究大分子在誘導條件下結(jié)構(gòu)和動力學方面的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，分析表面分子的拓撲結(jié)構(gòu)，觀察分子結(jié)構(gòu)取向和空間分布的結(jié)構(gòu)分析方法，其原理是使彈性懸臂形變但量不變，樣品表面的起伏帶動末端探針上下移動，記錄針尖的移動軌跡，從而獲得樣品的表面形貌，該方法分析結(jié)果準確并且不會破壞樣品[57]。JI等[58]采用AFM測定木棗中分離得到的酸性多糖組分PZMP2-2，結(jié)果顯示PZMP2-2主要由帶有一些球形聚集體的隨機線性鏈組成，具有整體球形結(jié)構(gòu)。此外，AFM還可用于研究多糖形成的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。KAVITAKE等[59]通過AFM結(jié)合其他分析技術對印度傳統(tǒng)谷物-豆類發(fā)酵品中的多糖進行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明其為許多高度為39 nm的球形以及不規(guī)則形狀的團塊密集填充形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。近年來，隨著AFM探針技術的改進，使其操作方法愈加簡便，所獲得的圖像分辨率也有所提高，分析結(jié)果更加可靠。因此，AFM廣泛應用于分析多糖的空間結(jié)構(gòu)。

2.2 X-射線衍射法

X-射線衍射法是用X射線照射晶體，引起晶體中原子的電子振動，射線出現(xiàn)干涉現(xiàn)象，從而獲得衍射圖譜[60]。通過衍射圖譜可以獲得物質(zhì)晶型、分子構(gòu)型及空間構(gòu)象等信息。PARHAT等[61]采用XRD分析三種甘草種子多糖，結(jié)果顯示，三種甘草種子多糖均同時具有晶體結(jié)構(gòu)和非晶體結(jié)構(gòu)。REN等[62]采用XRD分析藜麥多糖（QP）及其分離純化得到的多糖組分的構(gòu)象，研究發(fā)現(xiàn)QP未經(jīng)進一步分離純化就不能形成單晶，而是以無定形形式存在，QPI-I和QPI-I-I在2θ為28.4°和40.6°附近可以形成穩(wěn)定的晶體結(jié)構(gòu)，同時證明了分離純化過程可以促進穩(wěn)定晶體結(jié)構(gòu)的形成。根據(jù)衍射圖譜的差異，可以鑒別不同種類的多糖，從而達到控制多糖質(zhì)量的目的。但應注意多糖通常不能結(jié)晶，需要在適宜的環(huán)境下通過外界誘導產(chǎn)生微晶態(tài)，才可使用X-射線衍射法進行分析。

2.3 圓二色譜法

圓二色譜法是用于糖類、蛋白質(zhì)等化合物空間結(jié)構(gòu)分析的一種常規(guī)手段，可以根據(jù)化合物分子中生色團的極化性和取向性來分析多糖的空間結(jié)構(gòu)及構(gòu)象轉(zhuǎn)變。ZHANG等[63]采用CD在190～300 nm范圍內(nèi)分析以不同提取方法提取的肉蓯蓉多糖空間結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，不同提取方法的多糖具有不同的CD光譜，其中，超聲纖維素酶輔助提取的多糖推測主要以有序結(jié)構(gòu)存在，局部形成螺旋結(jié)構(gòu)。XIA等[64]采用CD測定刺五加葉中獲得的兩種多糖組分ASPB2和ASP-B3，結(jié)果顯示，兩者均呈無規(guī)則卷曲構(gòu)象，且無三螺旋構(gòu)象。由此可知，CD能夠為多糖提供可靠的三維結(jié)構(gòu)信息，因此，成為了解析多糖高級結(jié)構(gòu)必不可少的工具。但由于中性多糖缺少特征紫外吸收基團，所以使用此法時通常需先對多糖進行結(jié)構(gòu)修飾或與剛果紅絡合后再進行測定。

2.4 分子模型的構(gòu)建

分子模型的構(gòu)建是通過分子動力學模擬、分子對接、自由能計算等方法，模擬大分子的空間構(gòu)象及分子間的相互作用關系，達到結(jié)構(gòu)預測以及探討機理的目的。但是，由于組成多糖的單糖種類多、結(jié)合方式不同、構(gòu)象靈活且難以結(jié)晶等問題，將該法應用于多糖的報道較少。目前，可用的軟件包括SWEETII、GLYCAM碳水化合物構(gòu)建器以及兩個獨立的軟件包POLYS和CarbBuilder。POLYS軟件可以用于多糖三維結(jié)構(gòu)構(gòu)建，首先，輸入多糖的初級結(jié)構(gòu)，以及X-射線衍射、NMR等實驗數(shù)據(jù)的補充，然后軟件可通過優(yōu)化糖苷鍵的幾何構(gòu)型構(gòu)建可靠的多糖立體結(jié)構(gòu)[65]。KUTTEL等[66]報道了CarbBuilder 2.0版本，該版本支持哺乳動物和細菌來源的單糖，以及用于衍生單個糖殘基的一系列取代基，還可以探索特定碳水化合物分子的可能構(gòu)象范圍。由CarbBuilder產(chǎn)生的分子模型可用于解釋實驗現(xiàn)象，或作為更復雜分子模擬的起點。

3 植物多糖結(jié)構(gòu)解析方法在質(zhì)量控制中的應用

隨著科學技術和儀器分析的發(fā)展，植物多糖的研究取得了較大的進展，在食品、藥品、保健品等領域具有廣泛的應用前景，多糖的質(zhì)量是保證其應用的根本，因此，對多糖的質(zhì)量進展控制至關重要。建立基于結(jié)構(gòu)特征的指紋圖譜，是保證其質(zhì)量的有效方法。指紋圖譜技術是基于樣品的某種結(jié)構(gòu)特性，采用色譜或光譜等結(jié)構(gòu)分析方法得到能夠代表該樣品特征的色譜、光譜以及其它圖譜數(shù)據(jù)資料，從而進行成分鑒定及質(zhì)量控制的一種可量化手段，具有快速、靈敏、方便等優(yōu)點[67]。通過使用指紋圖譜分析，會得出復雜的色譜圖與大量的數(shù)據(jù)。化學計量學通過使用多元分析處理數(shù)據(jù)，包括主成分分析（Principal ComponentAnalysis，PCA）、層次聚類分析（Hierarchical Cluster Method，HCA）、偏最小二乘判別分析（Partial Least Squares-Discriiminate Analysis，PLS-DA）和相似性分析（Similarity Analysis，SA）等，可以為樣本開發(fā)一個識別和鑒別模型。將指紋圖譜與多元分析相結(jié)合，可以用于產(chǎn)品的質(zhì)量評價、真?zhèn)舞b別及品種鑒別[68]。因此，指紋圖譜結(jié)合化學計量學方法是一種有效的中藥多糖質(zhì)量控制方法。YANG等[69]建立了用高效液相色譜指紋圖譜結(jié)合主成分分析（PCA）鑒定11批可可粉樣品中多糖的方法，能夠鑒別出摻假的可可粉。曾貞等[70]采集不同采收時間的鐵皮石斛多糖的紅外光譜信息，并對數(shù)據(jù)進行預處理，建立偏最小二乘回歸模型預測鐵皮石斛中總多糖含量，結(jié)果表明該模型可用于總多糖含量的快速預測，為鐵皮石斛質(zhì)量評價提供快速、有效的方法。但是，由于多糖結(jié)構(gòu)的多樣性和復雜性，僅靠單一分析方法或檢測技術獲得指紋圖譜難以完整表征其化學指紋全貌，常常是在一個側(cè)面上描述和表征多糖的部分結(jié)構(gòu)，難以實現(xiàn)對結(jié)構(gòu)的完整認知，而多維指紋圖譜則能很好地解決這一問題。多維指紋圖譜的概念是2000年羅國安教授提出的，即將多種分析儀器串聯(lián)起來建立指紋圖譜[71]。多維指紋圖譜具有顯著優(yōu)點，可以在實現(xiàn)色譜技術分離的同時，進行光譜檢測，其分析結(jié)果準確可靠，常用于解析多糖結(jié)構(gòu)，為多糖質(zhì)量控制提供依據(jù)。多維指紋圖譜的建立及應用見表5。

表5 多維指紋圖譜的建立及應用Table 5 Establishment and application of multidimensional fingerprint

4 總結(jié)與展望

近年來，植物多糖因具有多種生物活性，成為了醫(yī)藥和食品開發(fā)領域的研究熱點。本文從植物多糖的總糖含量、單糖組成、相對分子量及分布、糖苷鍵類型、空間結(jié)構(gòu)等方面進行總結(jié)，為植物多糖的結(jié)構(gòu)解析和質(zhì)量控制提供一定的參考依據(jù)。但是，由于多糖結(jié)構(gòu)的復雜性和研究手段的局限性，使得多糖的研究始終滯后于蛋白質(zhì)和核酸的研究。目前，植物多糖的結(jié)構(gòu)研究多集中在一級結(jié)構(gòu)上，更高級結(jié)構(gòu)的研究較難，并且沒有一種方法能單獨用于多糖高級結(jié)構(gòu)的全面解析，對多糖高級結(jié)構(gòu)與其活性關系的研究仍不夠深入，這不僅僅因為多糖自身結(jié)構(gòu)的復雜性及其空間結(jié)構(gòu)的多態(tài)性，更主要的是由于缺乏表征其高級結(jié)構(gòu)動態(tài)變化的技術手段，因此，單一的分析技術已不再適用。綜上所述，探索植物多糖高級結(jié)構(gòu)解析技術，研究結(jié)構(gòu)及生物活性之間的關系，是未來研究多糖的重點。隨著分析技術的發(fā)展，可以聯(lián)用多種方法提高多糖結(jié)構(gòu)表征的準確性，計算機輔助液態(tài)核磁圖譜解析技術、計算機分子對接及分子動力學模擬技術預測多糖的結(jié)構(gòu)；此外，還可在多糖結(jié)構(gòu)層次上開展構(gòu)效關系的研究，利用3D等新興技術，對多糖結(jié)構(gòu)進行修飾，增強其生物活性，使多糖作為新型和高附加值活性的天然產(chǎn)物在制藥、生物醫(yī)學、食品和化妝品等行業(yè)廣泛應用。