L-茶氨酸與表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯預(yù)防肥胖及高膽固醇血癥的協(xié)同調(diào)節(jié)作用

劉寶貴，陳致印，張楊玲，劉恩碩，韓淑敏，肖文軍

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長(zhǎng)沙 410128）

肥胖是全世界公認(rèn)的一個(gè)重要的健康問(wèn)題，會(huì)引發(fā)心血管疾病、2型糖尿病、高血壓、高脂血癥等相關(guān)代謝綜合征[1]。傳統(tǒng)的治療藥物多為化學(xué)合成，不僅存在一定的毒副作用，而且難以從根本上有效預(yù)防肥胖及并發(fā)癥[2]。開(kāi)發(fā)利用天然、安全、有效的輔助降脂減肥的營(yíng)養(yǎng)干預(yù)產(chǎn)品將是防治肥胖以及高脂血癥的重要發(fā)展方向。

綠茶是廣受歡迎的天然飲品，含有茶多酚（兒茶素）、L-茶氨酸（L-theanine，LTA）、生物堿等多種生物活性成分，具有改善肥胖、糖尿病、高血壓、血脂異常和心血管疾病等多種健康功效[3]。其提取物在多項(xiàng)研究中均表現(xiàn)出降脂減肥的功效[4]，在人體實(shí)驗(yàn)中也得到證實(shí)[5-6]。綠茶中的L-茶氨酸能顯著抑制小鼠體重增加和脂肪積累并降低血液中甘油三酯（Triglyceride，TG）和游離脂肪酸（Free fatty acids，F(xiàn)AA）的濃度[7-9]，同時(shí)可通過(guò)下調(diào)大鼠腸道與脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)載體的表達(dá)，抑制脂肪的合成[10]。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）是綠茶中含量最多的兒茶素，具有獨(dú)特的藥理特性，包括抗氧化、抗炎、抗癌、抗肥胖等作用[11]，能夠抑制小鼠體重的增加和腸道脂質(zhì)的吸收，促進(jìn)脂質(zhì)的排泄[12]，并增強(qiáng)與脂肪酸氧化[13]和褐色脂肪（Brown fat，BAT）產(chǎn)熱[14]有關(guān)的基因表達(dá)，促進(jìn)脂肪氧化和BAT產(chǎn)熱，增加機(jī)體能量消耗，以達(dá)到減肥的效用。同時(shí)，EGCG和L-茶氨酸已經(jīng)被報(bào)道在調(diào)節(jié)機(jī)體營(yíng)養(yǎng)代謝上存在協(xié)同作用[15]，劉曉慧等[16]的研究也發(fā)現(xiàn)EGCG和L-茶氨酸在修復(fù)細(xì)胞氧化損傷方面存在協(xié)同增效的作用。此外，還發(fā)現(xiàn)EGCG和L-茶氨酸在調(diào)節(jié)機(jī)體脂代謝的分子機(jī)制上存在相似性和差異性[17-18]，在調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝方面存在協(xié)同增效的物質(zhì)基礎(chǔ)，但目前EGCG和L-茶氨酸協(xié)同干預(yù)的實(shí)證研究較少。

為此，本研究以成功造模肥胖及高膽固醇血癥大鼠的高脂飼料為基礎(chǔ)，以L-茶氨酸、EGCG以及茶鮮葉中EGCG與L-茶氨酸的天然質(zhì)量比（約為5:1）配制而成的EGCG+L-茶氨酸混合物為原料，連續(xù)灌喂高脂飲食SPF級(jí)SD大鼠56 d，比較研究了L-茶氨酸及EGCG在預(yù)防肥胖及高膽固醇血癥方面的協(xié)同調(diào)節(jié)作用，為促進(jìn)食品營(yíng)養(yǎng)干預(yù)多元化發(fā)展及茶葉功能成分利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級(jí)雄性SD大鼠 48只，4周齡，體重（170±10）g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，試驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004；高脂飼料（High-fat diet，HFD）和正常飼料（Normal diet，ND） 江蘇南通特洛菲飼料有限公司，其中高脂飼料（編號(hào)23300）提供5.1 Kcal/g能量，正常飼料（編號(hào)23302）提供3.6 Kcal/g能量，主要成分包括玉米淀粉、豆油、蔗糖、纖維素等，營(yíng)養(yǎng)成分如表1所示；EGCG（純度≥98%）、L-茶氨酸（純度≥98%） 湖南省三福生物科技公司；辛伐他汀（Simvastatin，Sim）美國(guó)Abmole公司；甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH-PX）、過(guò)氧化氫酶（CAT）等試劑盒 南京建成生物工程研究所；ELISA試劑盒瘦素（LEP）、磷脂（PL）、載脂蛋白A1（Apo-A1）、載脂蛋白B100（Apo-B100） 上海茁彩生物科技有限公司。

表1 高脂飼料和正常飼料營(yíng)養(yǎng)成分Table 1 Nutrient composition of high-fat diet and normal diet

Varioskan flash多功能酶標(biāo)儀、F1-Clop Tip移液槍、PowerGen125高速勻漿機(jī) 美國(guó)Thermo公司；MIKRO 22R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Hettich公司；病理切片機(jī) 上海徠卡儀器有限公司；M2104電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心批準(zhǔn)并符合動(dòng)物倫理規(guī)范。所有大鼠按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行處理（表2）：將48只SPF級(jí)SD大鼠在（25±2）°C條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，稱取體重，隨機(jī)分為6組（n=8）：正常飲食組（ND）及高脂飲食組（HFD）灌胃等量超純水，辛伐他汀對(duì)照組（Sim）灌胃5 mg·kg-1·d-1辛伐他汀，L-茶氨酸干預(yù)組（L）灌胃100 mg·kg-1·d-1L-茶氨酸，EGCG干預(yù)組（E）灌胃100 mg·kg-1·d-1EGCG，L-茶氨酸+EGCG聯(lián) 合 干 預(yù) 組（LE）灌 胃83.3 mg·kg-1·d-1EGCG+16.7 mg·kg-1·d-1L-茶氨酸，所有劑量設(shè)置通過(guò)換算并參考自現(xiàn)有的研究[15,17,19]，其中辛伐他汀的灌胃劑量采用在人中服用的劑量為準(zhǔn)（官方指定的使用劑量）。灌胃體積根據(jù)每日體重變化而變化，灌胃濃度固定。

表2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組Table 2 Animal experiment grouping

每天灌胃、稱重并記錄體重和攝食量，為期8周，造模時(shí)間、方法及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考已有研究[20-22]，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后禁食12～16 h，每只大鼠注射2%戊巴比妥鈉麻醉，主動(dòng)脈取血。收集各組大鼠脂肪、器官（心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟）和腸道，-80 °C保存。

肥胖及高膽固醇血癥模型的建立依據(jù)。大鼠肥胖的判別標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)，大鼠體質(zhì)量超過(guò)普通飼料喂養(yǎng)大鼠體質(zhì)量的20%作為實(shí)驗(yàn)性肥胖大鼠[21]。高脂血癥則是以高脂飼料喂養(yǎng)，大鼠血脂顯著高于普通飼料喂養(yǎng)的大鼠作為判別依據(jù)，根據(jù)不同的指標(biāo)變化有不同的分類，常見(jiàn)的主要分為高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥以及混合雙高型（高甘油三酯和高膽固醇）血癥[22]。

1.2.2 體重、Lee’s指數(shù)測(cè)定 每天稱量一次體重，觀測(cè)各組體重增長(zhǎng)規(guī)律，并根據(jù)初始體重W1和最終體重W2計(jì)算體重增量，并在最后一次灌胃前測(cè)量大鼠體重（g）與體長(zhǎng)（cm），根據(jù)公式計(jì)算李氏指數(shù)：

1.2.3 攝食量和食物利用率 測(cè)定各組大鼠每日定量添加（120±2）g日糧，定時(shí)回收并稱量當(dāng)日剩余日糧，計(jì)算食物攝入，通過(guò)飼養(yǎng)階段大鼠的飼料消耗量及其體重增長(zhǎng)量來(lái)計(jì)算食物利用率：

食物利用率（%）=每日體重增長(zhǎng)量/每日攝食量×100

1.2.4 脂肪積累相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定 解剖后稱取腹腔和附睪白色脂肪組織以及肩胛骨處的棕色脂肪稱重，并計(jì)算相關(guān)脂肪系數(shù)；同時(shí)，稱取心、肝、脾、肺、腎重量，并計(jì)算器官總重量及器官指數(shù)和肝臟系數(shù)：

脂肪系數(shù)（%）=（附睪脂肪質(zhì)量+腹腔脂肪質(zhì)量）/體質(zhì)量×100

1.2.5 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 主動(dòng)脈取血于EP管中，在4 °C下3500 r/min離心10 min，分離上層血清，放置-80 °C冰箱中保存。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、PL、Apo-A1、Apo-B100的含量以及ALT、AST的活性。

1.2.6 肝臟TG和TC含量檢測(cè) 準(zhǔn)確稱取凍存的肝臟組織重量，加入9倍體積的無(wú)水乙醇于冰水浴條件下機(jī)械研磨，制成10%的肝臟勻漿，4 °C下2500 r/min離心10 min后取上清液，試劑盒測(cè)定肝臟勻漿的TG、TC水平。

1.2.7 肝臟氧化還原狀態(tài)檢測(cè) 準(zhǔn)確稱取凍存的肝臟組織重量，加入9倍體積的生理鹽水于冰水浴條件下機(jī)械研磨，離心（離心條件同上）后取上清液，試劑盒測(cè)定肝臟勻漿的MDA水平以及T-SOD、CAT、GSH-PX活性。

1.2.8 病理及組織學(xué)分析 取大鼠肝臟、腎周白色脂肪、背部褐色脂肪組織的相同部位于4%的多聚甲醛溶液中固定后，對(duì)肝臟進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

切片圖像應(yīng)用CaseViewer軟件分析；腎周脂肪切片脂肪細(xì)胞數(shù)目、截面積計(jì)算應(yīng)用Image-J軟件完成；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS26統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示；方差分析采用ANOVA和LSD法檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-茶氨酸及EGCG對(duì)高脂飲食大鼠體重、Lee’s指數(shù)的影響

各組大鼠體重變化如圖1（圖1A，B）所示，高脂飲食誘導(dǎo)大鼠8周后，高脂肥胖模型（HFD）組大鼠體重顯著高于正常飲食（ND）組（P＜0.05），且高于ND組大鼠體重的21.2%，表明SD大鼠經(jīng)過(guò)8周高脂飲食的誘導(dǎo)，會(huì)導(dǎo)致肥胖的形成，這與李秀平等[23]的研究結(jié)果一致。與HFD組相比，各干預(yù)組體重增長(zhǎng)量均顯著降低（P＜0.05）；其中與陽(yáng)性藥物對(duì)照組（Sim）相比，僅有EGCG+L-茶氨酸混合干預(yù)組（LE）體重增長(zhǎng)量顯著降低（P＜0.05）。同時(shí)，LE組與ND組相比，無(wú)顯著差異（P＞0.05）。Lee’s指數(shù)主要反映機(jī)體脂肪占總體重的比例，該指數(shù)比單純的體重值更能精確地反映機(jī)體的肥胖程度[24]。結(jié)果如圖1C所示，在Lee’s指數(shù)中，與ND組相比，HFD組Lee’s指數(shù)顯著提高（P＜0.05）。與HFD組相比，各干預(yù)組Lee’s指數(shù)均顯著降低（P＜0.05），且各干預(yù)組間與ND組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。這說(shuō)明L-茶氨酸和EGCG的聯(lián)合干預(yù)比L-茶氨酸或EGCG單獨(dú)干預(yù)更能有效地預(yù)防長(zhǎng)期高脂飲食大鼠體重的增加，降低Lee’s指數(shù)緩解肥胖的形成。

圖1 L-茶氨酸及EGCG對(duì)高脂飲食大鼠體重、Lee’s指數(shù)的影響Fig.1 Effects of L-theanine and EGCG on body weight and Lee‘s index of rats on high-fat diet

2.2 L-茶氨酸及EGCG對(duì)高脂飲食大鼠攝食量和食物利用率的影響

大鼠在8周飼養(yǎng)過(guò)程中的攝食量變化情況如圖2A所示，1～3周所有組大鼠攝食量均表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，而3～8周攝食量則持續(xù)增長(zhǎng)，其中1～3周攝食量表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)可能與灌胃對(duì)大鼠的刺激有關(guān)，而3～8周過(guò)程，大鼠逐漸適應(yīng)灌胃和藥物的刺激，且由于生長(zhǎng)發(fā)育的需要，攝食量開(kāi)始持續(xù)增加。同時(shí)，結(jié)合圖2B來(lái)看，盡管各周各組大鼠日均攝食量都有浮動(dòng)，且正常對(duì)照組（ND）組攝食量最高，但是各組大鼠之間攝食量并無(wú)顯著差異，說(shuō)明辛伐他汀、EGCG、L-茶氨酸及其混合物對(duì)大鼠攝食量沒(méi)有顯著影響。在食物利用率中（圖2C），與ND組的正常飼料相比，HFD組的高脂飼料食物利用率顯著提高（P＜0.05）；與HFD組相比，除Sim組外，各干預(yù)組均顯著降低了高脂飼料的食物利用率（P＜0.05）；其中，在L組、E組、LE組中與Sim組相比，僅有LE組食物利用率顯著降低（P＜0.05）。這表明EGCG與L-茶氨酸聯(lián)合干預(yù)在不影響攝食量的情況下降低高脂飲食大鼠的食物利用率，減少能量的攝入，進(jìn)而緩解肥胖的形成。

圖2 L-茶氨酸及EGCG對(duì)高脂飲食大鼠攝食量及食物利用率的影響Fig.2 Effects of L-theanine and EGCG on food intake and food utilization of rats on high-fat diet

2.3 L-茶氨酸及EGCG對(duì)高脂飲食大鼠脂肪積累的影響

高脂飲食引起的肥胖往往伴隨著脂肪的堆積，內(nèi)臟脂肪過(guò)多的堆積會(huì)對(duì)機(jī)體各器官造成機(jī)械壓力損傷，影響器官的正常功能[23]。在哺乳動(dòng)物中，脂肪組織主要被分為三類：白色脂肪組織（WAT）、棕色脂肪組織（BAT）和米色脂肪組織[25]。其中，WAT是儲(chǔ)能器官，主要由白色脂肪細(xì)胞構(gòu)成包括腹腔脂肪與附睪脂肪等，可將體內(nèi)多余的能量以三酰甘油（TG）的形式儲(chǔ)存，而B(niǎo)AT主要參與體溫調(diào)節(jié)和能量代謝，通過(guò)加快脂肪氧化來(lái)促進(jìn)機(jī)體能量消耗[26]。如表3所示，與ND組相比，HFD組以及各干預(yù)大鼠的棕色脂肪質(zhì)量以及系數(shù)均有提高，其中，僅有LE組顯著提高（P＜0.05）。與ND組相比，HFD組腹腔脂肪、附睪脂肪及總白色脂肪組織質(zhì)量及系數(shù)均顯著提高（P＜0.05），說(shuō)明長(zhǎng)期高脂飲食造成了脂肪的囤積。在腹腔脂肪質(zhì)量和系數(shù)中，與HFD組相比，僅有Sim組和LE組顯著降低（P＜0.05）；在附睪脂肪質(zhì)量和系數(shù)中，與HFD組相比，僅有E組和LE組顯著降低（P＜0.05），這與LI等[19]的研究一致。在總脂肪及其系數(shù)中，與HFD組相比，只有E組、LE組著降低（P＜0.05），且LE組更接近ND組（P＞0.05）。

表3 L-茶氨酸及EGCG對(duì)高脂飲食大鼠脂肪積累的影響Table 3 Effects of L-theanine and EGCG on fat accumulation of rats on high-fat diet

此外，脂肪的積累不僅表現(xiàn)在脂肪組織上，脂質(zhì)還會(huì)沉積在體內(nèi)各器官，影響其功能的發(fā)揮。如表4所示，記錄了各器官的質(zhì)量及相關(guān)系數(shù)，表中數(shù)據(jù)顯示，與ND組相比，長(zhǎng)期高脂飲食的各干預(yù)組在心臟、脾臟、腎臟質(zhì)量上沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），這說(shuō)明長(zhǎng)期高脂飲食導(dǎo)致的脂質(zhì)沉積主要發(fā)生在肝臟和肺部位。與ND組相比，HFD組的肺質(zhì)量、肝臟質(zhì)量及其系數(shù)和器官總質(zhì)量及其指數(shù)均顯著高于ND組（P＜0.05）；與HFD組相比，各干預(yù)組均顯著降低了肝臟系數(shù)和器官總質(zhì)量及其指數(shù)（P＜0.05）；在肺質(zhì)量中，僅有Sim組和L組顯著降低（P＜0.05），其余干預(yù)組無(wú)顯著差異（P＞0.05）;在肝臟質(zhì)量中，僅有LE組顯著降低（P＜0.05）；在肝臟系數(shù)和器官總質(zhì)量及其指數(shù)中，只有LE組與ND組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。由此說(shuō)明，EGCG+L-茶氨酸的聯(lián)合干預(yù)比單獨(dú)干預(yù)更能有效預(yù)防長(zhǎng)期高脂飲食大鼠脂肪的積累和器官脂質(zhì)的沉積。

表4 L-茶氨酸及EGCG對(duì)高脂飲食大鼠內(nèi)臟器官脂質(zhì)蓄積的影響Table 4 Effects of L-theanine and EGCG on lipid accumulation in visceral organs of rats on high-fat diet

2.4 L-茶氨酸及EGCG對(duì)高脂飲食大鼠血脂和肝損傷的影響

在本文中血脂指標(biāo)包括：總膽固醇（TC）、磷脂（PL）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、載脂蛋白A1（Apo-A1）、載脂蛋白B100（Apo-B100），其中Apo-A1、Apo-B100及其比值A(chǔ)po-B100/Apo-A1是預(yù)測(cè)心血管疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的重要指標(biāo)，二者比值越高心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)越高[27]。其次，由于脂質(zhì)在肝臟的大量積聚，會(huì)引發(fā)肝損傷，從而造成血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）升高。結(jié)果如圖3（圖3，A-I）所示，與ND組相比，HFD組血清TC、PL、LDL-C、Apo-B100、ALT、AST水平均顯著升高（P＜0.05），HDL-C、Apo-A1顯著降低（P＜0.05）。這表明肥胖模型大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的高膽固醇血癥和肝損傷，并顯著增加了心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[27]（P＜0.05）（圖3，E-G）。各組干預(yù)后，與HFD組相比，除L組外，各干預(yù)組組血清TC、PL、LDL-C、Apo-B100、Apo-B100/Apo-A1、ALT的水平顯著降低（P＜0.05），HDL-C、Apo-A1含量顯著提高（P＜0.05）；同時(shí)LE組在降低Apo-B100、Apo-B100/Apo-A1中的效果顯著優(yōu)于E組（P＜0.05），而在TC、PL、LDL-C、ALT上則無(wú)顯著差異（P＞0.05）；L組僅顯著降低血清LDL-C、Apo-B100、Apo-B100/Apo-A1水平（P＜0.05），TC、PL、ALT仍處于較高水平。說(shuō)明L-茶氨酸和EGCG聯(lián)合干預(yù)比單獨(dú)干預(yù)更能有效地預(yù)防長(zhǎng)期高脂飲食所導(dǎo)致的高膽固醇血癥，降低心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，還能緩解部分長(zhǎng)期高脂飲食造成的肝損傷。

圖3 L-茶氨酸及EGCG對(duì)高脂飲食大鼠血脂和肝損傷的影響Fig.3 Effects of L-theanine and EGCG on blood lipids and liver injury of rats on high-fat diet

2.5 L-茶氨酸及EGCG對(duì)高脂飲食大鼠肝臟TC、TG含量的影響

不同干預(yù)組對(duì)大鼠肝臟TC、TG含量的影響如圖4所示。在TC中，除L組外，各干預(yù)組均能顯著降低肝臟TC的沉積（P＜0.05）；同時(shí)與L組相比，E組無(wú)顯著差異（P＞0.05），而Sim組和LE組肝臟TC含量水平則顯著降低（P＜0.05）。在TG中，只有E組、LE組顯著降低肝臟TG的沉積（P＜0.05）。與Sim組相比，只有LE組肝臟TG含量水平顯著降低（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，EGCG+L-茶氨酸聯(lián)合干預(yù)比單獨(dú)干預(yù)更能有效地改善肥胖及高膽固醇血癥模型大鼠肝臟TC、TG的沉積。

圖4 L-茶氨酸及EGCG對(duì)高脂飲食大鼠肝臟TC、TG的影響Fig.4 Effects of L-theanine and EGCG on hepatic TC and TG of rats on high-fat diet

2.6 L-茶氨酸及EGCG對(duì)高脂飲食大鼠肝臟氧化還原狀態(tài)的影響

如圖5表明，HFD組肝臟氧化還原相關(guān)指標(biāo)（MDA含量和CAT、T-SOD、GSH-PX活性）失衡程度均顯著大于ND組（P＜0.05）。與HFD組相比，Sim、E、LE組肝臟MDA含量顯著降低（P＜0.05），且與E組相比，LE組與Sim或ND組已無(wú)顯著差異（P＞0.05）。與ND組相比，Sim、E、LE組GSH-PX活性已無(wú)顯著差異（P＞0.05）。同時(shí)在所有的干預(yù)組中，只有LE組顯著升高了CAT的活性（P＜0.05）；而在T-SOD中，所有干預(yù)組仍處于較低水平。這表明L-茶氨酸+EGCG聯(lián)合干預(yù)比單獨(dú)干預(yù)更能有效緩解長(zhǎng)期高脂飲食大鼠肝臟氧化還原的失衡程度。

圖5 L-茶氨酸及EGCG對(duì)高脂飲食大鼠肝臟氧化還原狀態(tài)的影響Fig.5 Effects of L-theanine and EGCG on the hepatic redox status of rats on high-fat diet

2.7 L-茶氨酸及EGCG對(duì)高脂飲食大鼠肝臟和脂肪組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由圖6（圖6，A和B）可以看出，ND組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列整齊有序，肝細(xì)胞形態(tài)大小正常，且無(wú)變性壞死，幾乎未出現(xiàn)脂滴，肝臟外觀呈現(xiàn)鮮紅色；與ND組比較，HFD組小鼠肝組織中肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，肝索解離，肝竇消失，肝細(xì)胞腫脹且體積較明顯增大，細(xì)胞核被擠向周邊，細(xì)胞內(nèi)充滿了大小、數(shù)量不等的脂滴小空泡，肝臟脂肪變性較嚴(yán)重，導(dǎo)致肝臟外觀呈現(xiàn)乳紅色。與HFD組比較，Sim組、L組肝臟細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量雖然明顯減少，但仍含有較多脂滴，整個(gè)肝臟外觀與HFD組相比依然腫脹，其中Sim組肝臟脂滴數(shù)量較L組明顯減少；與Sim組、L組相比，E、LE組肝臟的腫脹程度與脂肪變性程度明顯減輕，脂滴小空泡明顯減少，肝臟顏色也部分恢復(fù)紅色，且LE組脂滴較E組明顯減少，比較接近ND組。

圖6 L-茶氨酸及EGCG對(duì)高脂飲食大鼠肝臟和脂肪組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Fig.6 Effects of L-theanine and EGCG on the morphological structure of liver and adipose tissue of rats on high-fat diet

各組大鼠脂肪組織的切片如圖6（圖6，C、D和E）所示。ND組脂肪細(xì)胞體積較小，大小均一，形態(tài)清晰，結(jié)構(gòu)完整；與ND組相比，HFD組脂肪細(xì)胞體積明顯增大，細(xì)胞大小不均勻，排列不規(guī)則；相同視野范圍內(nèi)，HFD組脂肪細(xì)胞數(shù)量較ND組明顯減少，脂肪細(xì)胞體積較ND組明顯增大，說(shuō)明高脂飲食誘導(dǎo)可以增加脂肪細(xì)胞體積和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量；與HFD組相比，Sim組、L組、E組和LE組大鼠脂肪細(xì)胞都有不同程度的變小，僅有少數(shù)脂肪細(xì)胞肥大，相同視野范圍內(nèi)的脂肪細(xì)胞數(shù)量明顯增多；其中L組脂肪細(xì)胞體積較Sim組仍舊較大，E組和LE組脂肪細(xì)胞體積比較相近且均小于Sim組，同時(shí)LE組脂肪細(xì)胞體積小于E組。這說(shuō)明EGCG+L-茶氨酸能有效降低肥胖模型大鼠脂肪細(xì)胞大小，減少脂滴在脂肪細(xì)胞的積聚。

3 討論與結(jié)論

本研究表明EGCG和L-茶氨酸聯(lián)合應(yīng)用能有效預(yù)防長(zhǎng)期高脂飲食所造成的肥胖及高膽固醇血癥。一方面，L-茶氨酸和EGCG在預(yù)防長(zhǎng)期高脂飲食大鼠所導(dǎo)致的肥胖上均表現(xiàn)出積極作用，且與單獨(dú)使用EGCG或L-茶氨酸的干預(yù)組相比，EGCG和L-茶氨酸聯(lián)合干預(yù)有效降低了大鼠體重、腹腔脂肪質(zhì)量、器官指數(shù)；同時(shí)，EGCG和L-茶氨酸聯(lián)合干預(yù)組有效的降低了受試大鼠的食物利用率，促進(jìn)白色脂肪褐變，從而加快機(jī)體的能量消耗，降低了皮下脂肪以及各器官中脂質(zhì)的蓄積，緩解了肥胖的發(fā)生[19]。另一方面，L-茶氨酸和EGCG干預(yù)組在降低血脂，緩解肝臟抗氧化失衡方面也顯示了積極作用，與單獨(dú)使用EGCG或L-茶氨酸的干預(yù)組相比，EGCG和L-茶氨酸聯(lián)合干預(yù)還有效降低血脂、肝脂及肝臟MDA含量，同時(shí)提高肝臟CAT的活性。此外，病理切片顯示長(zhǎng)期高脂飲食所導(dǎo)致的肥胖大鼠脂肪組織（腎周白色脂肪組織、背部褐色脂肪組織）和肝臟脂質(zhì)大量積聚，而EGCG+L-茶氨酸聯(lián)合干預(yù)組明顯改善。說(shuō)明L-茶氨酸和EGCG對(duì)長(zhǎng)期高脂飲食導(dǎo)致的肝臟受損具有一定的預(yù)防作用，且L-茶氨酸+EGCG聯(lián)合干預(yù)比單獨(dú)干預(yù)組表現(xiàn)出更好的效果。這表明L-茶氨酸對(duì)EGCG修復(fù)肝臟氧化損傷有一定的協(xié)同作用，該結(jié)果與劉曉慧等[16]的研究結(jié)果一致，推測(cè)EGCG+L-茶氨酸聯(lián)合干預(yù)通過(guò)保護(hù)肝臟、改善脂質(zhì)代謝、緩解氧化應(yīng)激，從而有效地預(yù)防長(zhǎng)期高脂飲食所導(dǎo)致的高脂血癥或血脂異常的發(fā)生。

此外，EGCG與L-茶氨酸在機(jī)體脂質(zhì)代謝方面存在的協(xié)同作用可能與劑量和配比有關(guān)，錯(cuò)誤的劑量和配比可能不會(huì)產(chǎn)生協(xié)同作用，這在另一項(xiàng)研究中也被重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)[28]。本研究選擇的是在茶鮮葉中EGCG與L-茶氨酸的天然質(zhì)量比（約為5:1）的配比[29]，EGCG的劑量參考之前的研究，選擇100 mg/kg·d-1的安全劑量[19,28]。在此前研究中，EGCG與L-茶氨酸的聯(lián)合干預(yù)已被證實(shí)在調(diào)節(jié)機(jī)體營(yíng)養(yǎng)代謝方面存在協(xié)同作用[15]。而L-茶氨酸與EGCG之間的這種協(xié)同作用可能因?yàn)長(zhǎng)-茶氨酸可以改變其他成分在細(xì)胞中的濃度，進(jìn)而間接影響藥物的作用[30-31]。還有研究稱L-茶氨酸與其他化合物同時(shí)作用時(shí)，細(xì)胞內(nèi)某些基因會(huì)發(fā)生改變，這或許也是聯(lián)合干預(yù)效果優(yōu)于單獨(dú)干預(yù)的原因之一[32]。此外，EGCG與L-茶氨酸之間可能存在一些相互作用，這些相互作用可能改變了EGCG的結(jié)構(gòu)、性能以及利用率等[16]。

綜上所述，L-茶氨酸+EGCG聯(lián)合干預(yù)可以有效地預(yù)防長(zhǎng)期高脂飲食造成的肥胖以及高膽固醇血癥的發(fā)生。并有可能通過(guò)以下三種機(jī)制發(fā)揮作用：其一，能量消耗和攝入之間的不平衡是導(dǎo)致肥胖發(fā)生的根本因素，L-茶氨酸與EGCG的聯(lián)合干預(yù)表現(xiàn)出比單獨(dú)干預(yù)組更低的食物利用率，減少了能量的攝入，同時(shí)褐色脂肪組織的增多也增加了機(jī)體能量消耗，從而有效地控制肥胖的形成[1]；其二，L-茶氨酸和EGCG可能通過(guò)調(diào)節(jié)與脂肪合成與分解相關(guān)的酶和蛋白[33]，抑制脂肪的合成，促進(jìn)脂肪的分解[17-18]，改善肝臟脂質(zhì)代謝紊亂，減少肝臟的脂質(zhì)沉積，從而緩解肥胖并預(yù)防高脂血癥的發(fā)生；其三，由于EGCG和L-茶氨酸之間的相互作用，可能導(dǎo)致其二者在調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝方面存在協(xié)同增效的作用[16]，但具體作用效果還需進(jìn)一步進(jìn)行研究證實(shí)。