地參游離酚對(duì)CCl4所致肝細(xì)胞損傷細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期及炎癥因子的影響

李媛麗，洪 玥, ，孔 霄，林 琳，張?zhí)礻?yáng)，李 望，劉 青，高春燕 ，盧躍紅

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 671000；2.大理白族自治州中醫(yī)醫(yī)院，云南大理 671000；3.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏銀川 750021）

肝臟在人類健康中起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)肝臟暴露于過(guò)量的某些有害物質(zhì)中時(shí)，就會(huì)造成組織損傷、壞死及原有生物功能的喪失[1-2]。肝損傷伴肝代謝功能障礙可導(dǎo)致許多疾病，包括從肝酶水平的短暫升高到危及生命的肝纖維化、肝硬化，甚至肝腫瘤等[3]。目前，運(yùn)用于治療肝損傷和預(yù)防的藥物有很多，但是，此類藥物都具有相對(duì)嚴(yán)重的毒副作用[4]。因此，來(lái)源于天然動(dòng)植物中安全高效的活性成分，用于此類疾病的防治已成為現(xiàn)今研究者關(guān)注的焦點(diǎn)[5]。已有研究表明，酚類化合物具有多種生物學(xué)作用，如抗氧化、抗動(dòng)脈硬化、抑制腫瘤、抑制微生物、影響酶活性、保護(hù)CCl4肝損傷等[6-11]。

地參（Lycopus lucidusTurcz.），唇形科屬多年草本植物，其形狀、營(yíng)養(yǎng)與人參相似[12]。地參含有礦物質(zhì)、氨基酸、黃酮類、酚類和糖類等多種活性成分，具有增強(qiáng)免疫、抗氧化、降血糖、降血脂、抑制消化酶活性及抗腫瘤等作用[13-16]。前期研究結(jié)果顯示，在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，地參游離酚提取物通過(guò)抗氧化、抗炎發(fā)揮對(duì)CCl4所致肝損傷小鼠的保護(hù)作用[17]；在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，地參酚類化合物能顯著降低CCl4所致BRL肝細(xì)胞損傷谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和乳酸脫氫酶（LDH）活性的升高[17-19]，但其作用機(jī)制尚不清楚，而CCl4所致肝損傷與細(xì)胞凋亡[20]、細(xì)胞周期的分布[21]、炎癥反應(yīng)[22]等密切相關(guān)。

本研究通過(guò)建立CCl4所致BRL大鼠肝細(xì)胞損傷模型，采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期分布，檢測(cè)炎癥反應(yīng)的介質(zhì)因子腫瘤壞死因子α（TNFα）和白介素8（IL-8）的含量、Caspase-3的活化程度以及環(huán)氧化酶-2（COX-2）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和白介素6（IL-6）的蛋白表達(dá)水平，從細(xì)胞及分子水平揭示地參游離酚對(duì)CCl4所致BRL大鼠肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制，并作為開(kāi)發(fā)地參保肝功能性食品及藥品的前期基礎(chǔ)研究，為地參資源的開(kāi)發(fā)與利用和保肝藥物的開(kāi)發(fā)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

地參 2019年10月采于云南省劍川縣沙溪鎮(zhèn)；BRL大鼠肝細(xì)胞 中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清（FBS）、DMEM高糖培養(yǎng)液 Gibco公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒 凱基生物技術(shù)股份有限公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒、Caspase-3活性測(cè)試盒南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-8 Elisa檢測(cè)試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司；COX-2、iNOS、IL-6一抗、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、組化試劑盒DAB顯色劑 武漢賽維爾生物科技有限公司。

Scientz-ND真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司；RCO3000T-5-VBC 二氧化碳培養(yǎng)箱美國(guó)REVCO公司；722N可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；ELx800全自動(dòng)酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Tek基因有限公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀美國(guó)Becton Dickinson公司；BX53倒置熒光顯微鏡日本Olympus公司；GT1001組化筆 美國(guó)Genentech公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 地參游離酚的制備 參照黃菊華等[23]的方法，并略加修改。地參粉末（地參經(jīng)清洗、真空冷凍干燥、粉碎過(guò)60目篩，得到地參粉末）和80%的甲醇溶液以料液比1:20（g:mL）的比例充分混勻，在室溫條件下，利用100 Hz超聲波對(duì)混合溶液進(jìn)行輔助提取，3次（每次10 min）后合并濾液，35 ℃減壓濃縮去除甲醇，剩余液體加入適量6 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH為1～2，并利用乙酸乙酯萃取，5次后合并對(duì)應(yīng)的乙酸乙酯相，并在35 ℃下，減壓濃縮，除去乙酸乙酯，剩余濃縮液用蒸餾水定容至15 mL，即得地參游離酚粗提物。稱取一定量預(yù)處理后的X-5大孔樹(shù)脂，將其加入到地參游離酚粗提物中，35 ℃水浴振蕩24 h后抽濾，將樹(shù)脂置于70%的乙醇溶液中水浴振蕩24 h進(jìn)行解析，過(guò)濾，將濾液35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，剩余濃縮液真空冷凍干燥24 h，得地參游離酚提取物純品（得率為1.79%）。使用杜氏磷酸鹽緩沖液（D-PBS，2.67 mmol/L KCl，1.47 mmol/L KH2PO4，137.93 mmol/L NaCl，8.06 mmol/L Na2HPO4，pH為7.4±0.1）使其充分溶解，配制成濃度為5 mg/mL的溶液，臨用前用完全培養(yǎng)液（DMEM高糖培養(yǎng)液+10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素溶液）稀釋成各個(gè)濃度的應(yīng)用液。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、地參游離酚干預(yù)組及模型組。取對(duì)數(shù)期的BRL大鼠肝細(xì)胞以5×104個(gè)/mL接種到6孔板中，每孔2 mL，37 ℃5% CO2培養(yǎng)48 h后，地參游離酚干預(yù)組分別加入2 mL不同濃度（0.4、0.8、1.6 mg/mL）的地參游離酚，并為正常組和模型組提供2 mL的完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)4 h。隨后，正常組加入800 μL完全培養(yǎng)液，地參游離酚干預(yù)組和模型組加入800 μL 100 mmol/L的CCl4溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。

1.2.3 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，細(xì)胞按1.2.2方法處理后，4 ℃ 1100 r/min離心5 min，去上清，加入結(jié)合液500 μL，輕微重懸細(xì)胞，隨后加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI，輕輕搖晃，充分混勻，在25 ℃下避光反應(yīng)10 min，并采用流式細(xì)胞儀（Annexin V和PI雙染法）檢測(cè)溶液中細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 細(xì)胞周期分布的檢測(cè) 按1.2.2方法處理細(xì)胞后，4 ℃ 1100 r/min離心5 min，去上清，用500 μL 70%的冰乙醇固定。D-PBS洗去固定液，4 ℃1100 r/min離心5 min，去上清，加入PI/RNase A染色工作液500 μL，室溫下避光反應(yīng)60 min，采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期的變化。

1.2.5 炎癥因子的測(cè)定 按1.2.2方法處理細(xì)胞后，收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，4 ℃ 3000 r/min離心20 min，BRL大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-8含量分別按TNF-α、IL-8 Elisa檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。TNF-α、IL-8標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程分別為y=0.0042x+0.0439（R2=0.9912，0～320 pg/mL）和y=0.0069x+0.0014（R2=0.9992，0～240 pg/mL）。

1.2.6 Caspase-3活化程度的測(cè)定 按1.2.2方法處理細(xì)胞后，各孔均加入0.5 mL的1% Triton X-100裂解細(xì)胞，充分吹打混勻，無(wú)菌離心管收集培養(yǎng)液，4 ℃ 1100 r/min離心5 min，取上清液。BRL大鼠肝細(xì)胞Caspase-3活化程度按Caspase-3活性測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 將處理好的蓋玻片（24×24 mm）放入6孔板中制備細(xì)胞爬片，然后按1.2.2方法處理細(xì)胞后，吸走上清液，使用通用組織固定液固定15～20 min，吸走固定液，用D-PBS清洗1～2次。使用免疫組化方法檢測(cè)相關(guān)因子蛋白表達(dá)水平，具體步驟有：細(xì)胞破膜、血清封閉、加COX-2/iNOS/IL-6一抗、加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、DAB顯色、復(fù)染細(xì)胞核、脫水封片，最后在顯微鏡下觀察并拍照（400×），并使用Image-Pro Plus 6.0軟件讀取積分光密度值定量分析蛋白表達(dá)情況。陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果為：若細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色至深棕黃色定義為陽(yáng)性，若只有細(xì)胞核著色，細(xì)胞質(zhì)不著色或細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)均不著色定義為陰性[24]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 地參游離酚對(duì)CCl4所致BRL大鼠肝細(xì)胞損傷細(xì)胞凋亡的影響

圖1中左上象限代表壞死細(xì)胞，左下象限代表正常細(xì)胞，右上象限代表晚期凋亡細(xì)胞，右下象限代表早期凋亡細(xì)胞。與正常組（圖1a）相比，CCl4模型組中凋亡細(xì)胞明顯增多，正常細(xì)胞明顯減少（圖1b）；經(jīng)不同濃度的地參游離酚干預(yù)后，凋亡細(xì)胞不斷減少，正常細(xì)胞逐漸增多（圖1c、d、e）。定量分析結(jié)果顯示（圖2），與正常組相比，CCl4模型組的正常細(xì)胞減少85.67%（P＜0.05），早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞分別增加32.92%和47.77%（P＜0.05），表明CCl4可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死。與CCl4模型組相比，0.4、0.8、1.6 mg/mL的地參游離酚干預(yù)組正常細(xì)胞分別增加27.16%、41.43%和68.00%（P＜0.05），早期凋亡細(xì)胞分別減少33.53%、37.89%、32.06%（P＜0.05），晚期凋亡細(xì)胞分別減少39.31%、36.16%、39.01%（P＜0.05），表明地參游離酚在一定程度上可以降低細(xì)胞凋亡率，抑制肝細(xì)胞壞死，從而發(fā)揮保護(hù)作用，這與喻銘佳[25]的研究結(jié)果一致。

圖1 地參游離酚對(duì)CCl4所致BRL大鼠肝細(xì)胞損傷細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effect of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. on cell apoptosis of BRL hepatocyte injured by CC14

圖2 地參游離酚對(duì)CCl4所致BRL大鼠肝細(xì)胞損傷細(xì)胞凋亡影響的定量分析Fig.2 Quantitative analysis of the effect of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. on cell apoptosis of BRL hepatocyte injured by CC14

2.2 地參游離酚對(duì)CCl4所致BRL大鼠肝細(xì)胞損傷細(xì)胞周期分布的影響

圖3中最高峰為G1期，最高峰前出現(xiàn)的小峰為sub-G1期（細(xì)胞凋亡峰），最高峰后面依次為S期和G2期。與正常組（圖3a）相比，CCl4模型組出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡峰（圖3b）；經(jīng)不同濃度的地參游離酚干預(yù)后，細(xì)胞凋亡峰逐漸降低（圖3c、d、e）。由圖4可以看出，相較于正常組而言，CCl4模型組中，處于sub-G1期的BRL大鼠肝細(xì)胞的比例顯著升高（P＜0.05），而處于G0/G1、G2/M期的肝細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.05）。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明CCl4可將BRL大鼠肝細(xì)胞大部分阻滯于sub-G1期，起到誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，此結(jié)果與WU等[26]的研究結(jié)果一致。與模型組相比，0.4、0.8、1.6 mg/mL的地參游離酚預(yù)處理后，BRL大鼠肝細(xì)胞的凋亡程度明顯降低，且隨著濃度的增加，處于sub-G1期的細(xì)胞比例逐漸下降（P＜0.05），G0/G1、G2/M期的比例不同程度升高（P＜0.05）。劉靜、步犁[27-28]的研究表明，當(dāng)DNA分子受損時(shí)，細(xì)胞周期會(huì)停滯在G0/G1期以便讓DNA進(jìn)行修復(fù)，若修復(fù)成功則進(jìn)行正常分裂增殖。本研究結(jié)果表明地參游離酚能抑制細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞阻滯在G0/G1期并能正常修復(fù)，從而發(fā)揮保護(hù)肝細(xì)胞損傷的作用。

圖3 地參游離酚對(duì)CCl4所致BRL大鼠肝細(xì)胞損傷細(xì)胞周期的影響Fig.3 Effect of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. on cell cycle of BRL hepatocyte injured by CC14

圖4 地參游離酚對(duì)CCl4所致BRL大鼠肝細(xì)胞損傷細(xì)胞周期分布影響的定量分析Fig.4 Quantitative analysis of the effect of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. on cell cycle of BRL hepatocyte injured by CC14

2.3 地參游離酚對(duì)CCl4所致BRL大鼠肝細(xì)胞損傷TNF-α、IL-8和Caspase-3的影響

TNF-α主要由活化的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，其在機(jī)體中存在的水平高低與機(jī)體對(duì)應(yīng)的炎癥嚴(yán)重程度呈現(xiàn)出正相關(guān)的趨勢(shì)，并作為體內(nèi)重要的炎性因子之一，在肝損傷中發(fā)揮重要作用[29-30]。IL-8是機(jī)體內(nèi)重要的中性粒細(xì)胞趨化因子，其通過(guò)激活中性粒細(xì)胞，促進(jìn)胞內(nèi)溶酶體活化和吞噬，進(jìn)而引起局部炎癥反應(yīng)[31-32]。綜上所述，TNF-α、IL-8兩種細(xì)胞因子在體內(nèi)的水平高低，可作為監(jiān)測(cè)指標(biāo)，較敏感地反映出體內(nèi)肝臟的損傷程度。

由表1可知，與正常組相比，CCl4模型組肝細(xì)胞中TNF-α和IL-8的含量均顯著升高（P＜0.05），表明CCl4所致肝細(xì)胞損傷產(chǎn)生了大量的活性氧自由基，破壞了肝細(xì)胞內(nèi)氧化還原的穩(wěn)態(tài)，從而使肝細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生了大量炎癥介質(zhì)[33-34]。與模型組相比，經(jīng)地參游離酚處理的大鼠肝細(xì)胞中TNF-α和IL-8的含量均有不同程度的降低（P＜0.05），表明地參游離酚能夠在一定程度上抑制促炎因子的表達(dá)，減輕肝損傷的炎癥反應(yīng)。

表1 地參游離酚對(duì)CCl4所致BRL大鼠肝細(xì)胞損傷TNF-α、IL-8和Caspase-3的影響Table 1 Effect of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. on TNF-α、IL-8 and Caspase-3 of BRL hepatocyte injured by CC14

Caspase-3是Caspase家族的核心酵素（一類天冬氨酸或半胱氨酸蛋白酶），被稱為“死亡蛋白酶”。在細(xì)胞降解過(guò)程中，Caspase-3活化后，對(duì)應(yīng)的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及細(xì)胞骨架的重要蛋白質(zhì)會(huì)呈現(xiàn)出降解失活的狀態(tài)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[35]。因此，Caspase-3的活化程度可以從側(cè)面反映出細(xì)胞的凋亡水平。

由表1可知，與正常組相比，CCl4模型組肝細(xì)胞中Caspase-3活化程度增加了44.95%（P＜0.05），表明CCl4作用于肝細(xì)胞后，通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化等途徑激活了Caspase-3，使其在肝細(xì)胞中廣泛表達(dá)，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡[36-37]。與模型組相比，0.4、0.8、1.6 mg/mL地參游離酚組Caspase-3活化程度分別減少了17.03%、19.69%和16.37%（P＜0.05）。表明地參游離酚可降低Caspase-3的活化程度，抑制凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

2.4 地參游離酚對(duì)CCl4所致BRL大鼠肝細(xì)胞損傷COX-2、iNOS和IL-6蛋白表達(dá)水平的影響

由圖5可以看出，正常組細(xì)胞質(zhì)呈淺藍(lán)色，而模型組細(xì)胞質(zhì)呈淺棕或棕褐色，表明CCl4誘導(dǎo)損傷的肝細(xì)胞中COX-2、iNOS、IL-6蛋白表達(dá)不同程度的增加。與模型組相比，隨著地參游離酚處理濃度的升高，細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性染色深度逐漸下降，表明細(xì)胞中的COX-2、iNOS、IL-6蛋白含量隨地參游離酚濃度的升高而逐漸降低。定量分析結(jié)果（圖6）進(jìn)一步表明，與正常組相比，CCl4模型組肝細(xì)胞中COX-2、iNOS、IL-6蛋白表達(dá)顯著增高（P＜0.05）。與模型組相比，地參游離酚不同劑量干預(yù)組均能夠不同程度降低細(xì)胞中由CCl4所致的COX-2、iNOS蛋白表達(dá)的升高（P＜0.05）；0.8和1.6 mg/mL地參游離酚干預(yù)組能顯著降低IL-6蛋白的表達(dá)（P＜0.05）?？傮w而言，研究結(jié)果表明，機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)或氧化應(yīng)激時(shí)，促炎性酶COX-2，iNOS及致炎性因子IL-6等的表達(dá)顯著升高。地參游離酚預(yù)處理后，肝細(xì)胞中COX-2、iNOS、IL-6蛋白表達(dá)不同程度降低，表明地參游離酚可抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮對(duì)CCl4所致肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

圖5 地參游離酚對(duì)BRL大鼠肝細(xì)胞損傷COX-2、iNOS、IL-6表達(dá)水平的影響（400×）Fig.5 Effect of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz. on expression levels of COX-2, iNOS and IL-6 of BRL hepatocyte injured by CC14（400×）

圖6 COX-2、iNOS、IL-6表達(dá)水平的定量分析結(jié)果Fig.6 Quantitative analysis results of COX-2, iNOS and IL-6

3 結(jié)論

地參游離酚能顯著降低CCl4引起的細(xì)胞凋亡，通過(guò)減少sub-G1期細(xì)胞、增加G0/G1期、G2/M期細(xì)胞影響細(xì)胞周期的分布，并顯著降低炎癥因子TNFα、IL-8的含量及阻滯Caspase-3的活化程度，且不同程度降低COX-2、iNOS和IL-6蛋白的表達(dá)水平，從而發(fā)揮肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。其機(jī)制可能與炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，今后可深入揭示地參游離酚對(duì)肝損傷保護(hù)作用的抗炎分子機(jī)制。研究結(jié)果初步表明，地參游離酚可用于肝臟炎性疾病的預(yù)防，可為天然抗炎護(hù)肝藥物的研發(fā)和臨床應(yīng)用提供借鑒，同時(shí)為地參的開(kāi)發(fā)和利用開(kāi)拓了新的方向。