枯草芽孢桿菌LY-05發(fā)酵玉竹產(chǎn)水溶性多糖工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

劉玉潔，董麗婷，羅 燦，陳?ài)渴妫镍P騰，王 征,

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410000；2.湖南省暢想農(nóng)業(yè)科技有限公司，湖南張家界 427000）

玉竹（Polygonatum odoratum（Mill.）Druce）為百合科（Liliaceae）黃精屬（Polygonatum）植物[1]，又名萎蕤，最早出現(xiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有悠久的藥用歷史[2]。其化學(xué)成分復(fù)雜，主要包括多糖類、黃酮類、甾體皂苷、生物堿及其揮發(fā)性油等[3]，具有降血糖、抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等多種藥理作用[4-6]，其主要活性成分為多糖類化合物。研究發(fā)現(xiàn)，玉竹多糖可用于治療免疫低下[7]、肥胖[8-9]、非酒精性脂肪肝[9]、糖尿病[10]等疾病。

利用益生菌發(fā)酵中草藥可提高有效成分的提取率，提高藥效的特點(diǎn)。眾多研究表明，芽孢桿菌發(fā)酵可產(chǎn)多種酶類物質(zhì)，能降解植物細(xì)胞壁成分，釋放多糖[11]。郭云霞等[12]利用篩選的芽孢桿菌N-14發(fā)酵黃芪，經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化后多糖得率為發(fā)酵前的1.57倍。武洪志等[13]利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵復(fù)方中藥（蒼術(shù)、白術(shù)、黃柏、板藍(lán)根、甘草、山楂），優(yōu)化發(fā)酵工藝后多糖含量顯著提高。近年來(lái)有研究指出，中草藥經(jīng)微生物發(fā)酵具有更高的抗氧化活性。WANG等[14]用四株益生菌混合發(fā)酵白芷根，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵白芷根具有更強(qiáng)的抗酪氨酸酶活性和抗氧化活性。李暄[15]利用釀酒酵母菌和枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵麩皮，其抗氧化活性顯著性增強(qiáng)。CAO等[16]的研究中發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌 SN-1發(fā)酵產(chǎn)生胞外多糖具有良好的抗氧化活性。近年來(lái)，益生菌發(fā)酵中草藥的研究屢見(jiàn)不鮮，利用玉竹進(jìn)行發(fā)酵卻鮮有報(bào)道。玉竹多糖含量高，利用率低。利用微生物發(fā)酵可降解植物細(xì)胞壁，釋放胞內(nèi)活性物質(zhì)，課題組前期利用不同的益生菌對(duì)玉竹進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)多糖篩選，發(fā)現(xiàn)一株枯草芽孢桿菌LY-05發(fā)酵玉竹后產(chǎn)水溶性多糖含量最高，可作為微生態(tài)與中草藥發(fā)酵等研究領(lǐng)域的潛在菌株，因此對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化研究具有一定的價(jià)值。

本文選用枯草芽孢桿菌LY-05，采用液體深層發(fā)酵技術(shù)和單因素實(shí)驗(yàn)法研究玉竹發(fā)酵產(chǎn)水溶性多糖的工藝條件。在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken試驗(yàn)法設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)對(duì)玉竹發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期提高玉竹多糖的得率。并對(duì)發(fā)酵與未發(fā)酵的玉竹多糖進(jìn)行抗氧化活性比較，為玉竹多糖的工業(yè)化生產(chǎn)及其功能性產(chǎn)品開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌LY-05（Bacillus subtilis） 保存于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物研究室；玉竹（Polygonatum odoratum） 采摘于湖南省婁底市；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2 ,2’-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS） 上海麥克林生化科技有限公司；

TYSP-400高速多功能粉碎機(jī) 浙江省永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司；PL303電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TGL18W臺(tái)式高速離心機(jī) 長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；UV1802G紫外分光光度計(jì) 天津冠澤科技有限公司；Epoch酶標(biāo)儀BioTek Instruments,Inc。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 斜面培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母提取粉0.5%，氯化鈉1%，瓊脂2%，蒸餾水1000 mL，pH7.2～7.5。

液體種子培養(yǎng)基：成分同斜面培養(yǎng)基，但不加瓊脂粉。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：玉竹5%，胰蛋白胨3%，氯化鈉1%，蒸餾水1000 mL，pH7.2～7.5。

上述培養(yǎng)基均在115 ℃條件下滅菌30 min。

1.2.2 菌種活化與培養(yǎng)

1.2.2.1 菌種活化 將甘油保存的枯草芽孢桿菌LY-05接種到液體種子培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，重復(fù)活化2次，備用。

1.2.2.2 種子液培養(yǎng) 將活化的斜面菌種接種于液體種子培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)24 h，備用。

1.2.2.3 發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)成熟的液體種子按2%（V/V）接種量接種至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)48 h。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 玉竹粉添加量 分別改變基礎(chǔ)發(fā)酵培基中玉竹添加量為2%、3%、4%、5%、6% ，胰蛋白胨3%，NaCl 1%，蒸餾水100 mL，接種量2%，37 ℃，180 r/min搖床發(fā)酵48 h，另設(shè)置添加相同含量玉竹粉且不接種的處理為對(duì)照組，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中多糖含量。

1.2.3.2 氮源種類 玉竹添加量4%，分別改變氮源的種類為氯化銨、硫酸銨、胰蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏、豆粕，添加量均為3%，NaCl 1%，蒸餾水100 mL，接種量2%，37 ℃，180 r/min搖床發(fā)酵48 h，另設(shè)置添加不同氮源且不接種的處理為對(duì)照組，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中多糖含量。

1.2.3.3 鹽離子種類 玉竹添加量4%，酵母提取物3%，分別改變無(wú)機(jī)鹽種類為NaCl、 KCl、MgSO4、CaCl2、FeCl3、MnSO4，添加量均為1%，蒸餾水100 mL，接種量2%，37 ℃，180 r/min搖床發(fā)酵48 h，另設(shè)置添加不同鹽離子且不接種的處理為對(duì)照組，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中多糖含量。

1.2.3.4 接種量 玉竹添加量4%，酵母提取物3%，NaCl 1%，蒸餾水100 mL，分別改變接種量為1%、2%、3%、4%、5%，37 ℃，180 r/min搖床發(fā)酵48 h，另設(shè)置不接種的無(wú)菌培養(yǎng)基為對(duì)照組，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中多糖含量。

1.2.3.5 培養(yǎng)溫度 玉竹添加量4%，酵母提取物3%， NaCl 1%，蒸餾水100 mL，接種量4%，分別改變培養(yǎng)溫度為31、33、35、37、39 ℃，180 r/min搖床發(fā)酵48 h，另設(shè)置不同培養(yǎng)溫度且不接種的處理為對(duì)照組，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中多糖含量。

1.2.3.6 轉(zhuǎn)速 玉竹添加量4%，酵母提取物3%，NaCl 1%，蒸餾水100 mL，接種量4%，溫度35 ℃，分別改變搖床轉(zhuǎn)速為140、160、180、200、220 r/min，發(fā)酵48 h，另設(shè)置不同轉(zhuǎn)速且不接種的處理為對(duì)照組，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中多糖含量。

1.2.3.7 發(fā)酵時(shí)間 玉竹添加量4%，酵母提取物3%，NaCl 1%，蒸餾水100 mL，接種量4%，溫度35 ℃，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，分別改變發(fā)酵時(shí)間為12、24、36、48、60、72 h，另設(shè)置不同發(fā)酵時(shí)間且不接種的處理為對(duì)照組，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中多糖含量。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken（BBD）設(shè)計(jì)原理，選擇接種量、培養(yǎng)溫度、發(fā)酵時(shí)間為自變量，以多糖含量提高率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。因素水平設(shè)計(jì)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.5 水溶性多糖含量測(cè)定 水溶性多糖提取及多糖含量測(cè)定：參照文獻(xiàn)[17]提供的方法稍作改動(dòng)。水溶性多糖含量提高率計(jì)算公式如下：

式中：水溶性多糖含量提高率為發(fā)酵處理組相對(duì)對(duì)照組的多糖含量提高得率，全文統(tǒng)一為提高率。

1.2.6 玉竹多糖提取物的制備 根據(jù)前期優(yōu)化工藝進(jìn)行發(fā)酵，分別將未發(fā)酵組（未添加發(fā)酵菌，其余處理步驟與發(fā)酵組相同）與發(fā)酵組離心（10000 r/min，10 min）收集上清液，減壓濃縮至200 mL，以4:1的體積比加入Sevage（氯仿:正丁醇=4:1）試劑，振蕩30 min，離心（4000 r/min，10 min），收集上清液，重復(fù)兩次。脫蛋白后的多糖溶液加入經(jīng)預(yù)處理的AB-8大孔樹(shù)脂進(jìn)行脫色處理，振蕩2 h，抽濾，收集樣液。樣液濃縮至一定體積后加入3倍無(wú)水乙醇，放于4 ℃冰箱過(guò)夜，離心（10000 r/min，10 min），沉淀復(fù)溶于去離子水。使用8000～14000 Da透析袋透析48 h，期間多次換水，透析液冷凍干燥得未發(fā)酵玉竹多糖（ POP1）、發(fā)酵后玉竹多糖（POP2）。

1.2.7 玉竹多糖抗氧化活性測(cè)定

1.2.7.1 DPPH自由基清除率 參照LIANG等[18]的方法并稍作改進(jìn)。吸取100 μL不同濃度的POP1、POP2水溶液及VC溶液（0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL）于96孔板，分別加入0.4 mmol/L的無(wú)水乙醇-DPPH溶液15 μL，充分混勻，避光反應(yīng)30 min，517 nm處檢測(cè)樣品吸光值。去離子水代替樣品為樣品空白對(duì)照，VC為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)水乙醇代替DPPH溶液為背景對(duì)照。

按下列公式計(jì)算：

式中：A0：空白組在517 nm的吸光值；A1：樣品組在517 nm的吸光值；A2：背景組在517 nm的吸光值。

1.2.7.2 ABTS自由基清除率 參照柴美靈等[19]的方法并稍作改進(jìn)。配制7 mmol/L的ABTS甲醇溶液和15 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液，等體積混合后，室溫避光保存12 h，用甲醇稀釋ABTS+·溶液，直至732 nm處的吸光值為（0.70±0.02），制得ABTS＋·溶液。吸取20 μL不同濃度的POP1、POP2溶液于96孔板，接著加入150 μL ABTS＋·工作液，室溫避光反應(yīng)30 min，732 nm處檢測(cè)樣品吸光值。去離子水代替樣品為空白對(duì)照，VC為陽(yáng)性對(duì)照，甲醇代替ABTS＋·溶液為背景對(duì)照。

按下列公式計(jì)算：

式中：A3：空白組在732 nm的吸光值；A4：樣品組在732 nm的吸光值；A5：背景組在732 nm的吸光值。

1.2.7.3 OH·自由基清除率 參照宗鑫妍等[20]的方法并稍作改進(jìn)。吸取50 μL不同濃度的POP1、POP2溶液至96孔板，分別加入等體積的硫酸亞鐵溶液（6.0 mmol/L）、過(guò)氧化氫溶液（6.0 mmol/L）、水楊酸-醇溶液（9.0 mmol/L），37 ℃孵育1 h，于517 nm 測(cè)定吸光值。去離子水代替樣品為空白對(duì)照，VC為陽(yáng)性對(duì)照，甲醇代替水楊酸溶液為背景對(duì)照。

按下列公式計(jì)算：

式中：A6：空白組在517 nm的吸光值；A7：樣品組在517 nm的吸光值；A8：背景組在517 nm的吸光值。

1.2.7.4 總還原力測(cè)定 參照Z(yǔ)ONG等[21]的方法并稍作改進(jìn)后進(jìn)行測(cè)定。吸取250 μL POP1、POP2溶液和250 μL磷酸緩沖液（pH6.6，0.2 mol/L）與250 μL 1%鐵氰化鉀溶液混合均勻，放于50 ℃充分反應(yīng)30 min，加入250 μL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)，離心，取上清液100 μL，加入100 μL蒸餾水和20 μL 0.1%氯化鐵溶液，混合靜置30 min，在700 nm處測(cè)定吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

上述試驗(yàn)均設(shè)置三次重復(fù)，試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS25.0軟件進(jìn)行分析，測(cè)定結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)錯(cuò)誤（SEM）”表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異為P＜0.05。采用Design Expert 12.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，GraphPad Prism 8繪圖軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 玉竹粉添加量對(duì)多糖提高率的影響 圖1為玉竹粉添加量對(duì)益生菌發(fā)酵玉竹產(chǎn)水溶性多糖的影響，由圖可知，在一定添加量范圍內(nèi)，隨著玉竹粉添加量的增加，多糖提高率也隨之增加。當(dāng)玉竹添加量為4%時(shí)，提高率達(dá)到（59.23%±5.16%），但玉竹粉添加量超過(guò)4%，提高率明顯下降。原因可能是玉竹粉添加量過(guò)大，枯草芽孢桿菌產(chǎn)出的纖維素酶、淀粉酶不足以酶解因增加玉竹粉帶來(lái)的更多淀粉和纖維素。而且，由于玉竹化學(xué)成分黃酮類、生物堿等生物活性物質(zhì)含量增高，減緩和抑制了枯草芽孢桿菌LY-05的生長(zhǎng)和代謝。故選擇玉竹粉添加量為4%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 玉竹添加量對(duì)多糖提高率的影響Fig.1 Effects of Polygonatum odoratum addition on increasing rate of polysaccharides

2.1.2 氮源種類對(duì)多糖提高率的影響 等氮條件下，在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入酵母提取物、胰蛋白胨、牛肉膏、豆粕、氯化銨，硫酸銨，考察不同氮源種類對(duì)多糖提高率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2結(jié)果表明，以酵母提取物為唯一氮源時(shí)，提高率達(dá)到（55.48%±3.86%），明顯高于其他氮源處理組，同時(shí)也可以看出，以無(wú)機(jī)氮為唯一氮源時(shí)，多糖提高率均較低，說(shuō)明無(wú)機(jī)氮不適合枯草芽孢桿菌LY-05發(fā)酵玉竹產(chǎn)多糖。因此，選擇酵母提取物進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 氮源對(duì)多糖提高率的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on the increasing rate of polysaccharides

2.1.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)多糖提高率的影響 不同無(wú)機(jī)鹽在培養(yǎng)基中的作用不同，如Na+調(diào)節(jié)細(xì)胞通透性，K+可作為某些酶的輔助因子，Mg2+可作為糖酵解（EMP）的酶激活劑。從圖3可以看出，本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基添加NaCl多糖提高率達(dá)到（57.95%±4.13%），效果提升最明顯，其次是MgSO4、KCl、MnSO4、FeCl3，添加CaCl2效果最差，提高率為（40.05%±6.38%），與添加NaCl的效果有顯著差別（P＜0.05）。在發(fā)酵的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生酸類物質(zhì)，培養(yǎng)基中添加NaCl具有維持pH穩(wěn)定，調(diào)節(jié)細(xì)胞通透性的功能，故培養(yǎng)基中添加NaCl作為鹽離子是適宜的選擇。

圖3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)多糖提高率的影響Fig.3 Effect of inorganic salt on the increasing rate of polysaccharides

2.1.4 接種量對(duì)多糖提高率的影響 由圖4可以看出，接種量在1%～3%范圍內(nèi)，多糖提高率隨接種量的增加逐漸增大。當(dāng)接種量3%時(shí)，提高率為（54.28%±3.15%），繼續(xù)加大接種量，多糖提高率明顯下降。原因是接種量過(guò)大，導(dǎo)致發(fā)酵前期培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過(guò)快及菌體生物量增加，影響了發(fā)酵中后期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)及培養(yǎng)基中的溶氧量，從而影響了枯草芽孢桿菌LY-05的生長(zhǎng)和代謝。故選擇3%的接種量進(jìn)行后續(xù)研究。

圖4 接種量對(duì)多糖提高率的影響Fig.4 Effect of inoculation amount on the increasing rate of polysaccharides

2.1.5 溫度對(duì)多糖提高率的影響 菌體的生長(zhǎng)需要一個(gè)適宜的溫度，低于最適溫度，部分菌體新陳代謝和產(chǎn)酶活力都處于低水平，溫度過(guò)高時(shí)，釋放的酶量和活力都受到影響，則菌體生長(zhǎng)受到抑制。如圖5，溫度對(duì)玉竹多糖提高率的影響呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)培養(yǎng)溫度為35 ℃，提高率最大為（55.53%±5.10%），說(shuō)明此溫度有可能是枯草芽孢桿菌LY-05生長(zhǎng)的最適溫度。故選擇35 ℃為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵溫度。

圖5 溫度對(duì)多糖提高率的影響Fig.5 Effect of temperature on the increasing rate of polysaccharides

2.1.6 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)多糖提高率的影響 枯草芽孢桿菌為典型的好氧型細(xì)菌，培養(yǎng)基中溶解氧的量與菌體生殖存在密切關(guān)系。在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)中，搖床轉(zhuǎn)速是溶解氧的調(diào)節(jié)方式之一。在裝液量同樣的條件下，轉(zhuǎn)速過(guò)低，發(fā)酵瓶中溶解氧量低，菌體未能充分接觸氧氣，難以滿足菌體的好氧呼吸。轉(zhuǎn)速過(guò)高，代謝產(chǎn)物增加，產(chǎn)生泡沫，會(huì)抑制氧與液體的接觸，也影響供養(yǎng)，因此轉(zhuǎn)速過(guò)高過(guò)低都不利于菌體的增長(zhǎng)。圖6可以看出，轉(zhuǎn)速為160 r/min時(shí)，體系中多糖提高率明顯增高，達(dá)（56.72%±3.48%），當(dāng)轉(zhuǎn)速增加至180 r/min，提高率并無(wú)顯著差異（P＞0.05），隨著轉(zhuǎn)速繼續(xù)增大，多糖提高率趨于降低。在生產(chǎn)過(guò)程中，出于成本考慮，應(yīng)選擇160 r/min進(jìn)行發(fā)酵為宜。

圖6 轉(zhuǎn)速對(duì)多糖提高率的影響Fig.6 Effect of stirring speed on the increasing rate of polysaccharides

2.1.7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)多糖提高率的影響 菌體的生長(zhǎng)包括四個(gè)階段，延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期及衰老期，一般來(lái)說(shuō)，菌體生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定后便逐漸進(jìn)入衰老階段。如圖7在接種量3%，溫度35 ℃，轉(zhuǎn)速160 r/min的條件下，發(fā)酵時(shí)間為48 h，多糖提高最多，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，多糖提高率下降，原因?yàn)槎嗵窍乃俾蚀笥谏a(chǎn)速率，多糖產(chǎn)生其他代謝物，致使多糖產(chǎn)率降低。發(fā)酵48 h玉竹多糖提高率達(dá)到（54.87%±3.30%），說(shuō)明48 h為枯草芽孢桿菌LY-05發(fā)酵的最佳時(shí)間。

圖7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)多糖提高率的影響Fig.7 Effect of fermentation period on the increasing rate of polysaccharides

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 以接種量（A）、溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）三個(gè)因素為自變量，多糖提高率（Y）為響應(yīng)值，采用Design-Expert 12.0軟件進(jìn)行多元回歸分析，得到回歸模型方程：Y=71.23+3.8A-1.71B+3.12C-0.89AB+0.14AC+1.03BC-5.07A2-6.78B2-7.81C2，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experimental

由表3可以看出，此模型的P值為0.0003＜0.0001，模型差異性極顯著，失擬項(xiàng)的P值為0.8845＞0.05，差異不顯著，說(shuō)明該模型擬合程度較好，能夠充分解釋響應(yīng)值的變異。決定系數(shù)R2為0.9884，預(yù)測(cè)值R2為0.9363，調(diào)整后R2為0.9676，均達(dá)到0.9以上，說(shuō)明模型的可信度高，真實(shí)值與預(yù)測(cè)值之間具有高相關(guān)性，可以對(duì)多糖提高率進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。表中顯示，A（接種量）、B（溫度）、C（發(fā)酵時(shí)間）對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵玉竹產(chǎn)多糖均存在影響，大小順序?yàn)锳＞C＞B，交互項(xiàng)AB、AC、BC不顯著（P＞0.05），二次項(xiàng)A2、B2、C2的P值均小于0.001，說(shuō)明其對(duì)多糖提高率的影響達(dá)到顯著水平。

表3 回歸模型顯著性及方差分析表Table 3 Significance and variance analysis of regression model

2.2.2 各因素之間的交互作用結(jié)果分析 圖8為接種量、溫度、發(fā)酵時(shí)間對(duì)多糖提高率的影響程度三維曲面圖，存在最優(yōu)值。隨著溫度升高與接種量的增加，提高率增大，當(dāng)二者交互作用達(dá)到峰值時(shí)，提高率逐漸下降；隨著發(fā)酵時(shí)間和接種量的增加，提高率不斷增大，達(dá)到最佳后，開(kāi)始出現(xiàn)下降趨勢(shì)；隨著發(fā)酵時(shí)間和溫度的變化，多糖提高率先上升后下降。

圖8 各因素交互作用對(duì)多糖提高率的影響的曲面圖與等高線Fig.8 3D surface and contour plot for effects of the interaction between each factor on the increasing rate of polysaccharides

2.2.3 響應(yīng)面結(jié)果優(yōu)化及模型驗(yàn)證 數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)最佳結(jié)果：接種量3.40%、溫度34.73 ℃、發(fā)酵時(shí)間50.33 h，此時(shí)的多糖提高率達(dá)到72.42%?？紤]到試驗(yàn)操作的可行性，對(duì)發(fā)酵工藝參數(shù)做出修正，為了驗(yàn)證模型的可靠性，將修正后的發(fā)酵工藝：玉竹添加量4%、酵母提取物3%，氯化鈉1%，接種量3%、溫度35 ℃、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，發(fā)酵時(shí)間48 h進(jìn)行重復(fù)3次試驗(yàn)，取平均值，多糖提高率為71.78%。實(shí)際值與理論值無(wú)顯著性差異，表明該模型可靠，可用于枯草芽孢桿菌LY-05發(fā)酵玉竹產(chǎn)多糖的預(yù)測(cè)。

2.3 抗氧化測(cè)定

抗壞血酸（VC）具有較強(qiáng)的抗氧化活性，一般被用作抗氧化活性檢測(cè)的對(duì)照品。本文以VC為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)發(fā)酵與未發(fā)酵的兩種玉竹多糖提取物進(jìn)行抗氧化活性指標(biāo)檢測(cè)，結(jié)果如圖9所示。兩類多糖對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基、OH自由基均具有清除能力，隨著多糖濃度升高，自由基清除率增大，清除率與多糖濃度存在依賴性。在4 mg/mL的多糖濃度下，自由基清除率最大。在相同的多糖濃度下，VC的自由基清除率最強(qiáng)，其次是POP2，最差是POP1。由圖9可知，4 mg/mL POP1對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基、OH自由基清除率分別為（40.35%±1.87%）、（41.38%±1.16%）、（47.52%±1.60%），POP2對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基、OH自由基清除率分別為（48.34%±1.66%）、（54.07%±0.9%）、（64.26%±0.91%）。總還原力的研究結(jié)果呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)，4 mg/mL POP1的OD700值為（0.91±0.01），POP2的OD700值為（1.11±0.00）。POP2對(duì)ABTS自由基清除的半抑制濃度（IC50）2.21 mg/mL，對(duì)OH自由基清除的半抑制濃度為0.49 mg/mL。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，POP2的抗氧化能力明顯強(qiáng)于POP1，存在差異的原因可能是，經(jīng)枯草芽孢桿菌LY-05 發(fā)酵后的多糖組分POP2的組成、分子量或結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，具體原因需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖9 POP1、POP2的體外抗氧化活性Fig.9 Antioxidant activity of POP1 and POP2 in vitro

3 討論

發(fā)酵菌株的選擇是中草藥發(fā)酵的關(guān)鍵，不同的發(fā)酵菌劑會(huì)產(chǎn)生不同的發(fā)酵效果,對(duì)于富含多糖的中藥材，多糖含量是評(píng)價(jià)中草藥發(fā)酵工藝優(yōu)化的一個(gè)重要檢測(cè)指標(biāo)。薛文娟[22]用嗜酸鏈球菌CIC20364及植物乳桿菌CICC794發(fā)酵佛手，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后粗多糖含量降低了60%。與本試驗(yàn)的發(fā)酵結(jié)果相反，可能的原因是，培養(yǎng)基中多糖被益生菌利用消耗。而李嘉懿等[23]利用植物乳桿菌植物和副干酪乳桿菌混合發(fā)酵中草藥（黃芪、三七、甘草、鷹嘴豆），發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后復(fù)方中藥液的多糖得率是優(yōu)化前的1.65倍，是未發(fā)酵的2.51倍。劉洋等[24]用產(chǎn)朊假絲酵母、干酪乳桿菌及糞腸球菌固態(tài)發(fā)酵復(fù)方中草藥（王不留行、益母草），發(fā)現(xiàn)經(jīng)發(fā)酵后粗多糖含量提高了55.42%。與本文選用枯草芽孢桿菌LY-05發(fā)酵玉竹，水溶性多糖提高71.78%的結(jié)果相似。這是因?yàn)槲⑸镌诎l(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生胞外酶[25]，如纖維素酶、果膠酶，可破壞中草藥植物的細(xì)胞壁，促進(jìn)胞內(nèi)活性物質(zhì)溶出。

微生物發(fā)酵受多種因素影響，如溫度、轉(zhuǎn)速、接種量、發(fā)酵時(shí)間等，本文通過(guò)單因素與響應(yīng)面法對(duì)此發(fā)酵工藝優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵溫度為35 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min，接種量3%，發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，發(fā)酵效果最佳，多糖含量提高了71.71%。眾多研究表明，適宜的發(fā)酵條件會(huì)促進(jìn)多糖析出。解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵當(dāng)歸，優(yōu)化發(fā)酵工藝后，當(dāng)歸多糖含量達(dá)到了發(fā)酵前的149.70%[26]。過(guò)多的接種量，導(dǎo)致菌株競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)，達(dá)到一定量，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，出現(xiàn)饑餓生長(zhǎng)，均不利于發(fā)酵。竇富超[27]用地衣芽孢桿菌SN02004-01發(fā)酵蛹蟲(chóng)草超微粉，發(fā)現(xiàn)在3%的接種量，發(fā)酵液中多糖含量最高。發(fā)酵時(shí)間太長(zhǎng)，代謝廢物的積累對(duì)發(fā)酵帶來(lái)負(fù)面影響。郭舒等[28]、武洪志等[29]均用枯草芽孢桿菌發(fā)酵中草藥等研究中，發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，多糖含量均顯著提高。發(fā)酵溫度與轉(zhuǎn)速也是影響發(fā)酵的重要因素，與發(fā)酵菌株的生長(zhǎng)密切相連，孔利華等[30]在優(yōu)化飼用枯草芽孢桿菌JY24發(fā)酵條件時(shí)，溫度為35 ℃下，發(fā)酵效果最佳。可見(jiàn)，不同的發(fā)酵條件對(duì)多糖的提取率大不相同，適宜的發(fā)酵條件對(duì)微生物發(fā)酵至關(guān)重要。

多糖在免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤和抗氧化、抗衰老等特性方面表現(xiàn)出廣泛的生物活性[31]。自由基的清除能力對(duì)其抗氧化活性有著積極的影響[32]，各類文獻(xiàn)中報(bào)道了不同來(lái)源的多糖顯示出不同的抗氧化能力，這可能與多糖的化學(xué)組成及分子結(jié)構(gòu)特性有關(guān)[33-34]。薛燕[35]在探究發(fā)酵前后鐵皮石斛多糖的抗氧化活性的研究中，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后總抗氧化能力、DPPH及ABTS自由基能力均有所提高，且發(fā)酵后多糖的分子量下降。羅游[36]研究了發(fā)酵前后番石榴葉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后多糖得率提高，抗氧化性增強(qiáng)，但分子量從697.61 kDa 下降至 633.28 kDa。本文測(cè)定發(fā)酵與未發(fā)酵玉竹多糖的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)兩類多糖均表現(xiàn)出一定的抗氧化能力，且POP2的抗氧化性強(qiáng)于POP1，與上述研究結(jié)果一致，由此可推測(cè)，益生菌發(fā)酵中草藥促進(jìn)胞內(nèi)多種物質(zhì)溶出，經(jīng)發(fā)酵后多糖的分子量或組成結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。需后續(xù)進(jìn)一步的研究來(lái)證明。

益生菌與中草藥結(jié)合是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的創(chuàng)新點(diǎn)，為中草藥及其功能性產(chǎn)品的研發(fā)開(kāi)辟新思路。目前，有關(guān)中藥玉竹的研究尚少，本試驗(yàn)采取益生菌發(fā)酵法來(lái)提高玉竹多糖的產(chǎn)率，該類方法條件溫和，操作簡(jiǎn)便，效果顯著，具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究中所涉及的原料配方仍存在一定的局限性，在生產(chǎn)過(guò)程中可作進(jìn)一步優(yōu)化或調(diào)整，從而達(dá)到更高的發(fā)酵水平和降低成本的目的。

4 結(jié)論

試驗(yàn)表明，枯草芽孢桿菌LY-05發(fā)酵玉竹能有效提高玉竹多糖的含量，最終確定優(yōu)化發(fā)酵工藝條件為：玉竹添加量4%、酵母提取粉3%，NaCl 1%，接種量3%、溫度35 ℃、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，發(fā)酵時(shí)間48 h。優(yōu)化發(fā)酵工藝對(duì)玉竹開(kāi)發(fā)利用具有一定參考價(jià)值；抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)枯草芽孢桿菌LY-05發(fā)酵后，玉竹多糖的自由基清除率及總還原力均有所提高。