雞蛋花多糖提取工藝優(yōu)化及生物活性研究

孫寧云，姚 欣，張英慧，楊安平，劉 輝,,

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山528225；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 廣東佛山528000）

雞蛋花為夾竹桃科（Apocynaceae）雞蛋花屬植物雞蛋花（Plumeria rubraLinn.cv. Acutifolia）的干燥花，別名緬梔子、蛋黃花等。原產(chǎn)于墨西哥，在我國(guó)主要分布于廣東、廣西、海南等省區(qū)[1]。雞蛋花是嶺南地區(qū)常用藥材，具有清熱、利濕、解暑之功效。民間常采其泡茶、煲湯，用于消暑。雞蛋花是“王老吉涼茶”、“五花茶”等廣式?jīng)霾璧闹饕浞讲牧现籟2]。由于雞蛋花的特殊香氣，其提取物可用作高級(jí)化妝品、香皂和食品添加劑?；瘜W(xué)成分研究表明雞蛋花主要含有三萜[3]、環(huán)烯醚萜[4-5]、黃酮[6]、糖類、脂肪族類等化合物[7-8]?，F(xiàn)代藥理研究表明雞蛋花提取物具有抗氧化[6]、抗菌[9]、抗腫瘤[10]、降血糖[11]等活性。多糖是廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中一種分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜且龐大的糖類物質(zhì)，具有抗氧化[12]、免疫調(diào)節(jié)[13]、抗腫瘤[14]、抗菌[15]、抗炎[16]、抗病毒[17]、降血糖及降血脂[18-19]等廣泛的生物活性。

不同雞蛋花屬的不同部位、不同溶劑提取物具有不同的藥理活性，如P. acuminate（leaves）甲醇提取物具有抗氧化和清除自由基的活性[20]，DAWOOD等[21]從白雞蛋花（Plumeria albaL.）葉中提取了粗多糖，并證明其具有較強(qiáng)的抗氧化能力。引入我國(guó)藥食同源的是黃雞蛋花(Plumeria rubraLinn.cv. Acutifolia）。廣式?jīng)霾杈哂徐钍顢』饸?，清熱解毒、生津止渴的功效。何蓉蓉等[22]以王老吉涼茶為藥物，通過(guò)葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察應(yīng)激和血糖代謝的關(guān)系，測(cè)定小鼠體內(nèi)氧化水平和抗氧化能力的變化。結(jié)果表明：王老吉涼茶不僅能降低血漿中丙二醛（MDA）的含量，同時(shí)能夠顯著提高體內(nèi)的抗氧化能力指數(shù)（ORAC）水平，可明顯緩解機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，改善糖代謝不足。

目前，對(duì)雞蛋花的研究主要集中在環(huán)烯醚萜類和揮發(fā)油方面，而關(guān)于雞蛋花多糖的研究鮮有報(bào)道。因此，本文首次對(duì)雞蛋花多糖提取工藝及抗氧化、抗菌、抗腫瘤活性進(jìn)行研究，為雞蛋花在食品、醫(yī)藥方面的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋花干燥花 采于中國(guó)科學(xué)院南海生物醫(yī)學(xué)藥科技產(chǎn)業(yè)中心；葡萄糖、苯酚、過(guò)硫酸鉀、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2‘-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、二甲基亞砜 上海麥克林生化科技有限公司；CCK-8細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒 亞科因（武漢）生物技術(shù)有限公司；LB培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清Biological Industries；胰酶、PBS 美國(guó)Gibco公司；青霉素、鏈霉素 上海撫生有限公司；菌種（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌） 廣東省微生物菌種保藏中心；細(xì)胞（A375細(xì)胞、B16細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞、DLD-1細(xì)胞） 中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞中心；其它化學(xué)試劑均為分析純。

060ST超聲波清洗器 深圳市華策科技有限公司；TG16-WS低溫高速離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；UV-2700 紫外分光光度計(jì) 島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；EPOCH 酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio Tek公司；LRH-150 智能生化培養(yǎng)箱 鄭州生元儀器有限公司；BB 5060 二氧化碳培養(yǎng)箱 致微（廈門）儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雞蛋花多糖（PRLAP）提取工藝 取雞蛋花干燥花粉末→石油醚脫脂→超聲輔助水提→提取液濃縮→離心→ Sevage法除蛋白質(zhì)→體積分?jǐn)?shù)95%乙醇沉淀→洗滌沉淀→冷凍干燥→雞蛋花多糖（PRLAP）。

將曬干的雞蛋花干燥花粉碎，過(guò)60目篩，得雞蛋花粉末，取500 g雞蛋花粉末放入10 L的三口瓶中，加入10倍體積的石油醚進(jìn)行脫脂、脫色至石油醚顏色接近無(wú)色，過(guò)濾，將雞蛋花濾渣放置烘箱中烘干，常溫下冷卻后，混勻轉(zhuǎn)移到保鮮袋中備用。稱取上述處理后的雞蛋花粉末1 g放置于50 mL三角瓶中。在一定超聲功率、液料比、提取時(shí)間和提取溫度下進(jìn)行PRLAP的提取，待提取液冷卻到室溫，在10000 r/min條件下離心1 min，用Sevage法除蛋白質(zhì)：取PRLAP溶液4 mL，氯仿-正丁醇（預(yù)先配制成體積比為4:1混合液）溶液1 mL，置于具塞試管中，充分振搖30 min后，10000 r/min離心1 min，然后將水相與氯仿相分開(kāi)，將水相再加入相當(dāng)于其體積1/4的氯仿-正丁醇溶液，重復(fù)上述過(guò)程，直至蛋白質(zhì)除掉。將除蛋白后的提取液用95%的乙醇4 ℃醇沉12 h，之后在10000 r/min條件下離心1 min，棄去上清液，將得到的醇沉物溶解于水中，最后冷凍干燥得雞蛋花多糖。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 稱取1 g雞蛋花粉末3份，固定料液比1:40（g/mL）、提取時(shí)間30 min，提取溫度40 ℃，分別測(cè)定超聲功率在216、240、264、288、312 W時(shí)PRLAP得率。

稱取1 g雞蛋花粉末3份，固定超聲功率288 W、提取時(shí)間30 min、提取溫度40 ℃，分別測(cè)定料液比在1:20、1:30、1:40、1:50、1:60（g/mL）時(shí)PRLAP得率。

稱取1 g雞蛋花粉末3份，固定超聲功率288 W、料液比1:50（g/mL）、提取溫度40 ℃，分別測(cè)定提取時(shí)間在10、20、30、40、50 min時(shí)PRLAP得率。

稱取1 g雞蛋花粉末3份，固定超聲功率288 W、料液比1:50（g/mL）、提取時(shí)間40 min，分別測(cè)定提取溫度在35、40、45、50、55 ℃時(shí)PRLAP得率。

1.2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化 雞蛋花多糖提取工藝根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇超聲功率、料液比、提取時(shí)間、提取溫度為自變量，多糖得率為因變量，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素設(shè)置見(jiàn)表1。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 The factors and levels of L9(34)orthogonal experiment

1.2.4 PRLAP的測(cè)定

1.2.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取真空干燥的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg定容到100 mL容量瓶中，配成0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL于大試管中，補(bǔ)加蒸餾水至1 mL，分別加入1 mL 5%苯酚，搖勻，再分別加入5 mL濃硫酸，于37 ℃水浴靜置30 min，在488 nm測(cè)吸光值。以葡萄糖濃度C為橫坐標(biāo)（mg/mL），吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A=0.0094C+0.0928，R2=0.993。

1.2.4.2 PRLAP含量測(cè)定 采用苯酚－硫酸法[23]進(jìn)行PRLAP含量的測(cè)定。準(zhǔn)確吸取樣品溶液1 mL于試管中，分別加5%苯酚溶液1 mL，振蕩搖勻，再分別加入濃硫酸5 mL，振蕩搖勻，于37 ℃水浴放置30 min，488 nm測(cè)定吸光值。根據(jù)測(cè)得的吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算PRLAP濃度。根據(jù)公式（1）計(jì)算PRLAP得率。

式中：c表示根據(jù)吸光度值計(jì)算出的雞蛋花多糖質(zhì)量濃度，g/mL；V表示提取液總體積，mL；n表示稀釋倍數(shù)；m表示雞蛋花取樣量，g。

1.2.5 PRLAP體外抗氧化活性研究

1.2.5.1 DPPH自由基清除率測(cè)定 根據(jù)WANG等[24]的方法稍作修改。取不同濃度（0.01562、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1 mg/mL）的PRLAP溶液以及相同濃度下的陽(yáng)性對(duì)照VC對(duì)DPPH自由基清除率進(jìn)行測(cè)定。步驟如下：實(shí)驗(yàn)組于96孔板中依次加入上述濃度下的PRLAP或VC50 μL、0.1 mmol/L的DPPH溶液150 μL；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組依次加入上述濃度下的PRLAP或VC50 μL、蒸餾水150 μL；空白對(duì)照組依次加入蒸餾水50 μL、0.1 mmol/L的DPPH溶液150 μL。室溫避光處理30 min，517 nm處測(cè)其吸光度，根據(jù)公式（2）計(jì)算PRLAP和VC的清除率：

式中: A1：不同濃度的PRLAP或VC加DPPH測(cè)得的吸光值；A2：不同濃度的PRLAP或VC加水測(cè)得的吸光值；A0：只加水和DPPH所測(cè)得的吸光度值。

1.2.5.2 ABTS自由基清除率測(cè)定 根據(jù)TANG等[25]的方法稍作修改。取不同濃度（0.01562、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1 mg/mL）的PRLAP溶液以及相同濃度下的陽(yáng)性對(duì)照VC對(duì)ABTS自由基清除率進(jìn)行測(cè)定。步驟如下：實(shí)驗(yàn)組于96孔板中依次加入上述濃度下的PRLAP或VC50 μL、7 mmol/L ABTS和4.95 mmol/L K2S2O8混合液150 μL；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組依次加入上述濃度下的PRLAP或VC50 μL、蒸餾水150 μL；空白對(duì)照組依次加入蒸餾水50 μL、7 mmol/L ABTS和4.95 mmol/L K2S2O8混合液150 μL。室溫避光處理30 min，734 nm處測(cè)其吸光值，根據(jù)公式（3）計(jì)算PRLAP和VC的清除率：

式中：A1表示不同濃度的PRLAP或VC加ABTS和K2S2O8混合液測(cè)得的吸光值；A2表示不同濃度的PRLAP或VC加水測(cè)得的吸光值；A0表示只加水和ABTS和K2S2O8混合液所測(cè)得的吸光度值。

1.2.5.3 OH自由基清除率測(cè)定 根據(jù)王迦琦等[26]的方法稍作修改。取不同濃度（0.01562、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1 mg/mL）的PRLAP溶液以及相同濃度下的陽(yáng)性對(duì)照VC對(duì)OH自由基清除率進(jìn)行測(cè)定。步驟如下：實(shí)驗(yàn)組于96孔板中依次加入預(yù)先配制9 mmol/L的FeSO4、上述濃度下的PRLAP或VC、9 mmol/L水楊酸以及8.8 mmol/L 30% H2O2各50 μL；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組依次加入9 mmol/L的FeSO4、上述濃度下的PRLAP或VC、蒸餾水以及8.8 mmol/L 30% H2O2各50 μL；空白對(duì)照組依次加入9 mmol/L的FeSO4、蒸餾水、9 mmol/L水楊酸以及8.8 mmol/L 30% H2O2各50 μL。搖床混勻，室溫靜置30 min后，510 nm處測(cè)其吸光度值，根據(jù)公式（4）計(jì)算PRLAP和VC的清除率：

式中：A1表示不同濃度的PRLAP或VC加入FeSO4、水楊酸、H2O2測(cè)得的吸光值；A2表示不同濃度的PRLAP或VC加入FeSO4、蒸餾水、H2O2測(cè)得的吸光值；A0表示蒸餾水加入FeSO4、水楊酸、H2O2測(cè)得的吸光度值。

1.2.6 PRLAP抑菌活性測(cè)定 采用微量肉湯稀釋法測(cè)PRLAP對(duì)供試菌的MIC。具體步驟如下：將大腸桿菌（Eco）、金黃色葡萄球菌（Sau）、銅綠假單胞菌（Pae）、肺炎克雷伯菌（Kpn）、鮑曼不動(dòng)桿菌（Ab）在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基接種后，于37 ℃培養(yǎng)24 h，制備105CFU/mL菌懸液和50 mg/mL PRLAP溶液。在96孔板中進(jìn)行樣品稀釋和接種，2～11孔每孔加入營(yíng)養(yǎng)肉湯100 μL，第12孔中加入營(yíng)養(yǎng)肉湯200 μL；第1孔中加入50 mg/mL PRLAP溶液200 μL，倍比稀釋至第10孔；1～11孔均加入100 μL菌液；37 ℃培養(yǎng)箱孵育16～18 h。此外需設(shè)置色素對(duì)照，96孔板中第1孔中加入50 mg/mL PRLAP溶液200 μL，2～11孔每孔加入營(yíng)養(yǎng)肉湯100 μL，第12孔加入營(yíng)養(yǎng)肉湯200 μL，最后1～11孔均加入100 μL菌液，用酶標(biāo)儀在600 nm測(cè)吸收值，將試驗(yàn)組1～10孔吸光值與色素對(duì)照組1～10孔吸光值做差，然后將差值與試驗(yàn)組第11孔（陽(yáng)性對(duì)照組）和第12孔（陰性對(duì)照組）結(jié)果作比較，差值接近試驗(yàn)組第12孔與色素對(duì)照第12孔之差的最小濃度為MIC。

1.2.7 PRLAP對(duì)腫瘤細(xì)胞活力的影響 采用CCK-8法測(cè)定PRLAP對(duì)腫瘤細(xì)胞活力抑制率。首先用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基將PRLAP配制成0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL 7個(gè)給藥濃度。在37 ℃飽和濕度、5% CO2條件下培養(yǎng)A375、DLD-1、B16和MCF-7細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，分裝到96孔板中，調(diào)整細(xì)胞濃度使每孔約5000個(gè)細(xì)胞，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取不同濃度（0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL）的PRLAP溶液，依次從低濃度到高濃度加入96孔板中，每孔100 μL，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。吸出孔內(nèi)溶液，然后向每孔內(nèi)加入100 μL含10% CCK-8試劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1～2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)吸收值，根據(jù)公式（5）計(jì)算細(xì)胞活力。

式中：A0表示空白對(duì)照吸光值；An表示加入樣品溶液吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為三次平行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)表示為Mean（平均值）±SD（標(biāo)準(zhǔn)差）。并采用Microsoft Office Excel 2019、SPSS 23.0及GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理、分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲功率對(duì)PRLAP得率的影響 從圖1可以看出，超聲功率在216～288 W范圍內(nèi)多糖得率隨功率升高而增大，到288 W時(shí)達(dá)到最大值為5.24%±0.12%，這是由于超聲波的空化作用使細(xì)胞易于破碎，有利于多糖析出。當(dāng)功率超過(guò)288 W時(shí)多糖得率下降，這可能是因?yàn)槌暪β蔬^(guò)大，對(duì)細(xì)胞的破壞作用增大，使多糖的糖苷鍵斷裂，引起多糖解聚從而使得得率降低[27-28]。因此，選取264、288、312 W進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖1 超聲功率對(duì)PRLAP得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power onthe yield of PRLAP

2.1.2 料液比對(duì)PRLAP得率的影響 由圖2可知，多糖得率隨料液比得增大而提高，到1:50（g/mL）時(shí)達(dá)到最大值為9.25%±0.08%，之后得率開(kāi)始下降。原因可能是溶劑與原料的比例越大，植物細(xì)胞內(nèi)部與外部溶劑的濃度差異越大，多糖的擴(kuò)散速度也越快，更多的多糖分子可溶于水中，從而提高得率。但如果繼續(xù)增加溶劑與原料的比例，水溶性多糖的濃度也會(huì)降低，導(dǎo)致溶劑揮發(fā)量增加，能量消耗增加，得率下降[29]。因此，選取1:40、1:50、1:60（g/mL）進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 料液比對(duì)PRLAP得率的影響Fig.2 Effect of ratio of raw materia to water on the yield of PRLAP

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)PRLAP得率的影響 從圖3可以看出，多糖得率在10～30 min范圍內(nèi)隨時(shí)間的增加而提高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，雞蛋花細(xì)胞破碎使多糖釋放，到30 min時(shí)達(dá)到最大值為9.78%±0.14%，但超聲波作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，空化作用力會(huì)使得提取物中部分多糖糖鏈?zhǔn)艿狡茐?，?dǎo)致得率下降[30]。因此選擇20、30、40 min進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖3 提取時(shí)間對(duì)PRLAP得率得影響Fig.3 Effect of extraction time on yield of PRLAP

2.1.4 提取溫度對(duì)PRLAP得率的影響 從圖4可以看出，雞蛋花多糖得率在40 ℃時(shí)達(dá)到最高值為13.34%±0.18%，隨著溫度的升高，多糖溶解度增加，因此多糖得率提高。當(dāng)提取溫度超過(guò)40 ℃時(shí)，多糖得率降低；可能是因?yàn)檩^高溫度會(huì)導(dǎo)致空化氣泡數(shù)目減少，空化效應(yīng)減弱從而導(dǎo)致多糖得率降低[31]。因此，選擇35、40、45 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4 提取溫度對(duì)PRLAP得率的影響Fig.4 Effect of extract temperature on yield of PRLAP

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

按1.2.3給出的水平來(lái)設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，得雞蛋花多糖最佳提取工藝參數(shù)，并考察各因素對(duì)雞蛋花多糖得率影響的主次順序。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment results

表3 PRLAP正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment of PRLAP

如表2所示，通過(guò)直觀分析得出影響雞蛋花多糖得率主次因素依次是提取溫度（D）＞提取時(shí)間（C）＞料液比（B）＞超聲功率（A），最佳提取工藝組合為A1B2C3D1，即超聲功率為264 W、料液比為1:50（g/mL）、提取時(shí)間為40 min、提取溫度為35 ℃。由表3方差分析可得，超聲功率、料液比、提取時(shí)間、提取溫度達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），說(shuō)明主效應(yīng)存在，四種因素會(huì)對(duì)雞蛋花多糖得率產(chǎn)生差異關(guān)系。

為了評(píng)價(jià)最佳提取工藝的穩(wěn)定性，稱取雞蛋花干燥花粉末3 g進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，多糖提取率分別為13.95%、13.98%和14.11%，平均值為14.01%±0.22%。相對(duì)偏差（RSD）為1.6%，表明該工藝重復(fù)性良好，適合雞蛋花多糖的提取。

2.3 PRLAP體外抗氧化活性測(cè)定

2.3.1 DPPH自由基清除能力 由圖5可知，PRLAP對(duì)DPPH的清除作用呈濃度依賴型，在0.016～0.500 mg/mL范圍內(nèi)隨著濃度的升高清除作用顯著增強(qiáng)，質(zhì)量濃度大于0.500 mg/mL后，清除作用增強(qiáng)緩慢，濃度到1 mg/mL時(shí)清除率可達(dá)到94.44%±0.17%，此濃度下VC對(duì)DPPH自由基的清除率為94.95%±0.63%，這時(shí)PRLAP對(duì)DPPH的清除率與VC相當(dāng)，說(shuō)明PRLAP具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的作用。PRLAP清除DPPH自由基的IC50為0.1934 mg/mL。DAWOOD等[21]研究表明白雞蛋花葉多糖濃度在3 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除率為84.18%。由此可知，PRLAP清除DPPH自由基的作用遠(yuǎn)強(qiáng)于白雞蛋花葉多糖。PRLAP可作為抗氧化劑進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。

圖5 PRLAP和VC對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of PRLAP and Vc on DPPH free radical scavenging rated

2.3.2 ABTS自由基清除能力 由圖6可知，PRLAP在0.016～0.500 mg/mL范圍內(nèi)隨著濃度的升高對(duì)ABTS自由基清除率顯著增強(qiáng)，質(zhì)量濃度大于0.500 mg/mL后，清除作用趨于平緩，多糖濃度為1 mg/mL時(shí)其對(duì)ABTS自由基的清除作用與VC接近，說(shuō)明PRLAP對(duì)ABTS自由基的清除能力較強(qiáng)。PRLAP清除ABTS自由基的IC50為0.2315 mg/mL。由此可知，PRLAP對(duì)ABTS自由基和DPPH自由基都具有較強(qiáng)的清除能力，這與文獻(xiàn)報(bào)道的金針菇多糖[24]具有相似的抗氧化活性。

圖6 PRLAP和VC對(duì)ABTS自由基清除率的影響Fig.6 Effect of PRLAP and Vc on ABTS free radical scavenging rated

2.3.3 OH自由基清除能力 由圖7可知，PRLAP對(duì)OH自由基具有一定的清除能力，隨著PRLAP濃度升高，清除率增強(qiáng)。當(dāng)濃度為1 mg/mL時(shí)OH自由基清除率可達(dá)到35.38%±3.20%，其清除效果與文獻(xiàn)報(bào)道的綠球藻多糖[32]和滑子菇多糖[33]相當(dāng)。PRLAP清除OH自由基的IC50為2.469 mg/mL。雖然PRLAP對(duì)OH自由基清除效果弱于VC，但具有一定的清除作用。上述可知，PRLAP對(duì)ABTS自由基和DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除作用，而對(duì)OH自由基清除效果較弱，這是因?yàn)槎嗵呛休^多羥基，可提供質(zhì)子與ABTS自由基和DPPH自由基反應(yīng)，達(dá)到抗氧化作用[34]。而OH自由基通常是以氧化其它物質(zhì)（親電加成反應(yīng)）而達(dá)到清除作用[35]，因此PRLAP對(duì)OH自由基的清除作用弱于ABTS自由基和DPPH自由基。

圖7 PRLAP和VC對(duì)OH自由基清除率的影響Fig.7 Effect of PRLAP and Vc on OH free radical scavenging rated

2.4 PRLAP體外抗菌活性評(píng)價(jià)

由表4可知，五種菌種的MIC順序?yàn)殂~綠假單胞菌=肺炎克雷伯菌=鮑曼不動(dòng)桿菌＞大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌，金黃色葡萄球菌的MIC最低為0.195 mg/mL，大腸桿菌的MIC相對(duì)較低為0.391 mg/mL，PRLAP對(duì)銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌的MIC相同均為1.562 mg/mL。結(jié)果表明PRLAP對(duì)以上五種菌種都有一定的抑制作用，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最好。該結(jié)果與THIN等[36]提取的Plumeria acutifoliaPoir.莖皮水提物抑菌活性具有一致性，其對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果最好，抑菌圈為12 mm。

表4 PRLAP的MICTable 4 Minimum inhibitory concentration of PRLAP

2.5 PRLAP體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)

從圖8可以看出，在3.125～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)，A375、B16、MCF-7細(xì)胞活力與多糖溶液濃度呈劑量依賴性，隨多糖濃度的增大而減小且與對(duì)照組相比具有顯著性差異（P＜0.05），說(shuō)明PRLAP對(duì)這三種腫瘤細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用，其中對(duì)MCF-7細(xì)胞活力抑制效果與DAWOOD等[37]研究結(jié)果近似，在6.25～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)短穗魚尾葵果實(shí)和叢櫚果實(shí)多糖對(duì)MCF-7細(xì)胞活力都有較好的抑制作用。而DLD-1細(xì)胞活力與空白對(duì)照相比變化不大，PRLAP對(duì)DLD-1細(xì)胞增殖抑制效果不明顯，說(shuō)明在此濃度范圍內(nèi)DLD-1對(duì)PRLAP不敏感。經(jīng)計(jì)算A375、B16、MCF-7細(xì)胞的IC50值分別為101.3、285.6、423.1 μg/mL。

圖8 PRLAP對(duì)腫瘤細(xì)胞活力的影響Fig.8 Effect of PRLAP on cell viability

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化了PRLAP提取工藝，分析得出超聲功率、料液比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)雞蛋花多糖得率的影響，并確定了最佳提取工藝：超聲功率264 W、料液比1:50（g/mL）、提取時(shí)間40 min、提取溫度35 ℃，在此條件下多糖得率為14.01%±0.22%，說(shuō)明此工藝提取參數(shù)可靠，提取效率高，適合PRLAP的提取。此外，PRLAP具有良好的體外抗氧化、抗菌、抗腫瘤活性?？寡趸瘜?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PRLAP對(duì)DPPH、ABTS自由基具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，當(dāng)濃度為1 mg/mL時(shí)，PRLAP對(duì)這兩種自由基的清除率可達(dá)90%以上，接近VC的效果，與DPPH和ABTS清除率相比PRLAP對(duì)OH自由基的清除能力稍弱，但也具有一定的抑制作用，由此可見(jiàn)，PRLAP可作為一種潛在的天然抗氧化劑應(yīng)用在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。此外，通過(guò)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌的MIC測(cè)定結(jié)果可知，雞蛋花多糖對(duì)上述供試菌均有一定的抑制作用，MIC分別為0.391、0.195、1.562、1.562、1.562 mg/mL，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，其MIC最小。本研究選取了A375、B16、DLD-1、MCF-7細(xì)胞來(lái)檢測(cè)PRLAP對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果表明除DLD-1細(xì)胞外，此多糖對(duì)A375、B16、MCF-7細(xì)胞活力均有一定的抑制效果，細(xì)胞活力隨PRLAP濃度的增大而減小，但其作用機(jī)制還有待深入研究。

本研究主要集中在雞蛋花多糖提取工藝、體外活性方面。此后還需要對(duì)PRLAP進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，并進(jìn)一步研究PRLAP與其活性之間的關(guān)系。此外，為了更好地確定PRLAP對(duì)人體健康的影響，必須進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床研究，使其在食品、醫(yī)藥和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用。