超聲輔助提取薰衣草總?cè)频墓に噧?yōu)化及體外抗氧化活性研究

尼格爾熱依·亞迪卡爾，鄧淑萍，白 玉，古麗皮耶·吾普爾

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

薰衣草是一種生長(zhǎng)在高溫低濕地區(qū)的香草植 物，我國(guó)主要產(chǎn)區(qū)在新疆伊犁并作為當(dāng)?shù)氐闹е?jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)之一，具有一定的市場(chǎng)規(guī)模[1]。薰衣草具有很高的利用價(jià)值，多加工生產(chǎn)成精油。精油是由不同類型的芳香族化合物組成的混合物[2]，因薰衣草精油具有鎮(zhèn)靜催眠[3]、抗菌[3]、抗氧化[4]等藥理活性，加之提取技術(shù)相對(duì)成熟，價(jià)格適宜，因此被開發(fā)成諸多深受人們喜愛的薰衣草精油產(chǎn)品。薰衣草殘?jiān)嘧鳛閺U料處理[5]，其非揮發(fā)性化學(xué)成分的價(jià)值不能得到充分發(fā)揮。薰衣草主要研究方向?yàn)樵耘嗯嘤齕6]、精油成分[7]和生物活性評(píng)價(jià)[8]，而其殘?jiān)幕瘜W(xué)成分鑒定及生物活性研究相對(duì)較少，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)薰衣草非揮發(fā)性部位分離得到了三萜類[9]、黃酮類[10]、苯丙素類[11]、酚類[12]、肉桂酸類[13]、咖啡酸類[14]等化合物，其中三萜類是一種在植物中廣泛分布的化合物類別，具有較好的抗氧化活性[15]。

植物中非揮發(fā)性物質(zhì)的傳統(tǒng)提取方法有浸提法、回流提取法[16]、索氏提取法[17]、超聲波提取法[18]、微波提取法[19]、超臨界萃取法[20]、常溫超高壓提取法[21]、亞臨界水萃取法[22]、雙水相萃取法[23]、沉淀吸附法[24]等。在實(shí)驗(yàn)室中常用的提取方法有回流法、超聲輔助法、索氏提取法和微波輔助提取等提取方法。在這些方法中，回流提取法、浸提法和索氏提取法相對(duì)耗時(shí)較長(zhǎng)、效率低，微波提取法相對(duì)溫度變化較快，會(huì)對(duì)產(chǎn)物生物活性產(chǎn)生一定影響，而其他方法如超臨界流體萃取和超高壓提取法等方法對(duì)設(shè)備要求較高、成本相對(duì)較高，而超聲輔助提取法具有用時(shí)短、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)。

因此本文采用超聲輔助提取法，研究乙醇濃度、料液比、超聲功率和提取時(shí)間4個(gè)因素對(duì)總?cè)铺崛〉挠绊?。以薰衣草精油提取后的殘?jiān)锌側(cè)频奶崛×孔鳛橹笜?biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取工藝，以期得到最優(yōu)提取總?cè)频墓に嚄l件，并對(duì)總?cè)铺崛∥镞M(jìn)行DPPH自由基、OH自由基、O2-自由基清除率測(cè)定，為薰衣草植物資源合理開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

法國(guó)蘭薰衣草 新疆伊犁河谷生物科技有限公司；熊果酸 標(biāo)準(zhǔn)品（純度 98%），成都普菲德生物技術(shù)有限公司；超純水 實(shí)驗(yàn)室自制；無水乙醇、95%乙醇、冰乙酸、氫氧化鈉 天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；高氯酸 天津市鑫鉑特化工有限公司；硫酸亞鐵天津永晟精細(xì)化工有限公司；鄰二氮菲 天津市福晨化學(xué)試劑廠；鄰苯三酚、香草醛、DPPH、H2O2、Tris-HCI、Sigma 天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；以上分析用試劑均為分析純。

UV-1200型紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；FW135型高速多功能粉碎機(jī) 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠；KQ2200B超聲清洗機(jī)（總功率650 W） 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 薰衣草殘?jiān)側(cè)茰y(cè)定方法

1.2.1.1 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液 精密稱取20.00 mg熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品，在避光條件下以無水乙醇定容至50 mL容量瓶中，得到質(zhì)量濃度為400 μg/mL的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取2.5 mL熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于10 mL容量瓶中，無水乙醇定容，即得100 μg/mL質(zhì)量濃度熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液[6]。

1.2.1.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 準(zhǔn)確吸取100 μg/mL質(zhì)量濃度熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL分別置于提前標(biāo)記過的試管（0、1、2、3、4、5）中，85 ℃水浴鍋揮干溶劑，加入0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液，搖勻；加入1.0 mL高氯酸，搖勻；60 ℃水浴溫育15 min，后置于冰水冷卻至室溫；加入5.0 mL冰乙酸搖勻，放置15 min顯色；以空白試劑（0號(hào)試管）為參比，通過測(cè)定546 nm波長(zhǎng)處吸光度通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[7]。以熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品含量（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線[6]并得到回歸方程為：y=0.057x+0.003，決定系數(shù)R2為0.9994。

1.2.1.3 薰衣草殘?jiān)側(cè)频奶崛〖昂繙y(cè)定 薰衣草提取三次精油后的殘?jiān)Q取500 g于粉碎機(jī)粉碎后，過40目篩得到粗粉備用。精密稱取粗粉1.0 g，置于100 mL錐形瓶中，加一定體積一定濃度的乙醇，在一定功率和時(shí)間下超聲輔助提取，重復(fù)三次，濾液合并后濃縮，用無水乙醇定容至50 mL，搖勻，精密吸取2.5 mL提取液置于10 mL容量瓶中定容至刻度線，進(jìn)行測(cè)定，并按照下述公式計(jì)算總?cè)铺崛×縖6]。

式中：C為線性方程計(jì)算出樣品的質(zhì)量濃度，μg/mL；D為測(cè)定時(shí)定容的體積，mL；V為提取液定容體積，mL；B為吸取測(cè)定體積，mL；M為稱取的樣品質(zhì)量，g；m為樣品中總?cè)瀑|(zhì)量，mg。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 乙醇濃度對(duì)總?cè)铺崛×康挠绊?乙醇濃度分別為50%、60%、75%、90%、100%時(shí)，在料液比1:20（g/mL）、超聲功率260 W、超聲時(shí)間45 min的條件下，測(cè)得其總?cè)铺崛×俊?/p>

1.2.2.2 料液比對(duì)總?cè)铺崛×康挠绊?料液比分別為1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g/mL時(shí)，在無水乙醇、超聲功率260 W、超聲時(shí)間45 min的條件下，測(cè)得其總?cè)铺崛×俊?/p>

1.2.2.3 超聲功率對(duì)總?cè)铺崛×康挠绊?超聲功率分別為40%、50%、60%、70%、80%（總功率為650 W）時(shí)，在無水乙醇、料液比1:20（g/mL）、超聲時(shí)間45 min的條件下，測(cè)得其總?cè)铺崛×俊?/p>

1.2.2.4 超聲時(shí)間對(duì)總?cè)铺崛×康挠绊?超聲時(shí)間分別為30、45、60、75、90 min時(shí)，在無水乙醇、料液比1:20（g/mL）和超聲功率260 W的條件下，測(cè)得其總?cè)铺崛×俊?/p>

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert 8.0.6，以乙醇濃度（A）、料液比（B）、超聲功率（C）和超聲時(shí)間（D）作為因素，以總?cè)铺崛×浚╕）為考察值，進(jìn)行4因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels design of response surface test

1.2.4 體外抗氧化活性測(cè)定

1.2.4.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定方法 分別取質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL 2 mL待測(cè)溶液，加入2 mL濃度為0.2 mmol/L的DPPH95%乙醇溶液，室溫下30 min避光靜置，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定得到吸光度值A(chǔ)1；對(duì)照組以95%乙醇溶液代替DPPH 95%乙醇溶液，測(cè)定得到吸光度值A(chǔ)2；空白組以95%乙醇溶液代替樣品溶液，測(cè)定得到吸光度值A(chǔ)0。以VC為參照，考察DPPH自由基清除率的強(qiáng)弱[15]。

1.2.4.2 OH自由基清除率的測(cè)定方法 在10 mL比色管中，依次加入0.3 mL濃度為7.5mmol/L硫酸亞鐵溶液、0.3 mL濃度為7.5 mmol/L鄰二氮菲溶液、1 mL pH為7.45的Tris-HCI緩沖溶液，再加入1 mL濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL的提取液和0.2 mL濃度為7.5 mmol/L H2O2溶液，用蒸餾水定容至刻度，在37 ℃水浴中，反應(yīng)1 h，在536 nm下測(cè)定得到吸光度值A(chǔ)1；以蒸餾水代替H2O2測(cè)定得到吸光度值A(chǔ)2；以蒸餾水代替待測(cè)溶液測(cè)定得到吸光度值A(chǔ)0。以VC作為參照，考察OH自由基清除率的強(qiáng)弱[15]。

1.2.4.3 O2-自由基清除率的測(cè)定方法 在10 mL比色管中，依次加入2 mL濃度為0.1 mol/L Tris-HCl緩沖溶液、2 mL濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL的提取液、1 mL濃度為0.05 mol/L鄰苯三酚，超純水定容至刻度、搖勻，25 ℃條件水浴中加熱20 min后，加入0.5 mL鹽酸溶液終止反應(yīng)，于波長(zhǎng)330 nm處測(cè)定吸光度值，得到吸光度值A(chǔ)1；以蒸餾水代替待測(cè)溶液測(cè)定得到吸光度值A(chǔ)0。以VC作為參照，考察O2-自由基清除率的強(qiáng)弱[15]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用 Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析和二次模型的建立，通過對(duì)回歸方程的解析以及響應(yīng)曲面的分析獲得最佳變量水平，通過P值考察（P＜0.05）模型及因素的顯著性。所有試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 薰衣草殘?jiān)側(cè)坪繙y(cè)定 采用超聲輔助提取法對(duì)1 g薰衣草殘?jiān)M(jìn)行提取，料液比為1:20，乙醇濃度為無水乙醇，超聲功率為260 W，超聲時(shí)間為30 min，超聲三次后合并濃縮定容，在546 nm的波長(zhǎng)通過測(cè)定其吸光度，帶入公式計(jì)算得到總?cè)频奶崛×繛椋?1.19±0.15）mg/g。

2.1.2 各因素對(duì)薰衣草總?cè)铺崛×康挠绊?乙醇濃度、料液比、超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)薰衣草總?cè)铺崛×康挠绊懸妶D1～圖4。如圖1所示，乙醇作為提取溶劑，乙醇濃度為自變量，較低濃度的75%乙醇相比無水乙醇提取量更高，推測(cè)與總?cè)频幕瘜W(xué)極性大小有關(guān)，當(dāng)提取溶劑極性較小時(shí)，提取出更多的雜質(zhì)，因而總?cè)频恼急葴p少[18]。如圖2所示，使用不同比例的料液比進(jìn)行提取，得到1:30的比例時(shí)提取量較高，高于此比例時(shí)，提取量降低。推測(cè)溶劑用量增大，超聲波與薰衣草粗粉的作用力減小[19]。如圖3所示，超聲時(shí)間到75 min時(shí)，其提取量達(dá)到較大值，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)提取量接近平穩(wěn)趨勢(shì)，推測(cè)超聲時(shí)間越長(zhǎng)，可能會(huì)影響部分三萜類化合物的穩(wěn)定性，同時(shí)雜質(zhì)溶出也會(huì)增加，反而降低了提取效果[21]。如圖4所示，當(dāng)提取功率提高時(shí)，提取量逐漸增大，達(dá)60%時(shí)提取量最高，繼續(xù)提高功率提取量下降，推測(cè)隨著物料破碎程度增大，提取程度越完全而溶出了更多雜質(zhì)，因此總?cè)圃谔嵛锶≈姓急葴p少，致使測(cè)定的總?cè)坪繙p少[20]。通過單因素實(shí)驗(yàn)選出各因素的較優(yōu)水平，即乙醇濃度75%、料液比1:30、超聲時(shí)間75 min和超聲功率60%。

圖1 乙醇濃度對(duì)總?cè)频奶崛×康挠绊慒ig.1 Effect of ethanol concentration on total triterpenes content

圖2 料液比對(duì)總?cè)频奶崛×康挠绊慒ig.2 Effect of material-liquid ratio on total triterpenes content

圖3 超聲時(shí)間對(duì)總?cè)频奶崛×康挠绊慒ig.3 Effect of ultrasonic time on total triterpenes content

圖4 超聲功率對(duì)總?cè)频奶崛×康挠绊慒ig.4 Effect of ultrasonic power on total triterpenes content

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化薰衣草殘?jiān)側(cè)频奶崛」に?/h3>

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，得到各因素的較優(yōu)條件，并將乙醇濃度（A）、料液比（B）、超聲時(shí)間（C）和超聲功率（D）四個(gè)因素帶入統(tǒng)計(jì)分析軟件Design Expert 8.0.6，以總?cè)铺崛×浚╕）為考察值，進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)，響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其響應(yīng)值Table 2 Response surface test design and response values

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，基于參數(shù)評(píng)估，采用Design Expert 8.0.6對(duì)表中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可以反映出響應(yīng)值與被檢變量之間的邏輯關(guān)系，對(duì)其進(jìn)行二次多元回歸方程擬合，即Y=40.40+1.47A+2.50B+0.79C+1.64D+3.04AB+5.81AC-0.49AD-4.14BC-1.06BD-1.49CD-4.62A2-3.74B2-3.10C2-1.87D2。為檢驗(yàn)建立模型的有效性，利用Design Expert 8.0.6進(jìn)一步進(jìn)行分析，其中多元回歸模型的方差分析結(jié)果見表3。

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 如表3所示，該模型的R2為0.9375，說明總?cè)铺崛×康淖兓?3.75%來自所選試驗(yàn)因素，因此該模型能夠很好地描述各個(gè)因素與總?cè)铺崛×恐g的關(guān)系，校正決定系數(shù)R2Adj為0.8750表明該模型能夠解釋87.50%響應(yīng)值的變化。該模型P值＜0.01，擬合極顯著，失擬相P＞0.05不顯著，其中A、D2因素顯著（P＜0.05），B、D、AB、AC、BC、A2、B2、C2極顯著（P＜0.01）。試驗(yàn)因素的F值越大其影響響應(yīng)值的程度越大，結(jié)果表明各因素對(duì)總?cè)铺崛×坑绊懘笮锽＞D＞A＞C，即料液比＞超聲功率＞乙醇濃度＞超聲時(shí)間。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析 如圖5所示，響應(yīng)面圖均為凹面曲面，表明乙醇濃度（A）、料液比（B）、超聲時(shí)間（C）和超聲功率（D）四個(gè)因素在一定范圍內(nèi)與總?cè)铺崛×砍蕭佄锞€關(guān)系，在試驗(yàn)設(shè)定條件范圍內(nèi)存在極高值。表3方差分析顯示AB、AC和BC均P＜0.01，與圖5中AB、AC和BC呈橢圓形的等高線圖相對(duì)應(yīng)，表明乙醇濃度與料液比、乙醇濃度與超聲時(shí)間、料液比與超聲時(shí)間兩兩因素之間存在極顯著的交互作用。

圖5 各因素交互作用對(duì)薰衣草總?cè)铺崛×坑绊懙捻憫?yīng)面圖Fig.5 Response surface diagram of the interaction of various factors on total triterpenes extraction from Lavandula angustifoli

表3 方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 3 Variance analysis and significance test

2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過Design Expert8.0.6軟件求解方程得到最優(yōu)工藝為乙醇濃度為89%，料液比為1:33，超聲時(shí)間為60 min，超聲功率為70% (445 W)，理論提取量為39.64 mg/g，在該條件下平行驗(yàn)證三次計(jì)算得到實(shí)際提取量為（39.95±0.32）mg/g，與預(yù)測(cè)值接近，表明該工藝條件具有一定的可行性，此外與乙醇濃度為100%，料液比為1:20，超聲時(shí)間為30 min，超聲功率為260 W相比，提取量明顯提高，表明該工藝條件能有效提高薰衣草總?cè)频奶崛×俊?/p>

2.3 體外抗氧化活性測(cè)定

2.3.1 DPPH自由基清除率測(cè)定 圖6中隨著薰衣草總?cè)茲舛茸兇?，DPPH自由基清除率呈現(xiàn)先上升后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，在總?cè)茲舛仍?～0.8 mg/mL范圍內(nèi)DPPH自由基清除率測(cè)定結(jié)果成劑量效應(yīng)關(guān)系，當(dāng)濃度達(dá)到0.8 mg/mL時(shí)，總?cè)艱PPH自由基清除率到達(dá)拐點(diǎn)，后繼續(xù)增加提取物濃度其清除率達(dá)到86.83%并趨于穩(wěn)定。VC對(duì)照組濃度達(dá)到0.4 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率出現(xiàn)拐點(diǎn)，其清除率達(dá)到90.21%，后繼續(xù)增加VC濃度，其清除率不再增加。薰衣草總?cè)艱PPH自由基清除率接近陽(yáng)性對(duì)照VC，最高清除率是同等濃度VCDPPH自由基清除率的96.25%。

圖6 薰衣草總?cè)频腄PPH·清除率Fig.6 DPPH· clearance rate of total triterpenes from Lavandula angustifoli

2.3.2 OH自由基清除率的測(cè)定 如圖7所示，隨著薰衣草總?cè)茲舛鹊脑龃?，OH自由基清除率呈現(xiàn)先上升后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，在總?cè)茲舛仍?.1～0.7 mg/mL范圍內(nèi)OH自由基清除率測(cè)定結(jié)果成劑量效應(yīng)關(guān)系，當(dāng)總?cè)茲舛冗_(dá)到0.5 mg/mL時(shí)，其OH自由基清除率達(dá)到42.06%，后趨于平穩(wěn)，對(duì)照組VC的OH自由基清除率最高為85.31%，薰衣草總?cè)芆H自由基清除率小于陽(yáng)性對(duì)照VC。

圖7 薰衣草總?cè)频摹H清除率Fig.7 ·OH clearance rate of total triterpenes from Lavandula angustifoli

2.3.3 O2-自由基清除率的測(cè)定 如圖8所示，在總?cè)茲舛仍?.1～0.7 mg/mL范圍內(nèi)O2-自由基清除率測(cè)定結(jié)果成劑量效應(yīng)關(guān)系，當(dāng)薰衣草總?cè)茲舛仍龃蟮?.5 mg/mL時(shí)，O2-自由基清除率達(dá)到47.93%，當(dāng)VC濃度到達(dá)0.6 mg/mL時(shí)，其O2-自由基清除率達(dá)到84.43%，薰衣草總?cè)芆2-自由基清除率小于陽(yáng)性對(duì)照VC。

圖8 薰衣草總?cè)频腛2-自由基清除率Fig.8 O2- free radical clearance rate of total triterpenes from Lavandula angustifoli

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化分析，建立二次多項(xiàng)式模型，理論模型擬合較好，方差分析結(jié)果表明各個(gè)因素影響程度大小順序?yàn)榱弦罕龋境暪β剩疽掖紳舛龋境晻r(shí)間；響應(yīng)面相互作用圖表明乙醇濃度與料液比、乙醇濃度與超聲時(shí)間、料液比與超聲時(shí)間交互作用極顯著；響應(yīng)面優(yōu)化得到最優(yōu)工藝條件為乙醇濃度為89%，料液比為1:33，超聲輔助提取60 min，超聲功率為70% (445 W)，該條件下薰衣草總?cè)频奶崛×繛椋?9.95±0.32）mg/g，與預(yù)測(cè)值接近，表明響應(yīng)面優(yōu)化后工藝參數(shù)可靠。進(jìn)一步對(duì)薰衣草總?cè)七M(jìn)行體外抗氧化活性測(cè)定，其中薰衣草總?cè)茖?duì)DPPH自由基清除能力較強(qiáng)，清除率為86.83%，是同等濃度VCDPPH自由基清除率的96.25%，薰衣草總?cè)芆H自由基和O2-自由基清除率分別為42.06%和47.93%。

通過響應(yīng)面法優(yōu)化工藝能夠提取得到更多的三萜類有效成分，并具有較強(qiáng)的抗氧化活性，一定程度為薰衣草殘?jiān)行С煞值睦锰峁┝死碚摶A(chǔ)。但未進(jìn)行分離純化得到單一化合物，進(jìn)一步對(duì)影響其活性的有效成分進(jìn)行深入探索。