牡蠣抗菌肽Molluscidin的密碼子優(yōu)化、重組畢赤酵母表達(dá)及抑菌活性

譚強(qiáng)來，曾 臻, ，許 莉，楊彩娟，陸馨敏，豐 艷，盧藝玲，羅家英，陳馨雨

（1.廈門醫(yī)學(xué)院海洋生物醫(yī)藥資源福建省高校工程研究中心，福建廈門 361023；2.廈門醫(yī)學(xué)院天然化妝品福建省高校工程研究中心，福建廈門 361023）

抗生素耐藥性嚴(yán)重危害公眾健康，被世界衛(wèi)生組織列為二十一世紀(jì)三大最重要的公共衛(wèi)生威脅之一[1]。據(jù)疾病控制和預(yù)防中心估計(jì)，美國每年有280多萬例抗生素耐藥性感染，超過3.5萬人因此死亡[2]。采用抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）替代成為解決抗生素耐藥性危機(jī)的一種可能方案[3]?？咕氖侵干矬w在抵御外來病原微生物侵染時(shí)，激活先天性免疫產(chǎn)生的一類小分子多肽，一般由12～50個(gè)氨基酸組成[4]。天然抗菌肽種類多、分布廣，對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲乃至癌細(xì)胞均可有效抑制或殺傷，故又被稱為“自然抗生素”[5]。抗菌肽具有獨(dú)特的抑菌機(jī)制，多數(shù)抗菌肽通過靜電相互作用吸附并破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而既達(dá)到殺滅效果，又不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[5-8]。因此，抗菌肽在醫(yī)藥衛(wèi)生、食品化妝品、飼料加工、禽畜水產(chǎn)養(yǎng)殖等行業(yè)中均有廣闊的應(yīng)用和市場前景。

從自然界各生物體中分離鑒定天然抗菌肽及其人工改造合成已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，根據(jù)抗菌活性及多肽結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（Database of Antimicrobial Activity and Structure of Peptides, DBAASP）統(tǒng)計(jì)，目前已有超過15700條天然的或人工合成的抗菌肽[9]。其中Molluscidin是SEO等[10]于2013年從太平洋牡蠣分離純化到的一種新型抗菌肽，含55個(gè)氨基酸，分子量為5.5 kDa，對(duì)革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌）和革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、沙門氏菌、副溶血弧菌）均具有較強(qiáng)的抑菌活性。然而，抗菌肽的天然提取產(chǎn)量低，采用化學(xué)合成成本昂貴，通過基因工程大量表達(dá)是滿足大規(guī)模實(shí)際產(chǎn)業(yè)應(yīng)用需要的最有前景途徑[11]。目前常用的基因工程菌主要為畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)和大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)[12]。相較于大腸桿菌，畢赤酵母具有更好的表達(dá)后加工修飾能力，有助于保持重組蛋白的生物學(xué)活性[13]。如GUENGUEN等[14]通過大腸桿菌表達(dá)的重組太平洋牡蠣防御素，對(duì)革蘭氏陰性菌無明顯抑制作用，而崔旭等[15]改用畢赤酵母表達(dá)，對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有抑菌活性。在前期研究中，凌霄[16]曾利用大腸桿菌重組表達(dá)Molluscidin，無明顯的抑菌活性。因此，本研究擬按照畢赤酵母密碼子偏好性對(duì)Molluscidin進(jìn)行核酸序列優(yōu)化，構(gòu)建其畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)，以期高效表達(dá)抑菌活性較好的重組Molluscidin，為其生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，也為重組貝類來源抗菌肽的開發(fā)利用提供可資參考的技術(shù)途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

畢赤酵母X-33和表達(dá)載體pPICZαA 海南大學(xué)陳奇博士惠贈(zèng)；大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌 本實(shí)驗(yàn)室保存；限制性內(nèi)切酶（EcoRⅠ、NotⅠ、SacⅠ）、T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、RealBand 蛋白預(yù)染Marker（10～180 kDa）、小鼠抗6×His單克隆抗體（一抗）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（二抗）、辣根過氧化氫酶DAB顯色試劑盒 生工生物；博來霉素（Zeocin） 美國Invitrogen公司；BMGY/BMMY培養(yǎng)基 上海瑞楚；Tris-Tricine-SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、彩虹245plus廣譜蛋白Marker（5～245 kDa）、YPD培養(yǎng)基、無氨基酵母氮源（YNB）、生物素、山梨醇 北京索萊寶；Western blot分析試劑 康為世紀(jì)；其他常規(guī)化學(xué)試劑 均為國產(chǎn)分析純。

Mini-PROTEAN Tetra cell聚丙烯酰胺凝膠電泳儀、S1000 PCR擴(kuò)增儀、GelDoc XR+凝膠成像分析儀 美國Bio-Rad；Eporator電轉(zhuǎn)化儀 德國Eppendorf；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái) 蘇凈安泰；LRHS-400B恒溫培養(yǎng)箱、SKY-2102恒溫振蕩器上海蘇坤；游標(biāo)卡尺 寧波長城精工。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Molluscidin的生物信息學(xué)分析 參考生物信息學(xué)方法[17]分析Molluscidin的基本理化性質(zhì)。利用ExPASy數(shù)據(jù)庫中Compute pI/Mw工具（https://web.expasy.org/compute_pi/）計(jì)算其分子量和等電點(diǎn)，ProtParam工具（https://web.expasy.org/protparam/）計(jì)算其理化參數(shù)，ProtScale工具（https://web.expasy.org/protscale/）以Hphob./Kyte & Doolittle為標(biāo)度計(jì)算其氨基酸親疏水性。

1.2.2 牡蠣抗菌肽Molluscidin的核酸序列優(yōu)化與合成 參考太平洋牡蠣Molluscidin的全長cDNA序列（GenBank登錄號(hào)：JX549384），按照畢赤酵母密碼子偏好性優(yōu)化，并在序列的5‘端添加EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)，3‘端添加6×His標(biāo)簽、終止密碼子和NotⅠ酶切位點(diǎn)，命名為“CgMoCo”，交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

用EcoR Ⅰ和NotⅠ雙酶切目的基因CgMoCo和表達(dá)載體pPICZαA，用T4 DNA連接酶于16 ℃連接2 h后，化轉(zhuǎn)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，用含0.1 mg/mL博來霉素的LB固體平板及菌落PCR篩選陽性克隆，并通過雙酶切和測序驗(yàn)證是否成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZαA-CgMoCo，構(gòu)建策略見圖1。

圖1 重組質(zhì)粒pPICZαA-CgMoCo構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic representation of the recombinant expression vector pPICZαA-CgMoCo

1.2.3 電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33及篩選陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒pPICZαA-CgMoCo用SacI酶于37 ℃酶切過夜后濃縮回收，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測線性化合格后，參考前期研究的電轉(zhuǎn)化條件[18]，與100 μL畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞混合并轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2 cm電轉(zhuǎn)杯，在1500 V、25 μF、400 Ω條件下電轉(zhuǎn)化后，立即加入900 μL預(yù)冷的1 mol/L山梨醇，分別涂布在含0.1、0.2和0.3 mg/mL博來霉素的YPD固體平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d至單菌落長出，以pPICZαA空載體同上處理作為陰性對(duì)照。

挑選若干個(gè)單菌落于YPD液體培養(yǎng)基中30 ℃、250 r/min培養(yǎng)過夜后，提取酵母基因組DNA，用pPICZαA載 體 通 用 引 物AOX 1（3-AOX1：5‘-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3‘，5-AOX1：5‘-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3‘）進(jìn)行PCR鑒定（PCR反應(yīng)條件為：95 °C 10 min；95 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 1 min，30個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)體系為：TaKaRa Ex Taq 0.25 μL，10×Ex Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，模板1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL），以線性化的重組質(zhì)粒pPICZαA-CgMoCo為陽性對(duì)照。

1.2.4 重組畢赤酵母的多肽誘導(dǎo)表達(dá)和檢測 選取若干個(gè)鑒定為陽性的單菌落，參考Invitrogen畢赤酵母表達(dá)載體pPICZα表達(dá)手冊(cè)推薦方法，按1%接種量轉(zhuǎn)接于15 mL的BMGY培養(yǎng)基，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)至菌液OD600為2～3，5000 r/min離心5 min收集菌體沉淀，用15 mL的BMMY培養(yǎng)基重懸，30 ℃、250 r/min連續(xù)培養(yǎng)5 d，每隔24 h補(bǔ)加甲醇至終濃度0.5%，最后8000 r/min離心5 min收集培養(yǎng)上清進(jìn)行SDS-PAGE篩選，并進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。用含pPICZαA空載體的酵母轉(zhuǎn)化子同上處理作為陰性對(duì)照。

PAGE膠用100 V電壓轉(zhuǎn)印經(jīng)甲醇激活的0.22 μm的PVDF膜1 h，對(duì)膜封閉1.5 h后，用TBST緩沖液洗膜；加入小鼠抗6×His單克隆抗體（一抗），室溫孵育2 h后，如上洗膜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（二抗），室溫孵育1 h后，如上洗膜；用辣根過氧化氫酶DAB顯色試劑盒顯色。

1.2.5 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化 選取1株初篩結(jié)果較好的重組畢赤酵母在1.2.4的基礎(chǔ)上優(yōu)化條件，甲醇終濃度設(shè)置3個(gè)對(duì)照，分別為0.5%、1%、1.5%，以確定最佳甲醇誘導(dǎo)濃度；在0、24、48、72、96、120 h分別取樣，以確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間。用含pPICZαA空載體的酵母轉(zhuǎn)化子同上處理作為陰性對(duì)照。

1.2.6 抑菌活性的測定 參考濾紙片瓊脂擴(kuò)散法[19]進(jìn)行抑菌活性測定。選用兩株革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、肺炎克雷伯菌）和兩株革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）為指示菌，取對(duì)數(shù)生長期的指示菌的菌懸液10-3稀釋后，取100 μL涂布于LB固體平板，再均勻貼入無菌濾紙片，加入重組畢赤酵母的培養(yǎng)上清30 μL，待稍干，37 ℃培養(yǎng)過夜后，觀察并記錄抑菌圈直徑。用含pPICZαA空載體的酵母轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)上清同上處理作為陰性對(duì)照。用無菌1×PBS同上處理作為空白對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

如無特別標(biāo)注，實(shí)驗(yàn)平行測定三次，抑菌圈直徑采用GraphPad Prism version 5.01進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及圖形繪制，數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（m±SD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Molluscidin的生物信息學(xué)分析

Molluscidin的理化參數(shù)分析如表1所示，預(yù)期分子量為6521.87 Da，等電點(diǎn)為11.28，在酵母體內(nèi)半衰期＞20 h，理化性質(zhì)較為穩(wěn)定。Molluscidin的氨基酸親疏水性分析如圖2所示，最大值為0.022，位于第5位氨基酸處；最小值為-2.878，位于第57位氨基酸處；親水性較強(qiáng)。

圖2 重組Molluscidin的氨基酸親疏水性分析Fig.2 Analysis of hydrophilicity and hydrophobicity of the recombinant Molluscidin

表1 重組Molluscidin的理化參數(shù)分析Table 1 Analysis of physicochemical parameters of the recombinant Molluscidin

于婷等[17]的研究指出，提高抗菌肽的正電荷數(shù)、親疏水性等結(jié)構(gòu)參數(shù)一般有利于增強(qiáng)其抑菌活性。因此，根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，Molluscidin是有潛力的適用于畢赤酵母重組表達(dá)的抗菌肽。

2.2 牡蠣抗菌肽Molluscidin的核酸序列優(yōu)化

牡蠣抗菌肽Molluscidin的核酸序列按照畢赤酵母密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化前后的核酸序列及對(duì)應(yīng)氨基酸序列比對(duì)如圖3所示。

圖3 牡蠣抗菌肽Molluscidin密碼子優(yōu)化前后的核酸序列及對(duì)應(yīng)氨基酸序列比對(duì)Fig.3 Original and optimized nucleotide sequences and deduced amino acid sequences of Molluscidin from Crassostrea gigas

2.3 畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化及陽性轉(zhuǎn)化子的篩選

陽性轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定結(jié)果如圖4所示。預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物包括含酶切位點(diǎn)、6×His標(biāo)簽、終止密碼子的目的基因片段為203 bp，加上載體上信號(hào)肽等序列546 bp，總計(jì)749 bp。除5號(hào)泳道外，其余泳道的條帶與預(yù)期大小相符，表明成功獲得陽性酵母轉(zhuǎn)化子。

圖4 重組畢赤酵母PCR鑒定Fig.4 Identification of the recombinant P. pastoris by PCR

2.4 重組畢赤酵母的誘導(dǎo)表達(dá)篩選

選取6株陽性酵母轉(zhuǎn)化子在30 ℃、250 r/min、0.5%甲醇濃度的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)5 d后，離心收集培養(yǎng)上清進(jìn)行SDS-PAGE分析，如圖5所示。1號(hào)酵母轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)上清在10～15 kDa處有一個(gè)較明顯的條帶（黑色箭頭所示），而陰性對(duì)照的培養(yǎng)上清則無此條帶，因此基本證明重組Molluscidin在1號(hào)酵母轉(zhuǎn)化子中表達(dá)。

圖5 重組畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)篩選Fig.5 Induced expression of the recombinant P. pastoris

而如表1所示，重組Molluscidin的分子量預(yù)測為6.52 kDa，SDS-PAGE分析結(jié)果偏高，因此進(jìn)一步利用His標(biāo)簽通過Western blot驗(yàn)證，如圖6所示。1號(hào)酵母轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)上清在10～15 kDa處有一條較明顯的雜交條帶（黑色箭頭所示），而陰性對(duì)照的培養(yǎng)上清則未見任何條帶，表明含6×His標(biāo)簽的重組Molluscidin與抗His一抗發(fā)生免疫反應(yīng)，再與二抗結(jié)合，經(jīng)DAB顯色為雜交條帶，因此驗(yàn)證重組Molluscidin在1號(hào)酵母轉(zhuǎn)化子中成功表達(dá)。

圖6 重組Molluscidin的Western blot驗(yàn)證Fig.6 Verification of the recombinant Molluscidin by Western blot

張亞莉等[20]在利用畢赤酵母重組表達(dá)厚殼貽貝Mytilin-1成熟肽時(shí)，也發(fā)現(xiàn)所表達(dá)的目的蛋白分子量明顯高于理論分子量，推測存在兩方面的原因：一是目的蛋白的分子量太小且?guī)д姾?，?dǎo)致其電荷不能被SDS完全屏蔽，所以在電泳時(shí)遷移速度變慢；二是所用蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker與顯色染料發(fā)生了共價(jià)偶聯(lián)，導(dǎo)致在隨后電泳時(shí)遷移速度變慢。此外，Compute pI/Mw和ProtParam工具在預(yù)測蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)時(shí)，無法考慮蛋白質(zhì)翻譯后的修飾、蛋白質(zhì)多聚體等情況。

2.5 重組Molluscidin誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

在上述篩選實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取1號(hào)酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)行重組Molluscidin誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化，考察不同甲醇濃度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)重組Molluscidin表達(dá)量的影響，如圖7所示。在1.0%甲醇濃度下，1號(hào)酵母轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)上清中目的蛋白較為清晰，且雜蛋白也較少，因此確定最佳甲醇誘導(dǎo)濃度為1.0%。在1.0%甲醇濃度下，1號(hào)酵母轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)時(shí)間從24 h開始，其培養(yǎng)上清出現(xiàn)目的蛋白，在48 h時(shí)已有較高的表達(dá)量，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，重組Molluscidin的表達(dá)量并無明顯增加?？紤]到時(shí)間成本及目的蛋白的積聚可能影響酵母活力，也可能被體系中蛋白酶降解等問題，確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為48～72 h。

圖7 重組Molluscidin誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化Fig.7 Optimization of induced expression conditions of the recombinant Molluscidin

上述結(jié)果與崔旭等[15]利用畢赤酵母重組表達(dá)太平洋牡蠣防御素的優(yōu)化條件較為一致。而趙震等[21]在重組表達(dá)青蛤Mytimacin時(shí)，選擇了1.5%為最佳甲醇濃度，72 h為最佳培養(yǎng)時(shí)間。呂星星等[22]重組表達(dá)鱖魚β-防御素時(shí)，以1.0%為最佳甲醇濃度，96 h為最佳培養(yǎng)時(shí)間。

2.6 重組Molluscidin抑菌活性的測定

重組Molluscidin對(duì)革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、肺炎克雷伯菌）和革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）的抑菌圈直徑如圖8所示。含重組Molluscidin的培養(yǎng)上清對(duì)大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別為（1.77±0.20）cm、（1.49±0.11）cm、（1.90±0.09）cm、（1.64±0.06）cm，而陰性對(duì)照（含pPICZαA空載體的酵母轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)上清）和空白對(duì)照（無菌1×PBS）對(duì)上述4種代表性細(xì)菌均無抑制作用，因此初步證明重組Molluscidin具有較好的抑菌活性。

圖8 重組Molluscidin的抑菌活性測定Fig.8 Antibacterial activity of the recombinant Molluscidin

而凌霄[16]利用大腸桿菌重組表達(dá)系統(tǒng)獲得的重組Molluscidin，對(duì)革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、李斯特氏菌）和革蘭氏陰性菌（沙門氏菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌）均無明顯的抑菌圈。因此利用重組畢赤酵母高效表達(dá)活性抗菌肽或是一個(gè)更合適的選擇。

3 結(jié)論與討論

抗菌肽是生物體初級(jí)免疫系統(tǒng)的重要效應(yīng)分子，廣泛存在于動(dòng)物[23]、植物[24]以及微生物[25]中。海洋生物由于棲息環(huán)境復(fù)雜，更易遭受病原微生物的侵染，必須產(chǎn)生天然抗菌肽作為生存的必要防線，因此已成為新發(fā)現(xiàn)抗菌肽的豐富來源[26-27]。貝類等軟體動(dòng)物缺乏特異性免疫機(jī)制，卻具有強(qiáng)大的抗逆能力，其抗菌肽發(fā)揮了關(guān)鍵作用，日漸受到科研工作者的關(guān)注[28]。如GUENGUEN等[14,29]從太平洋牡蠣中先后分離鑒定了兩種抗菌肽Cg-def和Cg-prp。GRECO等[30]分析了貽貝科Mytilin樣防御肽的分子多樣性。YANG等[31]從菲律賓蛤仔中獲得一種抗菌肽Macin。NAM等[32]在皺紋盤鮑中鑒定分析了一種兼具抗細(xì)菌和抗真菌活性的脂多糖-β-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白。然而，直接提取和人工合成抗菌肽或步驟繁瑣、產(chǎn)量低，或成本高、無法普及；而大腸桿菌原核表達(dá)的抗菌肽易毒害表達(dá)宿主、喪失活性，因此，畢赤酵母作為應(yīng)用最為廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)，可成為更合適的選擇。如LI等[33]為解決從鱟中提取天然鱟素Ⅰ產(chǎn)量低、大規(guī)模應(yīng)用受限的問題，構(gòu)建了其畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)，獲得了能有效抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的重組鱟素Ⅰ。MENG等[34]的研究表明在大腸桿菌表達(dá)的菲律賓蛤仔防御素對(duì)金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌均無有效的抑菌活性，而在畢赤酵母中表達(dá)的菲律賓蛤仔防御素具有廣泛的抗菌譜，對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有較好的抑菌活性。此外，本研究還按照畢赤酵母密碼子偏好性優(yōu)化核酸序列，并考察了甲醇誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的影響。董聰?shù)萚35]的研究表明，畢赤酵母密碼子偏好性對(duì)目的蛋白的表達(dá)量影響很大。張亞莉等[20]結(jié)合前期研究，發(fā)現(xiàn)甲醇濃度和培養(yǎng)時(shí)間是畢赤酵母重組表達(dá)的兩個(gè)重要影響因素，甲醇濃度低于1%易雜蛋白多，過高將抑制酵母生長進(jìn)而影響其表達(dá)；培養(yǎng)時(shí)間過短，目的蛋白尚未高表達(dá)，過長將降低培養(yǎng)液pH從而影響蛋白活性。本研究結(jié)果與上述前期研究較為匹配。

本研究按照畢赤酵母密碼子偏好性優(yōu)化合成牡蠣抗菌肽Molluscidin，生物信息學(xué)分析其預(yù)期分子量為6521.87 Da，等電點(diǎn)為11.28，在酵母體內(nèi)半衰期＞20 h，理化性質(zhì)較為穩(wěn)定；成功篩選到1株重組畢赤酵母X-33/pPICZαA-CgMoCo，能高效表達(dá)抑菌活性較好的重組Molluscidin；優(yōu)化表達(dá)條件為30 ℃、250 r/min、1.0%甲醇濃度誘導(dǎo)表達(dá)48～72 h；抑菌譜包括大腸桿菌、肺炎克雷伯菌等革蘭氏陰性菌和金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌。上述研究成果為其生產(chǎn)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，也為重組貝類來源抗菌肽的開發(fā)利用提供了可供參考的技術(shù)途徑。