荔枝生理落果中A型原花青素提取純化鑒定及抗氧化活性研究

謝 翀，林 琳，吳戈儀，王 凱，胡卓炎，趙 雷

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）

荔枝（Litchi chinensisSonn.）是一種產(chǎn)于東南熱 帶到亞熱帶的作物，為常綠喬木植物的果實(shí)，屬無患子科荔枝屬[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，荔枝多酚在荔枝果皮、果肉和果核中都有分布，其中果皮中含量最高，是荔枝中主要功能性成分之一[3-4]。大量研究表明，荔枝多酚具有多種生物活性，如抗氧化、抗癌、降血糖等[5-9]。而原花青素是由黃烷3醇單體構(gòu)成的多酚化合物，根據(jù)不同連接鍵可分為A型原花青素（C-OC）及B型原花青素（C-C），根據(jù)分子量大小又可分為單體、低聚體和高聚體，廣泛分布于各種植物的皮和核[10-11]。在植物中，A型原花青素遠(yuǎn)不如B型原花青素常見，荔枝則是少數(shù)以A型原花青素為主的植物之一[12]。同時(shí)，荔枝自開花結(jié)果到成熟過程中，因品種、氣象條件等因素，會(huì)有3～4次的落果高峰[13]。為了提高荔枝的產(chǎn)量和品質(zhì)，人們會(huì)進(jìn)行人工疏果，獲得大量的小果實(shí)。而這些荔枝生理落果不可食用，應(yīng)用范圍較窄，常作為農(nóng)業(yè)廢棄物丟棄。KAUR等[14]研究發(fā)現(xiàn)，荔枝從坐果到成熟過程中原花青素含量呈下降趨勢，因此荔枝生理落果可作為原花青素的良好來源之一。如今，荔枝中已被鑒定出含有12種二聚體及6種三聚體，其中原花青素A1、原花青素A2及表兒茶素-（4β→8,2β→O→7）-表兒茶素-（4β→8）-表兒茶素等A型低聚原花青素結(jié)構(gòu)已明晰，但隨著聚合度的增加，同分異構(gòu)體數(shù)量也隨之增加，增加了對聚合度在3以上的原花青素結(jié)構(gòu)的鑒定難度[15-16]。同時(shí)，A型低聚原花青素也通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確了其抗動(dòng)脈粥樣硬化及抗糖尿病等生物活性[17-18]。

目前，對荔枝生理落果的研究主要集中在果實(shí)自然脫落的預(yù)防及機(jī)制和生長過程中一些基本成分的變化，尚未見有研究對荔枝生理落果中生物活性成分進(jìn)行提取鑒定并發(fā)掘其潛在的利用價(jià)值。為深入探究荔枝生理落果中酚類化合物的組成并尋找具有活性的多酚組分，本文用乙醇作為提取溶劑對荔枝生理落果中酚類物質(zhì)進(jìn)行提取，采用大孔樹脂及葡聚糖凝膠對提取物進(jìn)行分離純化，采用體外抗氧化對不同的多酚組分進(jìn)行評價(jià)，并利用HPLC及LC-Q-TOF對多酚組分進(jìn)行物質(zhì)鑒定，以期為荔枝生理落果的廢物利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2020年新鮮荔枝落果（品種：白糖罌） 取自茂名當(dāng)?shù)毓麍@，整果經(jīng)40 ℃熱風(fēng)干燥54 h，打粉后儲(chǔ)存于干燥皿中備用；AB-8大孔樹脂、Sephadex LH-20、福林酚（分析純）、沒食子酸（標(biāo)準(zhǔn)品）、表兒茶素（標(biāo)準(zhǔn)品）、原花青素A2（標(biāo)準(zhǔn)品）、原花青素A4（標(biāo)準(zhǔn)品）、蘆?。?biāo)準(zhǔn)品） 上海源葉生物科技有限公司；香草醛（分析純） 上海麥克林生化科技有限公司；甲酸（色譜純） 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純） 德國默克公司。

Lab-1C-50型真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；1260 Infinity型高效液相色譜儀型、Agilent6540UHD Q-TOF，Zorbox SB-C18柱（4.6 mm×250 mm 5-Micron） 安捷倫科技有限公司；Uvmini-1240型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；TD5-II低速離心機(jī) 長沙平凡儀器儀表有限公司；H01-1D恒溫磁力攪拌器 梅穎浦儀器儀表制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 荔枝生理落果粗多酚化合物提取 參考LI等[15]的方法并稍作修改。荔枝生理落果粉末用正己烷按1:10（mg/mL）的料液比混合后靜置過夜，3500 r/min離心15 min除去正己烷后，按1:10（mg/mL）的料液比與70%乙醇混合后在室溫下300 r/min磁力攪拌提取，重復(fù)提取至溶液基本無色，合并提取液，濃縮后凍干為荔枝生理落果多酚粗提物（Litchi Fruitlet Extract，LFE），測定提取液及LFE中多酚及原花青素含量。

1.2.2 AB-8大孔樹脂純化 參考LI等[15]的方法并稍作修改。LFE溶解后上樣AB-8大孔樹脂柱（2.5 cm×60 cm），隨后用蒸餾水洗去糖和蛋白質(zhì)，再用乙醇洗脫吸附的多酚，分管收集（10 mL/管），每管測定多酚含量，根據(jù)洗脫曲線合并洗脫液，凍干得荔枝生理落果多酚純化物（Purity Litchi Fruitlet Extract，PLFE），測定多酚及原花青素含量。

1.2.3 Sephadex LH-20葡聚糖凝膠分離 參考ZHOU等[19]的方法并稍作修改。PLFE配制成高濃度的多酚溶液（50 mg/mL），采用20%、40%、60%、80%甲醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液分管收集，每管10 mL，于280 nm處測定吸光值，繪制洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線收集不同組分，合并后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40 ℃減壓濃縮備用。

1.2.4 電噴霧液質(zhì)聯(lián)用四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（LCESI-Q-TOF） 參考何婷等[20]的方法并稍作修改。使用高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)分析酚類化合物，使用安捷倫Zorbox SB-C18柱，紫外分光光度檢測器。進(jìn)樣量為10 μL，柱溫維持在30 ℃，流速0.7 mL/min，檢測波長280 nm。流動(dòng)相為0.4%（v/v）甲酸水溶液（溶液A）和甲醇（溶液B）。洗脫條件如下：0～10 min（15%～35% B）；10～25 min（35%～45% B）；25～40 min（45%～60% B）；40～45 min（20% B）。

為進(jìn)行物質(zhì)鑒定，所選樣品在Agilent 6540UHD Q-TOF進(jìn)行ESI負(fù)離子分析上進(jìn)行分析，流動(dòng)相和洗脫條件與高效液相色譜分析相同。質(zhì)譜使用ESI離子源收集條件：孔板電壓-30 V；霧化壓力45 Psi；熱毛細(xì)管溫度275 ℃；質(zhì)量范圍m/z 100～1200；干燥氣為氮?dú)狻?/p>

根據(jù)LC-ESI-Q-TOF得到相應(yīng)出峰時(shí)間物質(zhì)的分子量、碎片離子峰，并通過與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間的比較，對表兒茶素、原花青素及蘆丁的峰進(jìn)行定性分析，標(biāo)準(zhǔn)品包括表兒茶素、原花青素A2、原花青素A4、蘆丁。

1.2.5 酚類物質(zhì)含量及體外活性測定

1.2.5.1 總酚及總原花青素含量測定 參考RANGKADLLOK等[21]的方法對總酚含量進(jìn)行測定。取0.1 mL稀釋后的樣品液于10 mL棕色容量瓶并加少量的水和0.5 mL福林酚溶液，搖勻完靜置3～4 min，在8 min內(nèi)加入1.5 mL 20% Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至刻度，室溫下避光反應(yīng)2 h，在765 nm下測吸光值，以蒸餾水為空白，重復(fù)測定3次。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：

參考ZHANG等[22]的方法對總原花青素含量進(jìn)行測定。取1 mL稀釋后的樣品液與2.5 mL 1%（w/v）香草醛-甲醇溶液和2.5 mL 20% （v/v） H2SO4-甲醇溶液混合。溶液在30℃的條件下避光水浴反應(yīng)20 min。測定樣品在500 nm處的吸光度，以甲醇為空白，重復(fù)測定3次。以表兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：

測定結(jié)果根據(jù)如下公式計(jì)算荔枝生理落果及提取物（LFE、PLFE）的總酚、總原花青素含量。

式中：m為計(jì)算所得總酚、原花青素的質(zhì)量，mg；M為提取所用荔枝生理落果的質(zhì)量或測定所用提取物（LFE、PLFE）的質(zhì)量，mg。

1.2.5.2 體外抗氧化活性測定 以鐵還原/抗氧化能力（FRAP）和清除DPPH·、ABTS+·活性評價(jià)其體外抗氧化活性，參考ZHOU等[19]的方法進(jìn)行測定，并稍作改動(dòng)。取0.1 mL樣品液加3.9 mL 自由基反應(yīng)液，避光反應(yīng)，記為A1。兩者均用95%乙醇代替樣品液作為對照組，記為A0，以蒸餾水為空白參比，以抗壞血酸作為陽性對照，分別于517 nm和734 nm測吸光值。按以下公式計(jì)算自由基清除率，并計(jì)算IC50值。

FRAP總抗氧化能力：取0.1 mL樣品液與5 mL現(xiàn)配的FRAP試劑混合，避光37 ℃下水浴反應(yīng)10 min，以蒸餾水為空白，以抗壞血酸為陽性對照，在593 nm處測定吸光值。將測量結(jié)果與Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，將樣品達(dá)到相同吸光度所需Trolox的毫摩爾數(shù)，用來表示其抗氧化活性（FRAP值）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Origin2018軟件處理數(shù)據(jù)并作圖，每個(gè)樣品測定3個(gè)平行并所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，通過SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 荔枝生理落果多酚提取、純化結(jié)果

經(jīng)測定，荔枝生理落果中總酚及總原花青素含量分別為（49.96±2.66）mg GAE/g DW和（27.25±0.44）mg EPE/g DW，提取液經(jīng)濃縮凍干后得到LFE，其多酚含量為（202.46±1.94）mg/g，原花青素含量為（106.75±1.34）mg/g。有研究表明，成熟荔枝中多酚總量為264.36～662.51 mg/kg，原花青素總量為7.09～22.76 mg/g，并且荔枝中總酚含量高于菠蘿、香蕉等4種熱帶水果，僅次于百香果，原花青素含量則遠(yuǎn)高于大部分市售水果[4,23-25]?？梢娎笾ι砺涔缓喾蛹霸ㄇ嗨?，可作為新的酚類物質(zhì)來源。

為提高LFE中酚類物質(zhì)的純度，將LFE上樣大孔樹脂AB-8進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附洗脫，洗脫曲線如圖1所示，根據(jù)洗脫曲線合并第17～35管洗脫液，濃縮凍干得PLFE。經(jīng)測定，純化后PLFE多酚含量可達(dá)到（545.85±7.84）mg/g，原花青素含量可達(dá)到（205.92±3.224）mg/g。AB-8大孔樹脂屬于低極性樹脂，可從溶劑中吸附小分子的低極性物質(zhì)，常用于植物多酚的分離純化[26]。由數(shù)據(jù)可見，經(jīng)大孔樹脂純化后，LFE中大部分的糖和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)被除去，并有效保留了大部分酚類物質(zhì)于PLFE中。

圖1 大孔樹脂AB-8洗脫曲線Fig.1 Elution curve of AB-8 macroporous resin

為進(jìn)一步對PLFE中復(fù)雜的酚類物質(zhì)分離，將PLFE上樣Sephadex LH-20凝膠色譜（1.6 cm×45 cm）。Sephadex LH-20分離植物成分的原理與分子排阻色譜原理相似，根據(jù)目標(biāo)分離產(chǎn)物分子量的不同可達(dá)到進(jìn)一步分離純化的目的[27]。經(jīng)不同濃度甲醇溶液洗脫，根據(jù)樣品在280 nm下的吸光值，將樣品分為P1、P2、P3和P4四個(gè)組分，洗脫曲線如圖2所示。

圖2 Sephadex LH-20洗脫曲線Fig.2 Sephadex LH-20 elution curve

2.2 不同組分多酚體外抗氧化活性及組成

2.2.1 體外抗氧化活性 荔枝果皮中含有大量的花青素和類黃酮，這些化合物能夠通過螯合金屬離子，形成金屬配合物，直接清除超氧陰離子[28]。

P1～P4組分、PLFE及抗壞血酸對ABTS+·、DPPH·清除能力及總抗氧化能力如圖3～5所示。由圖可知各樣品體外抗氧化活性均表現(xiàn)出劑量依賴性。P1～P4組分和PLFE的ABTS+·清除能力均顯著高于抗壞血酸（P＜0.05），其中P4組分自由基清除能力最強(qiáng)，其在100 μg/mL時(shí)ABTS+·清除能力是抗壞血酸的1.5倍。各樣品DPPH·清除能力表現(xiàn)出與ABTS+·相似的趨勢，P1～P3組分自由基清除能力較低，當(dāng)濃度在20～60 μg/mL時(shí)，P4組分對DPPH·清除能力顯著高于抗壞血酸（P＜0.05），而PLFE則與抗壞血酸相當(dāng)，而濃度在80～100 μg/mL時(shí)，P4組分自由基清除能力與抗壞血酸相似。各組分ABTS+·及DPPH·清除能力IC50值大小排序分別為：P4（38.21 μg/mL）＞PLFE（47.03 μg/mL）＞P2（55.11 μg/mL）＞P3（56.90 μg/mL）＞P1（57.17 μg/mL）＞抗 壞 血 酸（81.24 μg/mL）和 抗 壞 血 酸（100.73 μg/mL）＞P4（102.50 μg/mL）＞PLFE（111.70 μg/mL）＞P3（144.98μg/mL）＞P2（166.85 μg/mL）＞P1（285.29 μg/mL），兩者趨勢相似，說明P4組分能夠有效清除自由基離子，具有較強(qiáng)的抗氧化活性。而在總抗氧化能力測定結(jié)果中，P1組分表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗氧化活性，在高濃度下顯著高于其他多酚樣品及抗壞血酸（P＜0.05），而P4和P2組分總抗氧化能力相當(dāng)，在100 μg/mL時(shí)約是抗壞血酸的1.06倍。P3和PLFE抗氧化能力雖較弱，但也顯著高于抗壞血酸（P＜0.05）。

圖3 各組分及抗壞血酸ABTS+·清除能力Fig.3 ABTS+· free radical scavenging ability of each component and ascorbic acid

圖4 各組分及抗壞血酸DPPH·清除能力Fig.4 DPPH· free radical scavenging ability of each component and ascorbic acid

圖5 各組分及抗壞血酸總抗氧化能力Fig.5 Total antioxidant capacity of each component and ascorbic acid

荔枝中富含多酚類物質(zhì)，不同品種的荔枝及不同提取方式得到的產(chǎn)品其結(jié)構(gòu)和活性均不相同。研究發(fā)現(xiàn)不同溶劑提取的荔枝果皮粗多酚活性弱于抗壞血酸，大孔樹脂純化后DPPH·清除能力與抗壞血酸相當(dāng)，而進(jìn)一步分離得到的多酚化合物抗氧化活性差別較大，個(gè)別顯著強(qiáng)于抗壞血酸及對照丁基羥基甲苯（BHT）[9,29-31]。可見荔枝中的多酚類化合物具有一定的抗氧化活性，但由于多酚種類及結(jié)構(gòu)上的不同，其抗氧化活性存在一定的差異。綜合3個(gè)體外抗氧化測定結(jié)果考慮，P4組分表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力，說明通過AB-8大孔樹脂及LH-20分離純化后得到的P4組分中含有強(qiáng)抗氧化活性的物質(zhì)。為進(jìn)一步探究P4中的活性成分，對P4組分中多酚化合物組成進(jìn)行LC-ESI-Q-TOF分析。

2.2.2 物質(zhì)鑒定 圖6為PLFE的HPLC圖。為了進(jìn)一步明確其物質(zhì)組成，采用LC-Q-TOF進(jìn)行ESI負(fù)離子分析，對其中主要的化合物進(jìn)行鑒定。PLFE組成如表1所示，經(jīng)質(zhì)譜分析可鑒定出15種物質(zhì)，除去編號10的蘆丁外，其余均為原花青素的低聚物。其中編號6為表兒茶素，編號3-2、4、5-2、7-3、8、9為原花青素二聚體，編號1、2、3-1、5-1、5-3、7-1、7-2為原花青素三聚體。在原花青素的低聚物中，A型占了10種，B型僅有3種。這表明荔枝落果中原花青素多數(shù)以A型的低聚物形式存在。荔枝也已被證實(shí)是為數(shù)不多以A型原花青素為主的水果之一。LI等[32]通過LC-ESI-MS分析發(fā)現(xiàn)A型原花青素約占荔枝果皮低聚原花青素提取物41.7%，而B型約占24.1%。MA等[29]及GONG等[33]通過多重色譜分離方法從荔枝果皮中分離得到了原花青素A1、原花青素A2、表兒茶素及蘆丁。MAN等[18]用乙醇提取荔枝核，D101大孔樹脂純化，經(jīng)UPLCMS鑒定出表兒茶素、原花青素A1及蘆丁。劉夢等[34]將荔枝核乙醇提取物經(jīng)多種色譜方法分離，得到15種化合物，其中也包含蘆丁和原花青素A2。

表1 PLFE多酚組成成分分析Table 1 The polyphenols composition analysis of PLFE

圖6 PLFE的HPLC圖Fig.6 The liquid chromatogram of PLFE

圖7為P4組分的HPLC圖，P4多酚組成如表2所示，一共鑒定出4個(gè)物質(zhì)，出峰時(shí)間主要集中在15～25 min，其中保留時(shí)間為16.102、20.122和23.959 min的物質(zhì)經(jīng)Q-TOF鑒定，其m/z均為575.1，其二級質(zhì)譜包含449.0、423.0及285.03的碎片離子峰，符合A型原花青素二聚體的裂解途徑[35]。而保留時(shí)間在20.122 min的另一個(gè)物質(zhì)m/z為1151.2，其二級質(zhì)譜包含575.1、423.0及285.0的碎片離子峰，說明該物質(zhì)是含有一個(gè)C-O-C鍵連接的原花青素四聚體。經(jīng)過與原花青素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)法對照，鑒定出保留時(shí)間在16.102 min和20.122 min的兩個(gè)原花青素二聚體分別是原花青素A4和原花青素A2。已有研究表明從荔枝中提取分離出荔枝單寧A1、荔枝單寧A2、原花青素A2和A型三聚體均具有較強(qiáng)的自由基清除能力[32,36]。根據(jù)2.2體外抗氧化的數(shù)據(jù)結(jié)果，P4組分的DPPH·和ABTS+·清除能力均顯著高于抗壞血酸（P＜0.05），這與文獻(xiàn)中的研究結(jié)果相似，說明A型原花青素具備很好的體外抗氧化特性。

表2 P4組分多酚組成成分分析Table 2 The polyphenols composition analysis of P4

圖7 P4組分的HPLC圖Fig.7 The liquid chromatogram of P4

由此可見，荔枝生理落果中富含A型原花青素，通過AB-8大孔樹脂純化、Sephadex LH-20葡聚糖凝膠分離后可富集得到純A型原花青素的提取物，具有作為A型原花青素優(yōu)秀來源的潛力。

3 結(jié)論

荔枝生理落果富含多酚及原花青素，含量分別為（49.96±2.66）mg GAE/g DW和（27.25±0.44）mg EPE/g DW；提取物經(jīng)AB-8大孔樹脂純化，LH-20葡聚糖分離得到4個(gè)多酚組分，經(jīng)對比體外抗氧化活性，P4組分具有較強(qiáng)的ABTS+·和DPPH·清除能力，在100 μg/mL時(shí)，清除率可分別達(dá)到92.52%和46.98%，總抗氧化能力顯著高于抗壞血酸（P＜0.05）；采用LC-ESI-Q-TOF對多酚組分鑒定發(fā)現(xiàn)，荔枝生理落果多酚純化物中含有大量低聚原花青素，包含10種A型原花青素及3種B型原花青素，而P4組分主要由原花青素A4、原花青素A2及A型原花青素二聚體和四聚體組成?？梢?，荔枝生理落果中的A型原花青素具有優(yōu)秀的生物活性，有進(jìn)一步開發(fā)利用成保健品的潛力。而市售A型原花青素遠(yuǎn)沒有B型原花青素普遍，來源較為單一，本文結(jié)果表明荔枝生理落果中富含大量A型原花青素，說明荔枝生理落果可作為一種新的A型原花青素植物原料。