富硒辣木葉蛋白ACE抑制肽的酶解工藝優(yōu)化及活性研究

陳冰冰，歐穎儀，葉灝鐸，金昶言，梁興唐，尹艷鎮(zhèn)，鄭韻英，曹 庸，苗建銀,,4,

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東廣州 510642；2.廣西農(nóng)產(chǎn)資源化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西玉林 537000；3.北部灣大學(xué)石油與化工學(xué)院， 欽州市生物廢棄物資源富硒功能化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西欽州 535011；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部富硒產(chǎn)品開發(fā)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/富硒食品開發(fā)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，陜西安康 725000）

高血壓是各種心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的主要病因之一，高血壓患者是世界范圍內(nèi)患病人群中最大的一個群體，預(yù)計(jì)到2025年，發(fā)病人數(shù)將超過15億[1-2]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin-converting enzyme，ACE）是調(diào)節(jié)血壓和血管功能的重要因子。抑制ACE的活性可以有效阻止血管緊張素Ⅱ的生成，從而防治高血壓。常見ACE抑制劑藥物有卡托普利、苯那普利等，但臨床上會有頭痛、疲勞等不良反應(yīng)[3-4]。尋求安全、無副作用的食源性ACE抑制活性成分成為近年研究的熱點(diǎn)，比如從馬氏珍珠貝肉蛋白[5]、牛乳酪蛋白[6]、大米[7]、龍須菜[8]、核桃[9]、松仁[10]等原料的酶解產(chǎn)物中已發(fā)現(xiàn)具有ACE抑制活性的多肽。

硒（Selenium，Se）是人體、動物體以及多種微生物體中各種重要生物學(xué)功能所必需的微量元素[11]，也是許多酶的重要組成部分，具有保護(hù)血管、維持心臟正常等功能[12]。研究證實(shí)，富硒肽具有抗氧化、降血壓、保肝、免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能，比如從富硒糙米蛋白水解物中得到了對DPPH自由基、OH自由基和O2-自由基具有強(qiáng)抗氧化活性的硒肽[13]和富硒免疫調(diào)節(jié)肽[14]；從富硒螺旋藻[15-16]和富硒茶[17]中分離鑒定出具有抑制ACE活性的硒肽。

辣木（Moringa oleiferaLam.）是一種生長在熱帶和亞熱帶的藥食兩用的植物[18]。2012年11月，我國衛(wèi)生部批準(zhǔn)辣木葉為新資源食品[19]，被中國綠色食品發(fā)展中心認(rèn)定為“國家首推綠色食品”[20]。辣木葉粉中蛋白質(zhì)含量豐富，高達(dá)27.6%～35.4%[21-22]，氨基酸種類多達(dá)19種（天冬氨酸、谷氨酸為主）[23]，可媲美大豆，是一種值得開發(fā)利用的優(yōu)質(zhì)植物蛋白。但是，辣木葉蛋白體外消化率低且多作為動物飼料使用，造成資源的極大浪費(fèi)[24]。研究表明，辣木葉蛋白及其酶解產(chǎn)物具有抗菌[25]、清除自由基能力和修復(fù)氧化損傷[26]以及改善高尿酸血癥和代謝紊亂[27]等功能活性，但關(guān)于辣木葉蛋白肽對ACE抑制活性的研究報(bào)道較少。將硒的降血壓作用與辣木葉肽的降血壓作用相結(jié)合開發(fā)富硒辣木葉低聚肽產(chǎn)品，可能具有更好的降血壓效果，但目前關(guān)于富硒辣木葉肽降血壓的效果尚未報(bào)道。本研究以富硒辣木葉為原料，通過堿溶酸沉法提取富硒辣木葉蛋白，研究不同蛋白酶以及酶解工藝對于ACE抑制肽的制備及ACE抑制率的影響，采用響應(yīng)面法明確最佳制備工藝，并對最優(yōu)工藝條件下酶解物的ACE抑制活性、氨基酸組分和硒含量進(jìn)行分析。本研究為辣木葉蛋白的深入研究提供參考依據(jù)，而且為富硒ACE抑制肽在功能性食品、醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論支持，以期促進(jìn)富硒辣木葉的高值化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

富硒辣木葉粉 由北部灣濱海富硒功能農(nóng)業(yè)研究院提供；木瓜蛋白酶（20萬U/g）、中性蛋白酶（10萬U/g）、胃蛋白酶（300萬U/g）、胰蛋白酶（25萬U/g） 南寧龐博生物工程有限公司；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）、N-[3-（2-呋喃基）丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（N-[3-（2-furyl）acryloyl]-Lphenyalanyl-glycyl-glycine，F(xiàn)APGG）、羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES） 美國Sigma-Aldrich公司；其他化學(xué)品和試劑 均為分析純。

2300多功能酶標(biāo)儀 PerkinElmer公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市華城海龍實(shí)驗(yàn)儀器廠；L530臺式低速自動平衡離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；FD-1型冷凍干燥機(jī) 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DH5000BII電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津泰斯特儀器有限公司；pH計(jì) 上海佑科儀器有限公司；電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司； AFS-9530原子熒光光度計(jì) 北京海光儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 富硒辣木葉蛋白的提取 基于堿溶酸沉原理，參考祝素瑩等[28]方法提取富硒辣木葉蛋白，并進(jìn)行部分改進(jìn)。稱取一定量富硒辣木葉粉，用0.01 mol/L NaOH溶液配成辣木葉粉溶液（料液比1:20）在45 ℃條件下水浴3 h后，4000 r/min下離心10 min，收集上清液。用HCl調(diào)整pH至4.5，室溫靜置10～20 min，4000 r/min下，棄上清得到蛋白質(zhì)沉淀，-40 ℃冷凍干燥24 h后即得富硒辣木葉蛋白粉。

1.2.2 富硒辣木葉蛋白ACE抑制肽的制備 參考趙爽等[29]的方法并略作修改。以ACE抑制活性為指標(biāo)，將富硒辣木葉蛋白粉加入蒸餾水配制成一定濃度的蛋白質(zhì)溶液，調(diào)節(jié)pH，加入一定量的酶，恒溫水浴搖床酶解3 h后于沸水浴滅酶10 min，冷卻至室溫，4000 r/min下離心20 min，上清液即為含ACE抑制肽的酶解液。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 選取4種蛋白酶并在其最適的條件下對富硒辣木葉蛋白進(jìn)行酶解，分別為木瓜蛋白酶（pH6.5，55 ℃）、中性蛋白酶（pH7，45 ℃）、胃蛋白酶（pH2，37 ℃）、胰蛋白酶（pH8，37 ℃）。在底物濃度為3%，酶底比為0.3%，酶解3 h，滅酶，離心，取酶解液測定ACE的抑制率，選擇合適的蛋白酶。

單因素基礎(chǔ)條件設(shè)為：酶解溫度3 h，pH8，底物濃度3%和酶底比0.3%。在最適酶的基礎(chǔ)上，其他單因素實(shí)驗(yàn)采用改變一個因素，固定其他因素不變的方式，分別探究酶解溫度（27、32、37、42、47 ℃），pH（7、7.5、8、8.5、9），底物濃度（1%、3%、5%、7%）和酶底比（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）對酶解物ACE抑制活性的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以底物濃度（A）、酶底比（B）和溫度（C）三個因素為自變量，以ACE抑制率為響應(yīng)值，選擇Design-Expert V8.0.6.1軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)并進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，確定酶解富硒辣木葉蛋白的最優(yōu)工藝條件。響應(yīng)面因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.5 ACE抑制率的測定 采用FAPGG法測定ACE抑制率[30]。緩沖液和反應(yīng)物分別為80 mmol/L pH8.3的HEPES-NaOH（含0.3 mol/L NaCl）和緩沖液配制的1 mmol/L FAPGG。將酶解液用超純水稀釋30倍，在酶標(biāo)板孔中依次加入40 μL待測樣品、50 μL底物和10 μL ACE溶液（0.1 U/mL），振蕩10 s后，快速放入酶標(biāo)儀中測定340 nm下的吸光度，記為A1，而后37 ℃孵育30 min后測定吸光值為A2。計(jì)算ΔA，ΔA = A1-A2，以單位時間內(nèi)吸光度值的變化表ACE酶活性。以緩沖液代替待測樣品作空白對照。按照式（1）計(jì)算ACE抑制率：

式（1）中：ΔAb為加入緩沖液時吸光度在30 min內(nèi)的變化；ΔAa為加入抑制劑時吸光度在30 min內(nèi)的變化。

1.2.6 最優(yōu)酶解物ACE抑制活性測定 將最優(yōu)酶解條件下的上清液冷凍干燥后，使用HEPES緩沖液（pH8.3）配制成不同濃度樣品溶液（0.1、0.25、0.5、1、2 mg/mL），測定ACE抑制率。IC50定義為ACE抑制率達(dá)50%時的多肽質(zhì)量濃度（mg/mL），用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件的概率單位法計(jì)算。

1.2.7 氨基酸組成測定 將最優(yōu)酶解條件下制備的富硒辣木葉ACE抑制肽冷凍干燥，獲得的凍干粉即為測定樣品。參照GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》，以外標(biāo)法檢測樣品液中17種氨基酸的濃度[31]。

1.2.8 硒含量的測定 根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.93-2017《食品中硒的測定》，采用氫化物原子熒光光譜法（HG-AFS）測定富硒辣木葉原料，富硒辣木葉提取蛋白和富硒辣木葉ACE抑制肽中的總硒含量[32]。稱取適量樣品置于錐形瓶中，用10 mL濃硝酸和高氯酸混合物（v/v，9:1）在150 ℃下消化2.5 h，冷卻后，加入5 mL 6 mol/L鹽酸將樣品中六價硒還原成四價硒。冷卻后，用超純水將消化后的溶液稀釋至25 mL，然后將10 mL的溶液轉(zhuǎn)移到反應(yīng)容器中，其中加入2 mL 6 mol/L鹽酸和1 mL 10% （w/w）鐵氰化鉀，混勻待測，同時做空白對照。

儀器條件為：負(fù)高壓280 V，硒燈電流80 mA，原子化器高度8 mm，載氣流量為300 mL/min；屏蔽氣流量為800 mL/min，讀數(shù)時間12 s，延遲時間3 s，重復(fù)測定3次，測定樣品硒含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，多組數(shù)據(jù)間進(jìn)行單因素方差分析（One-AVOVA中的Duncan’s test）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 蛋白酶的篩選 由于不同種類蛋白酶的作用位點(diǎn)不同，酶解獲得的多肽片段也不相同，表現(xiàn)出的體外ACE抑制活性存在差異[28]。由圖1可知，在各自適宜的條件下，不同蛋白酶酶解物對ACE抑制活性有顯著的影響（P＜0.05），ACE抑制率由高到低依次為胰蛋白酶（78.01%）＞中性蛋白酶（47.64%）＞胃蛋白酶（43.46%）＞木瓜蛋白酶（24.61%）。這說明富硒辣木葉蛋白結(jié)構(gòu)更適宜胰蛋白酶發(fā)揮作用，能夠有效釋放更多目標(biāo)肽段，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用胰蛋白酶為ACE抑制肽制備酶。Sun等[33]報(bào)道，經(jīng)胰蛋白酶水解的黃斑海蜇蛋白顯示出最強(qiáng)的ACE抑制活性。余虹等[8]也發(fā)現(xiàn)經(jīng)胰蛋白酶水解的龍須菜蛋白水解物對ACE的抑制能力最強(qiáng)。據(jù)報(bào)道，C末端Arg或Lys的存在能增強(qiáng)ACE抑制效價[34-36]，由于胰蛋白酶其酶切位點(diǎn)優(yōu)先在精氨酸和賴氨酸處裂解，因此胰蛋白酶水解產(chǎn)生的肽段C末端位置為精氨酸或賴氨酸，這可能是其酶解肽段活性較強(qiáng)的原因。

圖1 蛋白酶種類對酶解物ACE抑制率的影響Fig.1 Effects of protease species on ACE inhibitory activity of enzymatic hydrolysates

2.1.2 酶解溫度對酶解效果的影響 由圖2可知，在其他因素固定不變的條件下，酶解溫度對ACE抑制活性有顯著的影響（P＜0.05），隨著酶解溫度的升高，ACE抑制率先增加后降低，酶解溫度為37 ℃時，ACE抑制率達(dá)到最大值79.49%?？赡苡捎诖藭r酶活性較高，能更有效地水解蛋白質(zhì)，釋放具有抑制ACE活性的肽分子，當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，可能影響蛋白酶活性，進(jìn)而使ACE抑制率降低[37-38]，因此選用ACE抑制效果最佳的37 ℃進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 酶解溫度對ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on ACE inhibitory activity

圖3p H對ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of pH on ACE inhibitory activity

2.1.3p H對酶解效果的影響 由圖3可知，pH對富硒辣木葉肽的ACE抑制活性影響呈先升后降的趨勢，在pH7.5處達(dá)到最高值（84.56%，P＜0.05）后逐漸下降。pH是影響酶解效果的重要因素，它的影響體現(xiàn)在蛋白酶構(gòu)象、酶與蛋白質(zhì)的結(jié)合狀態(tài)等方面，pH過高或過低都不利于更好的酶解效果[39-40]。在對魔芋ACE抑制肽[41]和榛子粕ACE抑制肽[42]等研究中也觀察到類似變化，隨著pH變化所呈現(xiàn)的先升后降的趨勢與此吻合。因此，確定最適pH為7.5。

2.1.4 底物濃度對酶解效果的影響 由圖4可知，底物濃度對ACE抑制活性有顯著的影響（P＜0.05），在考察底物濃度范圍內(nèi)，酶解產(chǎn)物ACE抑制活性呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)酶解底物濃度為5%時，酶解得到的富硒辣木葉多肽產(chǎn)物具有最高的ACE抑制活性，為84.65%。當(dāng)?shù)孜餄舛壤^續(xù)增大，抑制率反而降低，一方面可能沒有足夠的酶催化底物反應(yīng)，另一方面酶解液過于粘稠，影響蛋白質(zhì)的自由擴(kuò)散，影響酶解效率[42-43]。最終選取底物濃度5%為最佳反應(yīng)條件。

圖4 底物濃度對ACE抑制率的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on ACE inhibitory activity

2.1.5 酶底比對酶解效果的影響 如圖5所示，酶底比對ACE抑制活性有顯著的影響（P＜0.05），酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢，當(dāng)酶底比為0.3%時，ACE抑制率達(dá)到最大，為77.18%，后再增加酶用量，ACE抑制活性下降，可能是過量的蛋白酶將具有活性的多肽繼續(xù)降解為活性低甚至無活性的小肽，而且還會造成不同程度的資源浪費(fèi)[44-46]。因此在進(jìn)行酶底比的選擇時，不僅要求考慮其對酶解效果的影響，還需考慮資源浪費(fèi)和經(jīng)濟(jì)成本等方面。因此，最佳酶解酶底比為0.3%。

圖5 酶底比對ACE抑制率的影響Fig.5 Effect of enzyme/substrate on ACE inhibitory activity

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素基礎(chǔ)上，以底物濃度（A）、酶底比（B）和溫度（C）三個因素為自變量，以ACE抑制率為響應(yīng)值，利用利用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)，對酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Design and results of the response surface experiment

表3 響應(yīng)面二次模型方差分析Table 3 Analysis of variance for response surface quadratic model

2.2.2 回歸方程的建立與檢驗(yàn) 利用軟件（Design Expert V 8.0.6.1）對表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程：Y=87.44+3.95A-1.02B+2.28C-5.57AB-0.18AC+0.65BC-8.30A2-2.30B2-1.94C2。

對擬合出的回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（見表3），該模型的F值為4.33，P=0.0331＜0.05，表明該模型較顯著，失擬項(xiàng)P=0.0548＞0.05，不顯著。說明未知因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響較??；即該模型在被研究的整個回歸區(qū)域內(nèi)擬合較好，可用于預(yù)測酶解產(chǎn)物的ACE抑制率，所得二次回歸方程可用于擬合三個參數(shù)和響應(yīng)值間的關(guān)系[47-48]。

觀察單個變量以及變量間兩兩組合的P值，發(fā)現(xiàn)單個變量中底物濃度對響應(yīng)值的影響最為顯著，酶底比及溫度對響應(yīng)值的影響不顯著；根據(jù)P值推測三個因素對酶解液ACE抑制率的影響程度為：底物濃度＞溫度＞酶底比。二次項(xiàng)中AB的P=0.0294＜0.05，說明底物濃度和酶底比間的交互作用對ACE抑制率存在顯著影響。變異系數(shù)（Coefficient of Variance，CV）反映模型的置信度，CV值越低模型的置信度越高[49]；當(dāng)變異系數(shù)＜10%時，模型是可靠的[50]，本實(shí)驗(yàn)的CV值為5%，說明模型方程能夠很好地反映真實(shí)的實(shí)驗(yàn)值。綜上，本實(shí)驗(yàn)所得出的模型有較好的可靠性，可以應(yīng)用于后續(xù)的預(yù)測之中。響應(yīng)面交互作用（圖6～圖8）結(jié)果表明，AB對抑制率的影響顯著，其他因素交互作用不顯著。

圖6 底物濃度和酶底比對ACE抑制率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface diagram of the influence of substrate concentration and enzyme/substrate on ACE inhibitory activity

圖8 酶底比和溫度對ACE抑制率影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface diagram of the influence of enzyme/substrate and hydrolysis temperature on ACE inhibitory activity

通過Design-Expert V 8.0.6.1軟件分析及預(yù)測，得到胰蛋白酶酶解富硒辣木葉蛋白制備ACE抑制肽的最佳工藝參數(shù)：底物濃度5.97%、酶底比0.23%、溫度39.2 ℃。對最優(yōu)工藝進(jìn)行驗(yàn)證，將酶解參數(shù)設(shè)定為底物濃度5.97%、酶底比0.23%、溫度39.2 ℃，酶解時間3 h，pH7.5，酶解產(chǎn)物的實(shí)際ACE抑制率為88.97%，接近預(yù)測值89.27%，說明該回歸模型對試驗(yàn)結(jié)果的分析預(yù)測準(zhǔn)確。

圖7 底物濃度和溫度對ACE抑制率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface diagram of the influence of substrate concentration and hydrolysis temperature on ACE inhibitory activity

2.3 富硒辣木葉蛋白肽ACE抑制活性分析

圖9可見，ACE抑制率與樣品的濃度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，濃度的升高會提高ACE抑制率，呈現(xiàn)劑量依賴性。在樣品溶液濃度為0.5 mg/mL時，ACE抑制率已經(jīng)超過50%；在濃度達(dá)到2 mg/mL時，ACE抑制率達(dá)到了65.98%；利用SPSS軟件得到該條件下富硒辣木葉ACE抑制肽的IC50為0.522 mg/mL。封張萍等[51]通過胰蛋白酶水解大米蛋白制備ACE抑制肽，測得經(jīng)大孔樹脂吸附后大米ACE抑制肽的IC50值為1.571 mg/mL。Wang等[52]用響應(yīng)面法優(yōu)化毛蝦的發(fā)酵工藝，檢測所得到發(fā)酵產(chǎn)物的ACE抑制能力，在最優(yōu)發(fā)酵條件下發(fā)酵產(chǎn)物的IC50值為3.370 mg/mL。綜上，酶解制備的富硒辣木葉蛋白ACE抑制肽在還未進(jìn)行進(jìn)一步分離純化時便具有較好的ACE抑制能力，預(yù)計(jì)后續(xù)通過進(jìn)一步篩選可以得到ACE抑制效果更好的單體。

圖9 不同濃度酶解物的ACE抑制率Fig.9 ACE inhibitory activity of enzymatic hydrolysates at different concentrations

2.4 氨基酸組成分析

富硒辣木葉蛋白酶解物的氨基酸組成見表4。在17種氨基酸中有7種人體必需氨基酸，占比為24.05%。單種氨基酸谷氨酸含量最多，占比7.89%，其次為占比6.31%的天冬氨酸，這一結(jié)果和大蒜降壓肽[31]以及魚類和貝類的降壓肽[53-54]中的結(jié)果相似。此外，研究表明降血壓肽分子中的疏水性氨基酸較為重要，其側(cè)鏈可與ACE受體緊密結(jié)合，因而ACE抑制活性較強(qiáng)[55-56]。Miyoshi等[57]研究表明，ACE傾向于與含有疏水性氨基酸的底物結(jié)合。另外組成多肽的氨基酸親疏水性和多肽的立體化學(xué)構(gòu)象影響其ACE抑制肽的活性，這是受到ACE的C端結(jié)構(gòu)域?yàn)槭杷原h(huán)境所影響的[58]；并且多肽中疏水性氨基酸的含量以及所在位置對多肽的空間結(jié)構(gòu)也會存在影響，因此疏水性氨基酸的含量會對ACE抑制肽的活性造成重大影響[59]。實(shí)驗(yàn)分析也表明，富硒辣木葉蛋白酶解物的疏水性氨基酸含量較高，達(dá)20.6%，這與其較高的ACE抑制活性具有密切聯(lián)系。

表4 富硒辣木葉蛋白酶解物的氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of Se-enriched M. oleifera leaves protein hydrolysate

2.5 硒含量分析

由表5可知，富硒辣木葉原料，富硒辣木葉提取蛋白和富硒辣木葉ACE抑制肽中硒含量分別為9.84、16.32、18.31 mg/kg。這一結(jié)果說明富硒辣木葉中的硒元素主要與蛋白結(jié)合，并且酶解工藝優(yōu)化研究使硒含量在活性肽中進(jìn)一步富集。與其他富硒產(chǎn)品相比，辣木葉中的硒含量是一些富硒大米的58倍[60]，辣木葉蛋白的硒含量是富硒玉米籽蛋白的2倍[61]，且富硒辣木葉肽的硒含量是富硒大米肽的7.8倍[62]，表明富硒辣木葉是一種硒含量較高的植物資源。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，硒可以通過直接清除氧自由基、構(gòu)成谷胱甘肽過氧化物酶、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等機(jī)制防治高血壓與冠心病[12]，所以硒的含量也可能是影響酶解產(chǎn)物ACE抑制活性的重要因素之一。因此硒蛋白及其原料辣木葉粉制備的含硒ACE抑制肽將是辣木葉中極具開發(fā)潛力的含硒生物活性物質(zhì)。

表5 不同樣品的硒含量Table 5 Se content of different samples

3 結(jié)論

通過堿溶酸沉法提取制備富硒辣木葉蛋白，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化，確定胰蛋白酶酶解富硒辣木葉蛋白制備ACE抑制肽的最佳工藝條件為：pH7.5、底物濃度5.97%、酶底比0.23%、溫度39.2 ℃，酶解時間3 h，此時ACE抑制率為88.97%。并對最優(yōu)酶解條件下得到的酶解液凍干粉進(jìn)行體外ACE抑制率測定，結(jié)果顯示富硒辣木葉蛋白酶解物具有較強(qiáng)的ACE抑制能力（IC50=0.522 mg/mL）；氨基酸分析結(jié)果表明，該酶解物的天冬氨酸、谷氨酸含量及疏水性氨基酸含量豐富；同時富硒辣木葉蛋白制備的ACE抑制肽的硒含量豐富（18.31 mg/kg）。本研究為富硒辣木葉在相關(guān)功能性食品領(lǐng)域的開發(fā)提供了理論依據(jù)。