饑餓脅迫對(duì)猛蝦蛄溶菌酶和消化酶活性的影響

趙旺 溫為庚 譚春明 黃星美 楊蕊 陳明強(qiáng) 楊其彬 陳旭

(1 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心，海南三亞 572018；2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)試驗(yàn)室，廣東廣州 510300；3 三亞熱帶水產(chǎn)研究院，海南三亞 572018)

猛蝦蛄(Harpiosquillaharpax)隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門、軟甲綱、口足目、蝦蛄科、猛蝦蛄屬，其生活的底質(zhì)以泥底或沙泥底為主，廣泛分布于印度尼西亞、馬來西亞、日本、中國(guó)東南沿海等，在地中海沿岸和墨西哥灣也有分布[1-6]。猛蝦蛄體形較大，可食部分較多，其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛[7]。隨著人們生活水平的提高，猛蝦蛄的市場(chǎng)需求不斷增加，對(duì)其資源的開發(fā)利用變得日益重要。人工養(yǎng)殖是猛蝦蛄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要部分。在養(yǎng)殖實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，猛蝦蛄生長(zhǎng)受各種環(huán)境因素的影響較大，例如，當(dāng)飼養(yǎng)密度過大、投喂不及時(shí)、投喂不均或投飼方式改變時(shí)，猛蝦蛄易受到饑餓或營(yíng)養(yǎng)不足的脅迫，其生長(zhǎng)性能和養(yǎng)殖周期也會(huì)受到影響。

研究證實(shí)，饑餓脅迫會(huì)導(dǎo)致魚、蝦類動(dòng)物發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，影響動(dòng)物的行為、存活、生長(zhǎng)、代謝、繁殖，以及組織結(jié)構(gòu)、血液常規(guī)指標(biāo)、酶活性、免疫功能、肌體組成成分等，嚴(yán)重時(shí)可引起動(dòng)物神經(jīng)內(nèi)分泌功能紊亂，擾亂肝胰臟生長(zhǎng)激素、胰島素和類胰島素因子等的表達(dá)，誘發(fā)各種疾病，甚至導(dǎo)致死亡[8-13]。水生動(dòng)物在受到脅迫時(shí)，為了維持生理活動(dòng)，通常會(huì)通過改變自身各種酶的活性來調(diào)節(jié)代謝水平、能量分配和能源物質(zhì)消耗。

目前，有關(guān)饑餓脅迫對(duì)蝦類生長(zhǎng)、體成分、消化功能、免疫功能等影響的研究已有不少報(bào)道。例如，對(duì)克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)進(jìn)行短時(shí)期饑餓脅迫后，其蛋白酶活力大幅度下降[14]，克氏原螯蝦仔蝦消化酶的活性隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)“先上升后下降”的趨勢(shì)[15]，說明該蝦通過降低消化酶活力來適應(yīng)饑餓脅迫；南美白對(duì)蝦(Penaeusvannamei)受到饑餓脅迫后，其胰蛋白酶和糜蛋白酶的活力下降了40%～60%[16]；饑餓脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)的影響主要集中在補(bǔ)償生長(zhǎng)、行為變化、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗、生化組成、能量收支等方面[17]，可以使其體內(nèi)消化酶活性呈現(xiàn)“先升后降”的趨勢(shì)，進(jìn)而影響其攝食行為[18]。溶菌酶是非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成成分，其活性的變化可作為動(dòng)物免疫機(jī)能狀態(tài)的指標(biāo)。趙朝陽(yáng)等[14]研究了饑餓脅迫對(duì)克氏原螯蝦部分免疫指標(biāo)的影響，結(jié)果表明，饑餓脅迫對(duì)超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性具有一定影響；周凡等[19]研究發(fā)現(xiàn)，饑餓脅迫對(duì)莫桑比克草蝦(Penaeusmonodon)幼蝦免疫因子具有明顯的影響。目前，有關(guān)饑餓脅迫對(duì)猛蝦蛄機(jī)體酶活性影響的研究尚不多見。

為探究在饑餓脅迫下猛蝦蛄體內(nèi)酶活性的變化規(guī)律，本研究開展了猛蝦蛄饑餓脅迫試驗(yàn)，測(cè)定了饑餓時(shí)長(zhǎng)對(duì)其體內(nèi)溶菌酶及常見消化酶(胃蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶)活性的影響，以期為研究猛蝦蛄在逆境脅迫條件下的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制提供依據(jù)，為提高猛蝦蛄養(yǎng)殖存活率和豐富其養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)理論提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用猛蝦蛄購(gòu)自海南省陵水黎族自治縣新村漁港，共156尾，平均體質(zhì)量48.39 g/尾，體長(zhǎng)14.5～15.8 cm，體寬2.4～3.1 cm。用加水、充氧、扎口的厚尼龍袋將其運(yùn)送至熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心陵水基地。試驗(yàn)在該基地進(jìn)行。

試驗(yàn)前，先將猛蝦蛄用沙濾海水暫養(yǎng)7 d，其間每天分別于6：00、19：00飽食投喂新鮮的凡納濱對(duì)蝦(體質(zhì)量6～10 g，剪去頭胸甲和尾尖)各1次，投喂2 h后清除殘餌。暫養(yǎng)結(jié)束后，統(tǒng)一停止投喂。

養(yǎng)殖過程中，水溫為(26.5±1.0)℃，pH為8.0±0.2，鹽度為33.0±0.6，溶解氧在6.8 mg/L以上，氨氮含量低于0.01 mg/L，亞硝酸鹽含量低于0.03 mg/L。每日換水1次，每次換水50%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取經(jīng)過暫養(yǎng)、健康無(wú)病的猛蝦蛄120尾，隨機(jī)分放于60口水泥池(長(zhǎng)100 cm、寬100 cm、水深100 cm)中，每口試驗(yàn)池投放2尾。試驗(yàn)期間，池內(nèi)連續(xù)充氣，不投飼，其他飼養(yǎng)條件與暫養(yǎng)時(shí)相同。分別于試驗(yàn)第1、6、11、21天(記為饑餓脅迫0、5、10和20 d)取樣，每次隨機(jī)取5～10尾，如發(fā)現(xiàn)有猛蝦蛄死亡，則該池作廢。取樣時(shí)，先剪掉蝦的掠足，并用濾紙吸干水分。用1 mL注射器從靠近蝦尾節(jié)處斜插入圍心管，抽取血液于離心管中。剪開蝦背部甲殼，從尾部寬闊部位剪取肌肉0.5 g，分離出腸道和肝胰臟，分別置于離心管中。所有操作在冰面進(jìn)行，樣品置于-20 ℃保存。

1.2.2 樣品處理

將各組所采集的腸道、肝胰腺、肌肉樣品稱量后，按質(zhì)量和體積比1∶2與0.2 mol/L生理鹽水進(jìn)行混合、研磨。研磨液于4 ℃、4 000 r/min下離心10 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱保存。分別測(cè)定血液和肌肉樣品的總蛋白和溶菌酶活性指標(biāo)；分別測(cè)定腸道、肝胰腺的總蛋白、溶菌酶、胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性指標(biāo)。總蛋白、溶菌酶、胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性指標(biāo)分別按照相關(guān)試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)分別為A045-4-2、A050-1-1、A080-1、A054-1-1、C016-1-1)的步驟進(jìn)行測(cè)定，酶活力按照各說明書指標(biāo)進(jìn)行計(jì)算。每組樣品平行測(cè)定3次。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。數(shù)據(jù)經(jīng)EXCEL 2010軟件初步整理后，用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。先對(duì)數(shù)據(jù)作單因素方差分析(one-way ANOVA)，若處理間有顯著差異，再用Duncan法比較均值間的差異顯著性，設(shè)顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果

2.1 饑餓脅迫對(duì)猛蝦蛄溶菌酶活性的影響

饑餓脅迫對(duì)猛蝦蛄溶菌酶(LZ)活性的影響見圖1。結(jié)果顯示，饑餓時(shí)長(zhǎng)對(duì)猛蝦蛄各組織中溶菌酶的活性影響顯著(P<0.05)。各組樣品的溶菌酶活性均隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)。饑餓脅迫10 d，猛蝦蛄血液、腸道、肝胰腺和肌肉組織溶菌酶的活性與未經(jīng)饑餓脅迫(0 d)相比分別從56.30、169.45、101.74、104.74 U/mg提高到117.89、322.86、152.57和174.69 U/mg。之后，隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)，各組溶菌酶活力均有所下降。

注：無(wú)相同字母表示組內(nèi)數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)，下同。

2.2 饑餓脅迫對(duì)猛蝦蛄胃蛋白酶活性的影響

饑餓脅迫對(duì)猛蝦蛄胃蛋白酶活性的影響見圖2。總體上，饑餓脅迫時(shí)長(zhǎng)對(duì)猛蝦蛄胃蛋白酶的活性影響明顯(P<0.05)，但不同組織中胃蛋白酶的活性隨時(shí)長(zhǎng)的變化不一致。其中，腸道中胃蛋白酶活性在饑餓脅迫5 d時(shí)略有下降，之后，隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)不斷上升，并在饑餓脅迫20 d時(shí)達(dá)到3.34 U/mg；而肝胰腺中胃蛋白酶的活性則在饑餓脅迫5 d后呈現(xiàn)先降后升的變化趨勢(shì)，饑餓脅迫5～10 d，胃蛋白酶活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，10 d后開始呈現(xiàn)逐步上升趨勢(shì)。

圖2 饑餓脅迫時(shí)長(zhǎng)對(duì)猛蝦蛄胃蛋白酶活性的影響

2.3 饑餓脅迫對(duì)猛蝦蛄脂肪酶活性的影響

饑餓脅迫對(duì)猛蝦蛄脂肪酶活性的影響見圖3。試驗(yàn)結(jié)果顯示，饑餓脅迫時(shí)長(zhǎng)對(duì)猛蝦蛄腸道和肝胰腺中的脂肪酶活性影響顯著(P<0.05)。腸道中的脂肪酶活性隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，而且波動(dòng)幅度較大，饑餓脅迫5 d時(shí)，腸道中的脂肪酶活性最高，達(dá)293.54 U/g，但在20 d時(shí)降低至114.05 U/g；而肝胰腺中脂肪酶的活性在饑餓脅迫0～5 d變化較小，5～10 d出現(xiàn)大幅度上升，10 d后又略有下降。

圖3 饑餓脅迫時(shí)長(zhǎng)對(duì)猛蝦蛄脂肪酶活性的影響

2.4 饑餓脅迫對(duì)猛蝦蛄淀粉酶活性的影響

饑餓脅迫對(duì)猛蝦蛄淀粉酶活性的影響見圖4。結(jié)果顯示，饑餓時(shí)長(zhǎng)對(duì)猛蝦蛄淀粉酶的活性影響顯著(P<0.05)。猛蝦蛄腸道淀粉酶的活性隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，在饑餓脅迫5 d時(shí)，淀粉酶活性達(dá)到最高(4.28 U/mg)，之后開始下降，并在20 d時(shí)降至最低(2.12 U/mg)；而肝胰腺淀粉酶的活性則隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先降后升的變化趨勢(shì)。

圖4 饑餓脅迫時(shí)長(zhǎng)對(duì)猛蝦蛄淀粉酶活性的影響

3 討論

外部環(huán)境的改變會(huì)導(dǎo)致水生動(dòng)物機(jī)體消化和免疫相關(guān)酶類的活性發(fā)生變化，進(jìn)而影響其攝食、生長(zhǎng)和健康[20-21]。水生動(dòng)物在饑餓狀態(tài)時(shí)，主要通過改變身體各種酶的活性來調(diào)節(jié)代謝水平、能量分配和能源物質(zhì)消耗，以適應(yīng)食物缺乏造成的脅迫，維持機(jī)體生理活動(dòng)。Pedersen等[22]指出，大西洋鯡(Clupeaharengus)仔魚體內(nèi)胰蛋白酶及酶原含量的變化與食物數(shù)量有關(guān)，魚類的攝食種類和數(shù)量受體內(nèi)消化酶分泌及其活性的影響。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，饑餓時(shí)長(zhǎng)對(duì)猛蝦蛄血液、腸道、肝胰腺和肌肉組織中溶菌酶的活性有顯著影響(P<0.05)。各組織中的溶菌酶活性均隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后降低的變化規(guī)律。這說明當(dāng)猛蝦蛄受到一定時(shí)間的饑餓脅迫后，其體內(nèi)的溶菌酶會(huì)被刺激而升高，但當(dāng)脅迫時(shí)長(zhǎng)超過其適應(yīng)范圍時(shí)，溶菌酶活性便會(huì)下降。這與周元雪[23]關(guān)于饑餓脅迫對(duì)口蝦蛄免疫因子影響的研究結(jié)果相似，即短期(5 d)饑餓脅迫可激活口蝦蛄溶菌酶的活性，而長(zhǎng)期(25 d)饑餓脅迫會(huì)使口蝦蛄溶菌酶的活性降低，總體上，溶菌酶活性隨著饑餓時(shí)長(zhǎng)增加呈先升后降的趨勢(shì)。本試驗(yàn)中，在饑餓脅迫5 d時(shí)，各組織溶菌酶活性變化均不大，說明猛蝦蛄具有面對(duì)饑餓脅迫的應(yīng)激適應(yīng)機(jī)制，即在饑餓初期，機(jī)體可以通過免疫機(jī)能來適應(yīng)外部環(huán)境的變化，進(jìn)行自我保護(hù)[24]。在整個(gè)饑餓脅迫階段，溶菌酶的活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在饑餓脅迫10 d時(shí)達(dá)到最高值，說明隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)，猛蝦蛄長(zhǎng)時(shí)間未獲得外源性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其免疫抗病機(jī)能下降了[23]。

在研究饑餓脅迫對(duì)猛蝦蛄胃蛋白酶活性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，饑餓脅迫對(duì)猛蝦蛄各組織胃蛋白酶的活性影響顯著(P<0.05)，但各組織中胃蛋白酶活性的變化趨勢(shì)不一致。腸道中胃蛋白酶的活性隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)，在饑餓脅迫5 d時(shí)略有下降，之后不斷上升，在饑餓脅迫20 d時(shí)達(dá)到最高值3.34 U/mg。這可能是胃黏膜的通透性發(fā)生了改變所致[25]。在饑餓脅迫5 d時(shí)，猛蝦蛄腸道胃蛋白酶的活性有所下降，之后不斷上升，說明饑餓脅迫可以促進(jìn)腸道胃蛋白酶的分泌并激發(fā)其活性。谷江穩(wěn)[26]在研究饑餓脅迫對(duì)銀鯧幼魚消化系統(tǒng)的影響時(shí)指出，在饑餓過程中，各消化器官的胃蛋白酶活性均呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢(shì)，這與本文的研究結(jié)果相一致。但也有研究報(bào)道，隨著饑餓脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，動(dòng)物體內(nèi)胃蛋白酶活力呈現(xiàn)先升后降的變化，可能是饑餓時(shí)間過長(zhǎng)，機(jī)體的應(yīng)激適應(yīng)能力下降所致[18，27]。肝胰腺中的胃蛋白酶活性呈現(xiàn)先降后升的變化趨勢(shì)，肝胰腺中胃蛋白酶活性下降可能是由于饑餓脅迫影響了猛蝦蛄肝胰腺組織結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的[28]，隨著饑餓脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，猛蝦蛄長(zhǎng)時(shí)間無(wú)法攝取外源性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其肝胰腺胃蛋白酶的活性開始提高，可能是肝胰腺開始消耗有機(jī)物質(zhì)，為機(jī)體提供能量[29]。

饑餓脅迫對(duì)猛蝦蛄脂肪酶活性影響的結(jié)果表明，饑餓時(shí)長(zhǎng)對(duì)猛蝦蛄各組織脂肪酶活性影響顯著(P<0.05)。其中，肝胰腺脂肪酶的活性在饑餓脅迫0～5 d變化較小，5～10 d出現(xiàn)大幅度上升，10 d后又略有下降。這是因?yàn)樵谳^長(zhǎng)時(shí)間的饑餓脅迫下，機(jī)體可通過促進(jìn)淀粉酶分泌提高其活性來利用體內(nèi)儲(chǔ)存的脂肪作為能源物質(zhì)[27]，之后機(jī)體盡可能將代謝保持在一定水平之上，以保證在重新獲取食物或面臨其他的環(huán)境脅迫時(shí)能承受相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)[17，30]。腸道中脂肪酶的活性隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，而且波動(dòng)幅度較大，饑餓脅迫5 d時(shí)，腸道脂肪酶活性達(dá)到最高，在20 d時(shí)又降至最低。這說明腸道對(duì)饑餓脅迫比其他組織更為敏感，在饑餓脅迫后期，腸道長(zhǎng)時(shí)間沒有受到食物蠕動(dòng)的機(jī)械刺激，導(dǎo)致消化酶液的分泌量下降[15，31]。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，饑餓時(shí)間對(duì)猛蝦蛄淀粉酶活性影響顯著(P<0.05)。隨著饑餓脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，肝胰腺淀粉酶的活性呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)，并在饑餓脅迫20 d時(shí)達(dá)到最高；而腸道淀粉酶活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，在饑餓脅迫5 d時(shí)達(dá)到最高(4.28 U/mg)，之后開始下降，并在20 d時(shí)降至最低(2.12 U/mg)。這表明腸道內(nèi)的淀粉酶活性發(fā)生了與饑餓脅迫相適應(yīng)的變化，并且短期饑餓對(duì)猛蝦蛄造成的氧化應(yīng)激損傷可逆[27，32]。試驗(yàn)期間，腸道內(nèi)的淀粉酶活性與脂肪酶活性變化趨勢(shì)一致，這說明在受到饑餓脅迫時(shí)，猛蝦蛄體內(nèi)的脂肪酶活性和淀粉酶活性同時(shí)受到調(diào)節(jié)[33]。試驗(yàn)期間，肝胰腺淀粉酶活性的變化趨勢(shì)與上述趨勢(shì)相反。這可能是因?yàn)轲囸I脅迫對(duì)各組織的影響程度不同，消化道部位黏膜層上皮短時(shí)間內(nèi)不會(huì)受到太大的損傷，而肝細(xì)胞、腺泡細(xì)胞短時(shí)間內(nèi)便會(huì)出現(xiàn)萎縮和排列不規(guī)則等現(xiàn)象[34]。

猛蝦蛄作為中國(guó)東南沿海分布廣泛的海產(chǎn)品和具有巨大開發(fā)潛力的蝦蛄品種[35]，對(duì)其生長(zhǎng)性能的深入研究和養(yǎng)殖技術(shù)的提高迫在眉睫。本文所探討的饑餓脅迫對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)、代謝、組織結(jié)構(gòu)、血液常規(guī)指標(biāo)、酶活性和免疫功能等都有影響。研究發(fā)現(xiàn)，饑餓初期猛蝦蛄體內(nèi)溶菌酶、胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性均有所上升，但是隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，各組織溶菌酶和消化酶活性出現(xiàn)不同程度的下降。這可能是猛蝦蛄具有面對(duì)饑餓脅迫的應(yīng)激適應(yīng)機(jī)制。饑餓初期，機(jī)體可以通過免疫機(jī)能來適應(yīng)外部環(huán)境的變化，進(jìn)行自我保護(hù)，并且短時(shí)間饑餓對(duì)猛蝦蛄造成的氧化應(yīng)激損傷可逆，但在長(zhǎng)時(shí)間的饑餓脅迫下，機(jī)體的應(yīng)激適應(yīng)能力和免疫抗病能力下降；同時(shí)，在長(zhǎng)期饑餓脅迫下，猛蝦蛄可通過促進(jìn)脂肪酶和淀粉酶的分泌并激發(fā)其活性來利用體內(nèi)儲(chǔ)存的能源物質(zhì)，以維持生理活動(dòng)。本研究對(duì)猛蝦蛄的養(yǎng)殖和投飼具有實(shí)用意義，猛蝦蛄個(gè)體溶菌酶和消化酶活性的變化也充實(shí)了饑餓脅迫對(duì)其應(yīng)激試驗(yàn)免疫和消化性能層面的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，可為其他水產(chǎn)動(dòng)物饑餓脅迫試驗(yàn)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，養(yǎng)殖過程中饑餓脅迫時(shí)長(zhǎng)對(duì)猛蝦蛄溶菌酶和各消化酶活力均有一定影響。猛蝦蛄體內(nèi)血液、腸道、肝胰腺和肌肉組織溶菌酶的活性均隨著饑餓脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)；同時(shí)，腸道和肝胰腺中的胃蛋白酶和脂肪酶的活性隨著饑餓脅迫時(shí)長(zhǎng)具有相似的變化趨勢(shì)，但存在顯著性差異(P<0.05)；肝胰腺和腸道中的淀粉酶活性則呈相反的變化趨勢(shì)。研究表明，在饑餓脅迫期間，猛蝦蛄可改變機(jī)體溶菌酶及消化酶的活性來維持生長(zhǎng)和代謝。