大口黑鱸苗種致病性類志賀鄰單胞菌的分離和鑒定

慶輝 周國(guó)勤 陸健 張佳佳 王佩佩

(南京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，江蘇南京 210036)

加州鱸又名大口黑鱸(Micropterussalmoides)，隸屬于鱸形目、太陽(yáng)魚科、黑鱸屬，原產(chǎn)于美國(guó)加利福尼亞州密西西比河水系，20世紀(jì)80年代被引入中國(guó)，因其具有適應(yīng)性強(qiáng)、養(yǎng)殖周期短，營(yíng)養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點(diǎn)而受到養(yǎng)殖者和消費(fèi)者的喜愛(ài)，是深受市場(chǎng)歡迎的優(yōu)質(zhì)特色淡水養(yǎng)殖品種[1-2]。近年來(lái)，隨著大口黑鱸專用人工配合飼料的成功研發(fā)，大口黑鱸的養(yǎng)殖產(chǎn)量有了大幅提升。但伴隨高密度養(yǎng)殖而來(lái)的是病害也隨之增多。近年來(lái)，由于水體污染、管理不善等因素的影響，大口黑鱸的病害呈現(xiàn)多樣化的特點(diǎn)，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

2021年3月初，江蘇省南京市的某養(yǎng)殖戶反映，其溫室養(yǎng)殖的大口黑鱸魚種開(kāi)始零星死亡。該養(yǎng)殖戶自行使用聚維酮碘全池潑灑，連續(xù)用藥4 d，但病情未見(jiàn)好轉(zhuǎn)，且魚種死亡數(shù)量日漸增多。本試驗(yàn)采用理化方法和分子生物學(xué)方法對(duì)該溫室患病大口黑鱸的病原進(jìn)行了研究，以期為診斷、防治大口黑鱸苗種病害提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

患病大口黑鱸來(lái)自江蘇南京某養(yǎng)殖場(chǎng)育苗溫室，3月齡，體質(zhì)量25～35 g，臨床癥狀表現(xiàn)為患病個(gè)體反應(yīng)遲鈍，離群獨(dú)游，鰭部潰爛、出血，肛門紅腫，食欲下降。

試驗(yàn)所用胰蛋白大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白大豆肉湯(TSB)均購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。藥敏分析試劑板購(gòu)自南京菲恩醫(yī)療科技有限公司。所有化學(xué)試劑均為分析純。DNA提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 病原菌的分離與純化

取瀕死的病魚，現(xiàn)場(chǎng)用70%的酒精棉球反復(fù)擦拭消毒病魚的腹部和體表，用無(wú)菌剪刀打開(kāi)腹腔，無(wú)菌操作取病魚肝臟、脾臟，劃線接種于血平板，35 ℃培養(yǎng)24 h后觀察發(fā)現(xiàn)，有1個(gè)菌落出現(xiàn)微溶血現(xiàn)象。挑取此菌落，劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，35 ℃純化培養(yǎng)24 h，將純化后的菌株在TSB液體培養(yǎng)基中增殖備用，并將該分離菌株編號(hào)為Q-1。取少量純化菌置于載玻片上，經(jīng)革蘭氏染色后進(jìn)行顯微鏡觀察。

1.3 回歸感染試驗(yàn)

將菌株Q-1無(wú)菌接種至TSA平板上，35 ℃培養(yǎng)20～24 h后，挑取單一菌株至TSB液體培養(yǎng)基中，以180 r/min、35 ℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期(20～24 h)。細(xì)菌懸液離心去上清液后，用無(wú)菌生理鹽水10倍梯度稀釋后涂布于TSA培養(yǎng)基上，平板計(jì)數(shù)，計(jì)算出細(xì)菌懸液濃度為5.0×108cfu/mL。隨后，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液(PBS)制備菌懸液。

選取相同規(guī)格的健康的大口黑鱸40尾，平均分為A、B兩組，采用兩種不同感染方式進(jìn)行試驗(yàn)，并分別設(shè)置對(duì)照組進(jìn)行對(duì)照。

腹腔注射感染試驗(yàn)：將濃度為1.0×108cfu/mL的菌懸液，以腹腔注射(0.3 mL/尾)的方式進(jìn)行人工感染，對(duì)照組則注射同量無(wú)菌PBS緩沖液。

浸浴感染試驗(yàn)：選擇體表無(wú)損傷的健康大口黑鱸，放入含菌量1.0×108cfu/mL的曝氣自來(lái)水中進(jìn)行暫養(yǎng)觀察，對(duì)照組不加菌液。

1.4 病原菌的鑒定

試驗(yàn)采用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB法)提取細(xì)菌DNA。提取的細(xì)菌DNA經(jīng)核酸電泳驗(yàn)證后，置于-20 ℃冰箱保存。擴(kuò)增引物為：27F(5′-agagtttgatcctggctcag-3′)/1492R(5′-tacggttaccttgttacgactt-3′)。反應(yīng)總體系50 μL：Master Mix 25 μL，去離子滅菌水20 μL，DNA模板3 μL，上、下游引物各1 μL。

16S rRNA基因擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收目的片段，進(jìn)行T載體克隆，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序工作由生工生物工程(上海)有限公司完成。測(cè)序結(jié)果比對(duì)拼接后在National Center for Biotechnology Information(NCBI)上在線分析。

1.5 生化檢測(cè)

參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[3]中的細(xì)菌鑒定方法，對(duì)完成增殖的Q-1菌株進(jìn)行各項(xiàng)生化指標(biāo)測(cè)定。

1.6 藥敏試驗(yàn)

選用FIEN-MED藥敏分析試劑板對(duì)Q-1菌株進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。該藥敏分析試劑板的主要成分及板條設(shè)置見(jiàn)表1。

表1 藥敏分析試劑板的主要成分及板條設(shè)置 單位：μg/mL

2 結(jié)果和分析

2.1 病原菌的分離和純化

將菌株Q-1接種到TSA培養(yǎng)基，于35 ℃培養(yǎng)24 h后，可見(jiàn)其生長(zhǎng)良好，菌落呈圓形、中央微隆起、呈半透明、表面濕潤(rùn)光滑邊緣整齊，整體呈灰白色、半透明。經(jīng)革蘭氏染色后觀察發(fā)現(xiàn)，該菌株為革蘭氏陰性桿菌(見(jiàn)圖1)。

圖1 分離菌株Q-1革蘭氏染色

2.2 回歸感染試驗(yàn)

由表2可見(jiàn)，試驗(yàn)組20尾大口黑鱸注射或浸浴接種Q-1菌株后，3 d內(nèi)全部死亡，致死率為100%。其中采用腹腔注射感染的試驗(yàn)組大口黑鱸24 h后即出現(xiàn)死亡，60 h內(nèi)全部死亡。采用浸浴感染的試驗(yàn)組大口黑鱸36 h后出現(xiàn)死亡，72 h內(nèi)全部死亡。人工感染致死的大口黑鱸所表現(xiàn)出的臨床癥狀與患病大口黑鱸一致，且從其體內(nèi)分離到與Q-1菌株形態(tài)特征、生化性質(zhì)一致的細(xì)菌，而對(duì)照組魚沒(méi)有出現(xiàn)死亡，也未分離出該細(xì)菌。

表2 回歸感染試驗(yàn)結(jié)果

2.3 16S rRNA序列分析

采用試劑盒提取菌株Q-1的DNA，以其為模板進(jìn)行16S rRNA基因PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得的目的片段長(zhǎng)約1 500 bp(見(jiàn)圖2)。將目的片段回收測(cè)序，經(jīng)BLAST比對(duì)，B-1菌株與類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)(登錄號(hào)：KC633882.1)的同源性為100%。

注：Marker為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 生化檢測(cè)

生化檢測(cè)結(jié)果顯示(見(jiàn)表3)，分離菌株Q-1的生化特性與類志賀鄰單胞菌一致，結(jié)合16S rRNA序列分析結(jié)果，鑒定菌株Q-1為類志賀鄰單胞菌。

表3 分離株Q-1的生理生化特征

2.5 藥敏試驗(yàn)

根據(jù)FIEN-MED藥敏分析試劑板的使用說(shuō)明書判斷結(jié)果，分離菌株Q-1對(duì)恩諾沙星、硫酸新霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素和氟甲喹敏感，對(duì)甲砜霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉和磺胺甲惡唑+甲氧芐啶耐藥(見(jiàn)表4)。

表4 分離株Q-1的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

類志賀鄰單胞菌是1種厭氧性的革蘭氏陰性菌，廣泛分布于自然界，尤其在水中和動(dòng)物體內(nèi)更為常見(jiàn)，是人-畜-魚共患的條件致病菌。人們?cè)陲嬘蒙蚴秤梦粗笸傅乃a(chǎn)品時(shí)，容易感染類志賀鄰單胞菌，引起腸胃炎、腦膜炎、肺炎、骨髓炎、角膜炎、敗血癥等疾病[4-6]。淡水魚是類志賀鄰單胞菌常見(jiàn)的天然宿主[7]，對(duì)該菌的報(bào)道已見(jiàn)于黃顙魚、斑點(diǎn)叉尾魚回、淡紅墨頭魚、鱘魚、異育銀鯽、草魚、黃鱔等[8-14]。為了減少人類感染類志賀鄰單胞菌的風(fēng)險(xiǎn)，必須對(duì)發(fā)病池塘加強(qiáng)管理，做好水體消毒工作，養(yǎng)殖尾水不能隨意排放，以免發(fā)生交叉感染。

目前，對(duì)從急性腹瀉、食物中毒的患病人群中分離出的類志賀鄰單胞菌的致病機(jī)理研究相對(duì)較多，但對(duì)從病魚來(lái)源的類志賀鄰單胞菌的致病機(jī)理研究較少。本研究在江蘇省南京市某養(yǎng)殖場(chǎng)的患病大口黑鱸組織中分離得到類志賀鄰單胞菌菌株，此前未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道。通過(guò)對(duì)分離菌株進(jìn)行革蘭氏染色、16S rRNA序列分析、生化檢測(cè)，并進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)和回歸感染試驗(yàn)，結(jié)果表明，該菌株為類志賀鄰單胞菌，且可確定其為病原菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌株Q-1對(duì)恩諾沙星、硫酸新霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素和氟甲喹敏感，對(duì)甲砜霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉和磺胺甲惡唑+甲氧芐啶等耐藥。這一結(jié)果與從其他病原生物中分離得到的菌株的藥敏結(jié)果存在差異[8-14]。這些菌株間的耐藥性差異可能是動(dòng)物源不同或環(huán)境不同導(dǎo)致的。

近年來(lái)，由類志賀鄰單胞菌引起的養(yǎng)殖魚類病害屢有發(fā)生，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了較大損失，同時(shí)也是食品安全的潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，有必要對(duì)魚源致病性類志賀鄰單胞菌的致病機(jī)理和防控措施進(jìn)行深入研究，以期及早開(kāi)發(fā)出預(yù)防疫苗、快速診斷試劑盒和新型非抗生素藥物等，這對(duì)預(yù)防和診治該類魚病并控制其傳播及流行具有重要意義。