• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    多效唑影響朱頂紅植株生長的轉(zhuǎn)錄組分析

    2022-02-10 23:34:40黃寶華許小瓊陳曉慧徐小萍張春渝林玉玲賴鐘雄
    熱帶作物學(xué)報 2022年1期
    關(guān)鍵詞:多效唑生長

    黃寶華 許小瓊 陳曉慧 徐小萍 張春渝 林玉玲 賴鐘雄

    摘 ?要:朱頂紅具有較高觀賞價值,但其高花莖和葉太長成為其發(fā)展盆栽的限制因素。本研究應(yīng)用不同濃度的多效唑(paclobutrazol, PBZ)對朱頂紅進(jìn)行處理,觀測其表型性狀的特征,并應(yīng)用RNA-seq技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本分析。結(jié)果表明,PBZ對朱頂紅的株高及葉片長度具有抑制作用,隨著PBZ濃度的增加,其株高越矮,葉長逐漸變短,各處理間呈顯著差異,成熟的花莖高度也隨PBZ濃度的增加而降低。經(jīng)轉(zhuǎn)錄組分析,Q20介于98.320%~98.450%之間,均值為98.385%,說明測序質(zhì)量較好,可以用于后續(xù)分析。差異基因富集最顯著的途徑為苯并噁唑嗪酮類化合物生物合成途徑。對差異表達(dá)基因的GO功能分類進(jìn)行分析,在生物過程分類下的6個比對中,差異表達(dá)基因富集到的前3個詞條分別是:代謝過程、細(xì)胞過程、單一生物過程。在細(xì)胞組成的6個比對中,差異表達(dá)基因富集到的前7個詞條都是一致的,分別是細(xì)胞、細(xì)胞部分、膜、細(xì)胞器、膜部分、細(xì)胞器部分、大分子復(fù)合物,其富集相似度很高。在分子功能的6個比對中,前3個的富集詞條分別是催化活性、綁定、運(yùn)輸活動。表明不同濃度PBZ主要通過影響植物體內(nèi)各種生物學(xué)過程來調(diào)控朱頂紅矮化,同時也涉及改變植物組織細(xì)胞組分以及調(diào)控分子功能來影響朱頂紅矮化。KEGG功能分類中,代謝占比最大,都達(dá)60%以上。Pathway富集分析也顯示差異基因顯著富集在代謝途徑和次生代謝產(chǎn)物的生物合成中。通過對代謝通路進(jìn)行分析,表明影響脂肪酸的合成及丙二酰COA的提升是矮化的影響因素之一。木質(zhì)素的大量合成和微管蛋白TUBA、TUBB的提升促使莖粗的增加。茉莉酸甲酯和不飽和脂肪酸類的提升和合成促使其抗性的提升。HSF、hsp70及HSP90基因表達(dá)的提升,提高了其耐熱性。研究結(jié)果為進(jìn)一步了解PBZ對朱頂紅的影響機(jī)理奠定了基礎(chǔ),也為朱頂紅育種提供了參考。

    關(guān)鍵詞:朱頂紅;多效唑;RNA-seq;生長

    中圖分類號:S682.2.5 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

    Transcriptome Analysis of the Effect of Paclobutrazol on the Growth of Hippeastrum

    HUANG Baohua1, XU Xiaoqiong2, CHEN Xiaohui2, XU Xiaoping2, ZHANG Chunyu2, LIN Yuling2,

    LAI Zhongxiong2*

    1. Zhangzhou Institute of Technology, Zhangzhou, Fujian 363000, China; 2. Institute of Horticultural Biotechnology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China

    Abstract: Hippeastrum has high ornamental value, but its long flower stem and leaf are the limiting factors for its potted development. In this study, different concentrations of paclobutrazol (PBZ) were used to treat Hippeastrum for observing the characteristics of its phenotypic traits, and using RNA-seq technology for transcript analysis. PBZ could inhibit the plant height and leaf length of Hippeastrum. With the increase of PBZ concentration, the plant height and the leaf length became shorter, and there were significant differences among different treatments. The mature flower stem height also decreased with the increase of PBZ concentration. After transcriptome analysis, Q20 ranged from 98.320% to 98.450%, and the average percentage was 98.385%, indicating that the sequencing quality was good and could be used for subsequent analysis. The most significant pathway of differential gene enrichment was the biosynthesis pathway of benzoxazozinone compounds. GO functional classification of differentially expressed genes was analyzed. Among the six comparisons under biological process classification, the first three terms enriched by differentially expressed genes were metabolic process, cellular process and single biological process. Among the six comparisons of cell composition, the first seven terms enriched by differentially expressed genes were all the same, namely cell, cell part, membrane, organelle, membrane part, organelle part and macromolecular complex, with high similarity in enrichment. Among the six comparisons of molecular functions, the first three enrichment terms were catalytic activity, binding and transport activity respectively. The results indicated that different concentrations of PBZ mainly regulated the dwarfism mechanism of Hippeastrum through affecting various biological processes in plants, and also involve changing plant tissue cell components and regulating molecular functions to affect Hippeastrum dwarfism. In the functional classification of KEGG, metabolism accounts for the largest proportion, reaching more than 60%. Pathway enrichment analysis also showed that differential genes were significantly enriched in metabolic pathways and biosynthesis of secondary metabolites. The metabolic pathway analysis indicated that the influence of fatty acid synthesis and the promotion of malonyl COA was one of the factors affecting the dwarfing. The massive synthesis of lignin and the increase of tubulin TUBA and TUBB promoted the increase of stem thickness. The enhancement and synthesis of methyl jasmonate and unsaturated fatty acids promoted the enhancement of its resistance. The increase of HSF, hsp70 and HSP90 gene expression improved its heat resistance. The experimental results would lay a foundation for further understanding the effect mechanism of PBZ on Hippeastrum, and also provide a reference for Hippeastrum breeding.

    Keywords: Hippeastrum; paclobutrazole; RNA-seq; growth

    DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.01.023

    朱頂紅(Hippeastrum)是多年生草本球根花卉[1],在花卉產(chǎn)業(yè)中具有很大的商業(yè)價值??筛鶕?jù)其不同用途分為切花、盆花、景觀植物等三類。近年來,隨著朱頂紅產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展,盆栽朱頂紅越來越受到人們的青睞。但在朱頂紅盆栽過程中,其高莖和葉長成為其發(fā)展的限制因素。一方面高莖和葉長易折斷,影響其商品價值;另一方面,增加了其運(yùn)輸難度及成本。為減少其運(yùn)輸體積及提高商品價值,對朱頂紅進(jìn)行矮化是較為有效的一種方式。而應(yīng)用植物生長調(diào)節(jié)劑(plant growth regulators, PGRs)是矮化植株的重要手段,多效唑(paclobutrazol, PBZ)是PGRs其中一種,在園藝作物及農(nóng)作物中已得到了廣泛使用[2-11]。多項研究表明,PBZ較為顯著的作用之一就是矮化植株,同時也可促使植物葉片發(fā)生形態(tài)及生理方面的變化,如葉面積減少[12-13],葉綠素含量增加,提高其抗非生物脅迫能力及抗氧化水平[14-16]。目前對朱頂紅矮化方面的研究還相對較少,沈健等[17]及呂文濤等[18]的研究表明,PBZ對朱頂紅有較好的矮化效果,但對朱頂紅矮化分子基礎(chǔ)的了解相對較少。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA-Seq)是最近發(fā)展起來的一種新型轉(zhuǎn)錄組研究手段,它以高通量和定量的方式對整個轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行較為快速、精確、靈敏的調(diào)查[19],因其無參考基因組的限制,為沒有基因組序列的non-model生物提供了一個較為全面有效的方式來分析轉(zhuǎn)錄組。本研究以盆栽朱頂紅為材料,對經(jīng)過PBZ處理和未經(jīng)處理的朱頂紅葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析朱頂紅矮化的分子機(jī)制。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集將為朱頂紅新基因的發(fā)現(xiàn)、基因組學(xué)和功能基因組學(xué)提供有價值的資源。此外,研究矮化的分子機(jī)制對朱頂紅基因育種改變植株類型具有重要意義。

    1 ?材料與方法

    1.1 ?材料與處理

    將盆栽朱頂紅(Hippeastrum)植株(4片葉,株高15 cm左右)于1月放入溫室中(20~25℃)生長20 d后,應(yīng)用不同濃度PBZ對其進(jìn)行7 d 2次的灌根處理,清水處理為對照,處理組分別設(shè)置濃度處理為0.1、0.2、0.3 g/L,編號分別為PBZ1、PBZ2、PBZ3,每組處理20株,每株100 mL,對其進(jìn)行控水促使其快速長出新葉,抽出花葶,全部植株都抽出花葶穩(wěn)定生長時進(jìn)行表型性狀的觀測。每處理取3株生長較為一致的植株葉片進(jìn)行混樣,取完快速用液氮處理,-80℃保存?zhèn)溆?。提取RNA后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。試驗共進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

    1.2 ?RNA分離和文庫的構(gòu)建

    采用天根生化科技(北京)有限公司的RNA植物純化試劑盒提取樣品總RNA,使用Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent RNA 6000 Nano Kit)檢測total RNA的濃度、RIN值、28S/18S和片斷大小,純度使用紫外分光光度計NanoDropTM進(jìn)行測定。質(zhì)量合格的總RNA,用帶有Oligo(dT)的磁珠富集純化mRNA,在高溫條件下使用二價陽離子于NEBNext第1鏈合成反應(yīng)緩沖液(5×)中使其片斷化,以打斷后的mRNA為模板合成一鏈cDNA,然后配置二鏈合成反應(yīng)體系合成二鏈cDNA,并使用試劑盒純化回收、粘性末端修復(fù)、cDNA的3¢末端加上堿基“A”并連接接頭,然后進(jìn)行片段大小選擇,最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增;構(gòu)建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System質(zhì)檢,合格后進(jìn)行測序。

    1.3 ?差異表達(dá)基因及其功能分類和富集分析

    本項目使用基于泊松分布原理的PossionDis方法進(jìn)行差異基因的檢測。參照參數(shù)為Fold Change≥2和FDR(false discovery rate)≤0.01來篩選差異基因。對差異檢驗的Q-value作多重的假設(shè)檢驗校正,通過控制FDR來決定Q-value的域值[20]。在獲得差異檢驗的FDR值時,根據(jù)FPKM值計算該基因在不同樣本間的差異表達(dá)倍數(shù)。FDR值越小,差異倍數(shù)越大,則表明差異越顯著。

    根據(jù)GO(gene ontology)注釋結(jié)果及官方分類,將差異基因進(jìn)行功能分類,同時基于GOseq R軟件中的phyper函數(shù)進(jìn)行富集分析。KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)途徑中的差異表達(dá)基因的富集分析應(yīng)用R軟件,基于NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫、大型蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫、NCBI非冗余核苷酸數(shù)據(jù)庫、蛋白質(zhì)直系同源數(shù)據(jù)庫、KEGG同源基因數(shù)據(jù)庫、手動注釋和鑒定蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫、基因功能分類數(shù)據(jù)庫等數(shù)據(jù)庫注釋基因功能。

    1.4 ?部分差異表達(dá)基因在不同PBZ濃度處理下的特異性表達(dá)

    為進(jìn)一步了解代謝途徑中重要差異表達(dá)基因在不同PBZ濃度處理下的特異性表達(dá),基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),提取HIDH(CL7862.Contig1_All)、7-IOMT(CL5344.Contig3_All)、EPHX2(Unig?e-ne1460_All)、HSPA1s(CL10622.Contig2_ All)、FAB2(CL12018.Contig4_All)、FATA(Unig-ene56852_All)、PA04(CL9035.Contig5_All)在對照組及不同PBZ濃度處理下的FPKM值,分析其表達(dá)情況,并且利用TBtools繪制熱圖。

    1.5 ?表型測定方法

    用直尺測定朱頂紅的植株高度,游標(biāo)卡尺測量朱頂紅葉片的長度、寬度和鱗莖粗,并觀測其生長狀態(tài)和花期等指標(biāo)。植株高度測其盆面到苗頂最高位置,葉片測量從里向外數(shù)第2個葉片的葉長和葉寬(葉片最寬處),每處理重復(fù)6株,取平均值。

    2 ?結(jié)果與分析

    2.1 ?表型性狀特征

    不同濃度PBZ處理朱頂紅后,對其進(jìn)行性狀觀測(表1)。隨著PBZ濃度的增加,其株高越矮,葉長逐漸變短,各處理間呈顯著差異,成熟的花莖高度也隨PBZ濃度的增加而降低。而葉寬及莖粗逐漸增加,各處理間葉寬呈顯著差異,莖粗無顯著差異。表明PBZ對朱頂紅的株高及葉長抑制效果顯著,而且對朱頂紅的花期也有一定影響。經(jīng)群體觀測發(fā)現(xiàn),PBZ處理使朱頂紅推遲開花,花期延后。

    2.2 ?朱頂紅PBZ處理前后的轉(zhuǎn)錄組質(zhì)量評估及差異表達(dá)基因分析

    測序包括對照組(CK)、處理組(PBZ1、PBZ2、PBZ3)共4個樣品。各樣品數(shù)據(jù)過濾后的reads占總reads數(shù)的比例介于79.020%~83.930%之間,均值為81.990%;Q20介于98.320%~98.450%之間,均值為98.385%,說明測序質(zhì)量較好,可以用于后續(xù)分析。其中,無論是從過濾后的reads的比例還是Q20的數(shù)值來看,均為PBZ3>PBZ2> PBZ1,說明PBZ3的測序質(zhì)量優(yōu)于PBZ2與PBZ1。

    測序結(jié)果中,在CK vs PBZ1中檢測到最多數(shù)量的差異表達(dá)基因(differential expressed genes, DEGs),其中差異上調(diào)表達(dá)基因766條,差異下調(diào)表達(dá)基因6542條;PBZ1 vs PBZ2中的差異表達(dá)基因最少,其中差異上調(diào)表達(dá)基因1802條,差異下調(diào)表達(dá)基因975條。此外,本次差異基因富集最顯著的途徑為苯并噁唑嗪酮類化合物生物合成途徑。

    2.3 ?朱頂紅PBZ處理前后的基因表達(dá)量分析

    根據(jù)各處理的基因表達(dá)量信息,為了較為直觀地展示每個處理樣品在FPKM區(qū)間的基因數(shù)目,分別對FPKM≤1、1

    的基因表達(dá)總量為63 817。其中在1< FPKM<10的較低表達(dá)水平的基因CK、PBZ1、PBZ2、PBZ3各處理的占比都較高,分別為60.69%、53.89%、51.91%、55.48%。FPKM≥10的中高表達(dá)水平的基因CK、PBZ1、PBZ2、PBZ3的占比分別為15.10%、13.04%、15.57%、15.47%。FPKM≤1的極低表達(dá)水平的基因CK、PBZ1、PBZ2、PBZ3中的占比分別為24.22%、33.07%、32.53%、29.05%。在4個處理中,12.4 ?差異表達(dá)基因的聚類分析

    對樣品間的差異表達(dá)基因進(jìn)行層次聚類分析(圖2)。圖中紅色愈深表明其上調(diào)倍數(shù)越大,藍(lán)色愈藍(lán)表明下調(diào)倍數(shù)越大。各PBZ處理與對照之間、各PBZ處理之間的比較呈兩大類。其中處理PBZ1與對照比較下降倍數(shù)較大,而處理PBZ1與PBZ2、PBZ3比較其上調(diào)倍數(shù)較大。

    2.5 ?差異表達(dá)基因的GO功能分類

    根據(jù)差異基因的檢測結(jié)果,為了更好地分析差異基因的生物學(xué)功能及其參與的代謝通路,對其進(jìn)行了GO功能分類(表2)。GO分為三大類:生物過程、細(xì)胞組分和分子功能。表2展示了這三大分類下的最主要的一些詞條,CK與其他處理之間的差異表達(dá)基因的數(shù)量不同,但富集到的主要詞條基本一致。在生物過程分類下的6個比對中,差異表達(dá)基因富集到的前3個詞條分別是:代謝過程、細(xì)胞過程、單一生物過程。CK vs PBZ1、CK vs PBZ2、CK vs PBZ3、PBZ1 vs PBZ2第4位詞條為定位,PBZ1 vs PBZ3、PBZ2 vs PBZ3的第4位詞條為生物調(diào)節(jié)。在細(xì)胞組成的6個比對中,差異表達(dá)基因富集到的前7個詞條都是一致的,分別是細(xì)胞、細(xì)胞部分、膜、細(xì)胞器、膜部分、細(xì)胞器部分、大分子復(fù)合物,其富集相似度很高。在分子功能的6個比對中,前3個的富集詞條分別是催化活性、綁定、運(yùn)輸活動。這說明,不同濃度PBZ主要通過影響植物體內(nèi)各種生物學(xué)過程來調(diào)控朱頂紅矮化,同時也涉及改變植物組織細(xì)胞組分以及調(diào)控分子功能來影響朱頂紅矮化,因此通過GO功能分類出來的富集途徑解釋朱頂紅矮化機(jī)理的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有較為積極的意義。

    2.6 ?差異表達(dá)基因的KEGG生物通路分類及富集分析

    2.6.1 ?KEGG功能分類 ?根據(jù)差異表達(dá)基因參與的KEGG代謝通路主要將其分為5個分支,分別為細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、代謝及有機(jī)系統(tǒng)。共有差異表達(dá)Unigene數(shù)目為22 468個。其中CK vs PBZ1的差異Unigene數(shù)目為5497,占24.47%;CK vs PBZ2的差異Unigene數(shù)目為3804,占16.93%;CK vs PBZ3的差異Unigene數(shù)目為2890,占12.86%;PBZ1 vs PBZ2的差異Unigene數(shù)目為2269,占10.10%;PBZ1 vs PBZ3的差異Unigene數(shù)目為4995,占22.23%;PBZ2 vs PBZ3的差異Unigene數(shù)目為3013,占13.41%(表3)。6個對比中5個分支的類別一致,其中細(xì)胞過程僅含運(yùn)輸和分解代謝,環(huán)境信息處理包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和膜運(yùn)輸,遺傳信息處理包括翻譯、轉(zhuǎn)錄、折疊分類降解、復(fù)制和修復(fù),代謝則包含全局和總覽圖、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、能量代謝、其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成、核苷酸代謝、萜類和多酮類化合物的代謝、輔助因子和維生素的代謝、其他氨基酸的代謝、多糖的生物合成和代謝,有機(jī)系統(tǒng)僅包含環(huán)境適應(yīng)。6個比對中,細(xì)胞過程的占比分別為是5.08%、5.57%、3.98%、4.85%、4.76%、5.18%,環(huán)境信息處理的占比分別為是6.19%、7.75%、7.09%、5.95%、5.33%、6.77%,遺傳信息處理的占比分別為是19.28%、19.98%、17.44%、17.58%、16.64%、16.43%,代謝的占比分別為是64.13%、62.01%、66.12%、67.30%、69.25%、67.61%,有機(jī)系統(tǒng)的占比分別為是5.33%、4.68%、5.36%、2.56%、4.02%、4.02%。可見,6個比對中,各分類所占比例大致相同,代謝占比最大,均達(dá)60%以上,而代謝中前2位的為全局和總覽圖、碳水化合物代謝,這表明PBZ處理影響了朱頂紅的代謝,進(jìn)而影響了其生長發(fā)育,進(jìn)而有了矮化的表型性狀特征。

    2.6.2 ?差異基因的Pathway富集分析 ?通過對差異基因所參與的途徑進(jìn)行分析,有助于了解朱頂紅矮化機(jī)制所涉及的途徑,從而進(jìn)一步了解PBZ調(diào)控朱頂紅矮化的分子機(jī)理。圖3所示是對DEGs進(jìn)行KEGG分類中Q-value較小的前20個通路。從圖3中可看出,基于富集因子,在CK vs PBZ1比對中顯著富集的前5個途徑為苯并噁嗪類生物合成、酮體的合成與降解、氮素代謝、黃酮和黃酮生物合成、玉米素的生物合成(圖3A);CK vs PBZ2顯著富集的前5個途徑有糖鞘脂生物合成-神經(jīng)節(jié)系列、糖胺聚糖降解、二苯乙烯,二芳基庚烷和姜酚的生物合成、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、鞘脂類代謝(圖3B);CK vs PBZ3顯著富集的前5途徑有苯并噁嗪類生物合成、光合作用-觸角蛋白、單萜生物合成、光合作用、檸檬烯和蒎烯降解(圖3C);PBZ1 vs PBZ2顯著富集的前5個途徑有苯并噁嗪類生物合成、異黃酮的生物合成、光合作用、單萜生物合成、倍半萜和三萜生物合成(圖3D);PBZ1 vs PBZ3顯著富集的前5個途徑有光合作用、光合作用-觸角蛋白、黃酮和黃酮生物合成、氮素代謝、檸檬烯和蒎烯降解(圖3E);PBZ2 vs PBZ3顯著富集的前5個途徑有光合作用-觸角蛋白、光合作用、氮素代謝、核黃素代謝、泛醌和其他萜類醌的生物合成(圖3F)。在CK vs PBZ1、CK vs PBZ2、CK vs PBZ3、PBZ1 vs PBZ2、PBZ1 vs PBZ3和PBZ2 vs PBZ3各組對比中,差異基因數(shù)目最多的是代謝途徑,其次為次生代謝產(chǎn)物的生物合成,且都顯著富集到了這2個途徑。總之,苯并噁嗪類生物合成途徑明顯參與響應(yīng)PBZ處理。

    2.6.3 ?代謝通路的分析 ?圖4是6個對比中幾個代謝的大致變化,紅色代表代謝增強(qiáng),綠色代表代謝減弱。可看出,6個對比的代謝變化大致相同。其中核苷酸代謝、輔助因子和維生素的代謝、其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成等代謝途徑都增強(qiáng),其中嘌呤、嘧啶、β-丙氨酸、咖啡因、核黃素、硫胺素、維生素B6、卟啉和葉綠素、葉酸、苯丙烷生物合成、類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成、吲哚生物堿生物合成、異喹啉生物堿生物合成、泛酸和CoA生物合成、泛醌和其他萜類醌生物合成等呈上升趨勢。聚糖的生物合成和代謝途徑、脂類代謝、萜類和聚酮化合物的代謝減弱,其中糖鞘脂生物合成-乳酸和新乳酸系列、糖鞘脂生物合成-球狀體、糖基轉(zhuǎn)移酶、N-聚糖生物合成、其他聚糖降解、蛋白聚糖、亞油酸代謝、糖胺聚糖生物合成硫酸角蛋白、α-亞麻酸代謝、類胡蘿卜素生物合成、單萜、倍半萜類和三萜類生物合成、玉米素生物合成、檸檬烯和蒎烯降解、脂肪酸生物合成和降解、鞘脂類代謝、甘油酯類代謝、甘油磷脂代謝、花生四烯酸代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、脂類生物合成蛋白質(zhì)等呈下降趨勢。在脂肪酸生物代謝途徑中,丙二酰輔酶A、十六碳烯酸、十八碳烯酸上調(diào),其他脂肪酸都受到抑制,可能是朱頂紅經(jīng)過PBZ處理后,抑制了大部分脂肪酸的合成和降解,而一些特殊的脂肪酸合成增加。α-亞麻酸途徑中,最終產(chǎn)物是茉莉酸甲酯增加。異黃酮途徑中,大量合成葡萄糖苷-丙二酸,剛好下一步形成丙二酰COA。在苯丙烷生物合成途徑中,促進(jìn)木質(zhì)素的合成。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工代謝中,與耐熱相關(guān)的基因HSF、hsp70、HSP90都上調(diào),表明可提高其耐熱性。

    2.7 ?部分差異表達(dá)基因在不同PBZ濃度處理下的特異性表達(dá)

    基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),挑選7個與代謝途徑顯著相關(guān)的差異表達(dá)基因,即HIDH、7-IOMT、EPHX2、HSPA1s、FAB2、FATA、PA04,結(jié)合其FPKM值通過TBtools在線軟件進(jìn)行聚類熱圖分析。結(jié)果(圖5)表明,與對照組相比,大多數(shù)差異表達(dá)基因(HIDH、FATA、PAO4、7-IOMT、EPHX2及FAB2)在PBZ2濃度處理下表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá),其中HIDH、7-IOMT以及FAB2為顯著下調(diào)。在PBZ1濃度處理下,F(xiàn)ATA和PAO4表達(dá)下調(diào),7-IOMT和HSPA1s則為表達(dá)上調(diào)。在PBZ3濃度處理下,HIDH、FATA及PAO4表達(dá)顯著上調(diào),HSPA1s及EPHX2則為下調(diào)表達(dá),其中HSPA1s表達(dá)顯著下調(diào)。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究朱頂紅矮化機(jī)制提供了借鑒。

    3 ?討論

    朱頂紅經(jīng)不同濃度的PBZ處理后,植株變矮,葉長變短,葉寬變寬,莖粗增加。與沈健等[17]及呂文濤等[18]的研究結(jié)果一致,都認(rèn)為PBZ對朱頂紅的矮化效果顯著。不同濃度的矮壯素(CCC)對朱頂紅的矮化效應(yīng)則不盡相同,300 mg/L的CCC對朱頂紅的葉長有一定抑制作用,其他濃度抑制效果不明顯,表明不同植物生長調(diào)節(jié)劑對朱頂紅生長特征的影響不同。多效唑(paclobutrazol, PBZ)是一種較為高效的生長延緩劑,主要作用是阻礙赤霉素的生物合成[21-22],加速體內(nèi)生長素的分解,從而延緩、抑制植株的營養(yǎng)生長,還具有抑制莖桿伸長,縮短節(jié)間、促進(jìn)植物分蘗、增加植物抗逆性能,提高產(chǎn)量等效果。除應(yīng)用于果樹的矮化栽培外,曾廣泛用于防止連晚秧苗徒長,大豆、大麥和小麥等農(nóng)作物的降矮抗倒。對經(jīng)PBZ處理后的朱頂紅進(jìn)行形態(tài)特征觀察后,認(rèn)為與多效唑的作用基本吻合。

    本研究首次采用RNA-seq技術(shù)對PBZ處理后的朱頂紅基因表達(dá)譜進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)其差異表達(dá)主要集中在代謝途徑及次生代謝產(chǎn)物的生物合成中。根據(jù)該結(jié)果,試圖全面了解PBZ對朱頂紅生長發(fā)育的影響,并進(jìn)一步研究朱頂紅矮化的分子機(jī)制,為朱頂紅的分子育種研究提供一定的理論基礎(chǔ)。將重點放在4個濃度處理后基因表達(dá)的對比上,其中核苷酸代謝、輔助因子和維生素的代謝、其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成這些代謝途徑增強(qiáng),聚糖的生物合成和代謝途徑、脂類代謝、萜類和聚酮化合物的代謝減弱。β-酮脂酰-ACP還原酶、β-酮脂酰-ACP合成酶的降低,使催化從乙酰CoA及丙二酰CoA合成長鏈脂肪酸的反應(yīng)降低,從而使整個脂肪酸的合成降低,而脂肪酸合成的降低會導(dǎo)致肥胖、生長發(fā)育遲緩等問題。而1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)的矮化作用也是在催化乙酰CoA羧化成丙二酰CoA時降低,PBZ和ACC的作用類似。丙二酰輔酶A的增加則是由于異黃酮途徑中大量合成的葡萄糖苷-丙二酸促使丙二酰輔酶A的形成。在動物上,丙二酰COA會導(dǎo)致肥胖[23]。苯丙烷類生物合成中促進(jìn)了木質(zhì)類的合成。在花生四烯酸代謝中,20-羥二十烷四稀酸(20-HETE)下降,四氫呋喃二元醇顯著升高,四氫呋喃型也屬于木質(zhì)素類,木質(zhì)素類也顯著提高。吞噬體中,2個關(guān)鍵基因TUBA、TUBB上調(diào),TUBA和TUBB以非共價鍵的形式連接形成異二聚體,異二聚體首尾相連則形成微管蛋白原纖維,這在一定程度上可以解釋PBZ處理促使木質(zhì)素類的合成及微管蛋白的提升,使莖粗增加。通過對銀杏基因組的研究發(fā)現(xiàn),古樹主要通過持續(xù)合成木質(zhì)素等物質(zhì),增加樹干的密度和強(qiáng)度,以支撐不斷增粗的樹體。十六碳烯酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸在代謝途徑中大量合成,這些物質(zhì)都屬于ω-3脂肪酸(omega-3 fatty acids)的家族成員,又稱n-3脂肪酸,是一類不飽和脂肪酸,不飽和脂肪酸具有提高抗性、抗衰老、抗氧化的功能。亞麻酸代謝途徑中,茉莉酸甲酯顯著提升,在其他途徑中還形成了3,6-壬二烯醛、9-醛基壬酸、乙烯醚類脂肪酸等不飽和脂肪酸類??梢姡琍BZ的作用機(jī)制是通過提高茉莉酸甲酯和不飽和脂肪酸類的合成,從而提高免疫力。趙曼如等[24]認(rèn)為茉莉酸甲酯作為植物激素和信號分子,外用則可激發(fā)植物防御基因的表達(dá),提高其抗逆性。徐建祥等[25]也認(rèn)為茉莉酸甲酯具有誘導(dǎo)和激活植物體內(nèi)自身免疫系統(tǒng)來抵御外來蟲害侵害的功能。王文霞等[26]也認(rèn)為不飽和脂肪酸及其衍生物在植物抗逆反應(yīng)中發(fā)揮著重要的生理功能。值得特別指出的是,顯著富集的苯并噁嗪類生物合成途徑,代謝產(chǎn)物是丁布,對于提高植物抗性具有重要意義。

    在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工代謝中,基因HSF、hsp70及HSP90都上調(diào),hsf是耐熱轉(zhuǎn)錄因子,hsp70和HSP90是熱脅迫的時候,與hsf形成復(fù)合體,啟動耐熱反應(yīng),所以PBZ處理后可以提高耐熱性。研究發(fā)現(xiàn),耐熱番茄Hsf24基因在提高番茄耐熱性上有著尤為重要的作用[27]。在動物上,李秋玲等[28]也認(rèn)為HSF1基因microRNA SNPs可作為奶牛抗熱應(yīng)激的候選分子標(biāo)記應(yīng)用于育種實踐。

    細(xì)胞數(shù)量的多少和大小控制著葉片的大小,而細(xì)胞分裂和細(xì)胞膨脹則控制著細(xì)胞的數(shù)量和大小,參與這些過程的基因表達(dá)變化與葉片的變化和植株矮化相關(guān)?;蚪y(tǒng)計結(jié)果顯示,很多有關(guān)細(xì)胞分裂和細(xì)胞膨脹的相關(guān)基因在PBZ處理下都呈現(xiàn)出較為明顯的變化。

    參考文獻(xiàn)

    [1] 劉 ?燕. 園林花卉學(xué)[M]. 北京: 中國林業(yè)出版社, 2003.

    LIU Y. Ornamental flowers[M]. Beijing: China Forestry Publishing House, 2003. (in Chinese)

    [2] 崔向東, 史素霞. 多效唑?qū)λ筛叨群突ㄆ诘挠绊慬J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39(12): 6979-6980.

    CUI X D, SHI S X. The effects of PP333 on the height and florescence of Narcissus tazetta[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2011, 39(12): 6979-6980. (in Chinese)

    [3] 華智銳, 李小玲. 多效唑與矮壯素對百合試管苗生長的影響[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2015, 31(13): 144-149.

    HUA Z R, LI X L. Effect of paclobutrazol and chloride on the growth of lily plantlets[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2015, 31(13): 144-149. (in Chinese)

    [4] 聶 ?艷. 乙烯利和多效唑?qū){杜鵑觀賞性狀調(diào)控的生理基礎(chǔ)及花芽分化進(jìn)程研究[D]. 北京: 中國林業(yè)科學(xué)研究院, 2017.

    NIE Y. Study on the physiological basis and flower bud differentiation process of ethephon and paclobutrazol on the regulation of ornamental characters of Bougainvillea[D]. Beijing: Chinese Academy of Forestry, 2017. (in Chinese)

    [5] 李 ?蕓, 虞 ?毅, 湯 ?鋒, 原偉杰, 肖 ?芳, 王 ?猛. 多效唑?qū)?年生沙地柏生長和生理特征的影響研究[J]. 干旱區(qū)資源與環(huán)境, 2015, 29(6): 110-116.

    LI Y, YU Y, TANG F, YUAN W J, XIAO F, WANG M. Effect of paclobutrazol on growth and physiological characteristics of two-year-old Sabina vulgaris[J]. Journal of Arid Land Resources and Environment, 2015, 29(6): 110-116. (in Chinese)

    [6] 楊瑞斌. 多效唑?qū)ε柙园爬偬O果矮化效果[J]. 河北果樹, 2015(1): 5.

    YANG R B. Paclobutrazol on the dwarfing effect of potted ballet apple[J]. Hebei Fruits, 2015(1): 5. (in Chinese)

    [7] 何文芳. 多效唑?qū)λ囡L(fēng)信子矮化作用研究[J]. 中國園藝文摘, 2013, 29(5): 29-30.

    HE W F. Study on the dwarfing effect of paclobutrazol on hydroponic hyacinth[J]. China Horticulture Digest, 2013, 29(5): 29-30. (in Chinese)

    [8] 呂長平, 陳海霞. 多效唑?qū)ε柙曰ㄈ~美人蕉的矮化效果[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2003, 29(2): 129-130.

    LV C P, CHEN H X. The dwarfing effect of paclobutrazol on potted Canna[J]. Journal of Hunan Agricultural University (Natural Science), 2003, 29(2): 129-130. (in Chinese)

    [9] 蔡建國, 王麗英, 涂海英, 胡本林, 余有祥, 劉 ?靜. 多效唑?qū)ε柙员泵蓝嗟陌?yīng)[J]. 福建林業(yè)科技, 2014, 41(3): 36-39.

    CAI J G, WANG L Y, TU H Y, HU B L, YU Y X, LIU J. Effect of paclobutrazol on dwarfing of potted Ilex verticillata[J]. Fujian Forestry Science and Technology, 2014, 41(3): 36-39. (in Chinese)

    [10] 陸海英. 多效唑?qū)煞N草坪草形態(tài)、生理及解剖結(jié)構(gòu)的影響[D]. 揚(yáng)州: 揚(yáng)州大學(xué), 2015.

    LU H Y. The effect of paclobutrazol on the morphology, physiology and anatomical structure of two kinds of turfgrass[D]. Yangzhou: Yangzhou University, 2015. (in Chinese)

    [11] 劉云強(qiáng). 三種植物生長延緩劑在草地早熟禾上的應(yīng)用研究[J]. 遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報, 2019, 21(6): 1-3.

    LIU Y Q. Study on application of three plant growth retardants on Kentucky bluegrass[J]. Journal of Liaoning Agricultural Technical College, 2019, 21(6): 1-3. (in Chinese)

    [12] NAIR V D, JALEEL C A, GOPI R, PANNEERSELVAM R. Changes in growth and photosynthetic characteristics of Ocimum sanctum under growth regulator treatments[J]. Frontiers of Biology in China 2009, 4: 192-199.

    [13] COHEN Y, ALONI D D, ADUR U, HAZON H. Characterization of growth-retardant effects on vegetative growth of date palm seedlings[J]. Journal of Plant Growth Regulation, 2013, 32: 533-541.

    [14] OZMEN A D, TUKAN F O. Effects of paclobutrazol on response of two barley cultivars to salt stress[J]. Biologia Plantarum, 2003, 46: 263-268.

    [15] LIN K H, PAI F H, HWANG S Y, LO H F. Pre-treating with paclobutrazol enhanced chilling tolerance of sweetpotato[J]. Plant Growth Regulation, 2006, 49: 249-262.

    [16] SRIVASTAV M, KISHOR A, DAHUJA A, SHARMA R R. Effect of paclobutrazol and salinity on ion leakage, proline content and activities of antioxidant enzymes in mango (Mangifera indica L.)[J]. Scientia Horticulturae, 2010, 125: 785-788.

    [17] 沈 ?健, 陸信娟, 王春彥. 生長延緩劑對盆栽朱頂紅的矮化效應(yīng)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008(2): 149-151.

    SHEN J, LU X J, WANG C Y. The dwarfing effect of growth retardant on potted Hippeastrum[J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2008(2): 149-151. (in Chinese)

    [18] 呂文濤, 周玉珍, 婁曉鳴, 成海鐘, 陳 ?艷. 多效唑和矮壯素對盆栽朱頂紅矮化的影響[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 55(16): 4214-4216.

    LV W T, ZHOU Y Z, LOU X M, CHENG H Z, CHEN Y. Dwarfing effects of paclobutrazol and chlorocholine chloride on potted Hippeastrum vittatum[J]. Hubei Agricultural Scie??n?ces, 2016, 55(16): 4214-4216. (in Chinese)

    [19] WANG Z, GERSTEIN M, SNYDER M. RNA-Seq: a revol-?utionary tool for transcriptomics[J]. Nature Reviews Geneti??cs, 2009, 10(1): 57-63.

    [20] BENJAMINI Y, YEKUTIELI D. The control of the false discovery rate in multiple testing under dependency[J]. The Annals of Statistics, 2001, 29: 1165-1188.

    [21] 潘瑞熾. 植物生長延緩劑的生理作用及其應(yīng)用[J]. 華南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 1984(2): 121-129.

    PAN R Z. The physiological function and application of plant growth retardant[J]. Journal of South China Normal University Natural Science, 1984(2): 121-129. (in Chinese)

    [22] GROSSMANN K. Plant growth retardants as tools in physi?o?logical research[J]. Plant Physiology, 1990, 78(4): 640-648.

    [23] RUDERMAN N B, SAHA A K, KRAEGEN E W. Minirev-?iew: malonyl CoA, AMP-activated protein kinase, and adip??osity[J]. Endocrinology, 2003, 144(12): 5166-5171.

    [24] 趙曼如, 胡文忠, 于皎雪, 管玉格, 高紅豆, 龍 ?婭. 茉莉酸甲酯對果蔬抗性、抗氧化活性及品質(zhì)影響的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2020, 41(4): 328-332.

    ZHAO M R, HU W Z, YU J X, GUAN Y G, GAO H D, LONG Y. Research progress on effects of methyl jasmonate on resistance, antioxidant activity and quality of fruits and vegetables[J]. Science and Technology of Food Industry, 2020, 41(4): 328-332. (in Chinese)

    [25] 徐建祥, 曹衛(wèi)菊. 外用茉莉素誘導(dǎo)植物抗蟲性研究進(jìn)展[J]. 昆蟲知識, 2005, 42(3): 250-254.

    XU J X, CAO W J. Advances in researches on induced plant resistance to insects by external-used jasmonates[J]. Insect Knowledge, 2005, 42(3): 250-254. (in Chinese)

    [26] 王文霞, 李曙光, 白雪芳, 杜昱光. 不飽和脂肪酸及其衍生物在植物抗逆反應(yīng)中的作用[J]. 植物生理學(xué)通訊, 2004, 40(6): 741-748.

    WANG W X, LI S G, BAI X F, DU Y G. The role of uns-?aturated fatty acids and their derivatives in plant stress res??istance[J]. Plant Physiology Newsletter, 2004, 40(6): 741- 748. (in Chinese)

    [27] 李振軍, 李景富. 耐熱番茄Hsf24基因克隆與分析[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2010, 41(3): 29-33, 161.

    LI Z J, LI J F. Cloning and analysis of heat tolerance tomato Hsf 24 gene[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2010, 41(3): 29-32. (in Chinese)

    [28] 李秋玲, 鞠志花, 賈祥捷, 黃金明, 李建斌, 李榮嶺, 李 ?芳, 王長法, 仲躋峰. 中國荷斯坦牛HSF1基因microRNA SNPs與耐熱性能的相關(guān)性研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 44(3): 570-578.

    LI Q L, JU Z H, JIA X J, HUANG J M, LI J B, LI R L, LI F, WANG C F, ZHONG J F. Identification of MicroRNA SNPs of HSF1 gene and their association with heat tolerance in Chinese Holstein[J]. Scientia ?Agricultura Sinica, 2011, 44(3): 570-578. (in Chinese)

    猜你喜歡
    多效唑生長
    碗蓮生長記
    小讀者(2021年2期)2021-03-29 05:03:48
    生長在哪里的啟示
    華人時刊(2019年13期)2019-11-17 14:59:54
    生長
    文苑(2018年22期)2018-11-19 02:54:14
    《生長在春天》
    多效唑?qū)t提葡萄新梢成長與坐果的影響
    多效唑處理對玉米農(nóng)藝性狀的影響
    15%多效唑?qū)Ω材こ莼ㄉ纳L影響
    亚洲欧美精品专区久久| 国产欧美日韩精品一区二区| 五月玫瑰六月丁香| 国产精品成人在线| 国产av国产精品国产| 欧美精品一区二区大全| 特级一级黄色大片| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 亚洲人与动物交配视频| 男插女下体视频免费在线播放| 一级a做视频免费观看| 中文字幕免费在线视频6| 97精品久久久久久久久久精品| 国产中年淑女户外野战色| 国产亚洲av嫩草精品影院| av卡一久久| 国产黄a三级三级三级人| 99久久精品热视频| 日韩一本色道免费dvd| 久久这里有精品视频免费| 大香蕉久久网| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产一区亚洲一区在线观看| 男人舔奶头视频| 熟女电影av网| av天堂中文字幕网| av福利片在线观看| 欧美三级亚洲精品| 久久热精品热| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产精品成人在线| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产精品无大码| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 在线精品无人区一区二区三 | 精品视频人人做人人爽| 欧美成人午夜免费资源| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲av在线观看美女高潮| av女优亚洲男人天堂| 禁无遮挡网站| 久久午夜福利片| 一区二区三区免费毛片| 午夜福利视频1000在线观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 成年av动漫网址| 亚洲在久久综合| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 一级二级三级毛片免费看| 精品人妻熟女av久视频| 免费看不卡的av| 久久久久久九九精品二区国产| 爱豆传媒免费全集在线观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 一个人看视频在线观看www免费| 男人舔奶头视频| 夫妻午夜视频| av女优亚洲男人天堂| 精品久久久噜噜| 久久久久久久久久人人人人人人| 一区二区av电影网| 一区二区三区免费毛片| 日本一本二区三区精品| 欧美区成人在线视频| 亚洲怡红院男人天堂| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 乱系列少妇在线播放| 中文字幕久久专区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 日韩大片免费观看网站| 久久久久九九精品影院| 亚洲av在线观看美女高潮| h日本视频在线播放| 国产一区二区在线观看日韩| 好男人视频免费观看在线| 国产爽快片一区二区三区| 国产欧美亚洲国产| 国产伦精品一区二区三区视频9| 久久久久久久精品精品| 中文字幕亚洲精品专区| 一个人看的www免费观看视频| 欧美bdsm另类| 亚洲欧美清纯卡通| 久久久a久久爽久久v久久| 国产黄片美女视频| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产精品一区www在线观看| 国产淫语在线视频| 久久99精品国语久久久| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产探花极品一区二区| 精品国产三级普通话版| 国产亚洲精品久久久com| 中文在线观看免费www的网站| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲自偷自拍三级| 久久久色成人| 久热这里只有精品99| 两个人的视频大全免费| 欧美国产精品一级二级三级 | 久久99热这里只频精品6学生| 又爽又黄无遮挡网站| 搞女人的毛片| 亚洲伊人久久精品综合| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产黄片美女视频| 国产成人精品婷婷| 熟女人妻精品中文字幕| 看黄色毛片网站| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 嫩草影院新地址| 久热久热在线精品观看| 九九在线视频观看精品| 麻豆国产97在线/欧美| 下体分泌物呈黄色| 欧美变态另类bdsm刘玥| 精华霜和精华液先用哪个| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲图色成人| 日韩人妻高清精品专区| 青春草亚洲视频在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 十八禁网站网址无遮挡 | 大话2 男鬼变身卡| 国产精品精品国产色婷婷| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 麻豆成人av视频| 婷婷色综合大香蕉| 99久久精品国产国产毛片| 欧美一级a爱片免费观看看| 91久久精品电影网| 爱豆传媒免费全集在线观看| 午夜激情福利司机影院| 人妻一区二区av| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲精品影视一区二区三区av| 新久久久久国产一级毛片| 国产老妇女一区| 精品一区二区免费观看| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日韩精品有码人妻一区| 麻豆成人午夜福利视频| 内射极品少妇av片p| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产片特级美女逼逼视频| 久热这里只有精品99| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 最近中文字幕高清免费大全6| 在现免费观看毛片| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲国产精品成人综合色| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 精品久久久精品久久久| 赤兔流量卡办理| 日韩av在线免费看完整版不卡| 超碰av人人做人人爽久久| 美女视频免费永久观看网站| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 哪个播放器可以免费观看大片| 91久久精品国产一区二区成人| 99久久人妻综合| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 观看美女的网站| 丝瓜视频免费看黄片| av.在线天堂| 欧美另类一区| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 日本欧美国产在线视频| av在线亚洲专区| 最新中文字幕久久久久| 在现免费观看毛片| 九草在线视频观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 午夜福利在线在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 欧美潮喷喷水| 国产精品av视频在线免费观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 看黄色毛片网站| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲人与动物交配视频| 久久久久久久久久人人人人人人| 欧美国产精品一级二级三级 | 一本一本综合久久| 国产精品99久久久久久久久| 777米奇影视久久| 99热这里只有是精品在线观看| 成年版毛片免费区| 色哟哟·www| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 两个人的视频大全免费| 丝袜美腿在线中文| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 26uuu在线亚洲综合色| 亚洲四区av| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产成人免费观看mmmm| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲国产精品999| 99热国产这里只有精品6| 日本一二三区视频观看| 黄色配什么色好看| 男女国产视频网站| 真实男女啪啪啪动态图| av免费观看日本| 亚洲高清免费不卡视频| 欧美日本视频| 777米奇影视久久| 亚洲成人一二三区av| 欧美日韩综合久久久久久| 精品午夜福利在线看| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产精品.久久久| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 欧美性感艳星| av在线app专区| 男女边摸边吃奶| 日本爱情动作片www.在线观看| 真实男女啪啪啪动态图| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久女婷五月综合色啪小说 | 精品人妻一区二区三区麻豆| 永久免费av网站大全| 精品少妇久久久久久888优播| 97在线人人人人妻| 深夜a级毛片| 一本久久精品| 麻豆成人av视频| 亚洲av男天堂| 在现免费观看毛片| 黄色日韩在线| 在线观看美女被高潮喷水网站| 99久久人妻综合| 精品一区二区三区视频在线| 十八禁网站网址无遮挡 | 国产精品成人在线| 乱系列少妇在线播放| 九草在线视频观看| 日韩强制内射视频| 成人综合一区亚洲| 视频区图区小说| 国产成人aa在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 一级二级三级毛片免费看| 丝袜喷水一区| 久久精品国产自在天天线| 乱系列少妇在线播放| 久久久久国产网址| 中国国产av一级| 日日啪夜夜爽| 日韩中字成人| 国产乱来视频区| 欧美区成人在线视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 国产成人精品福利久久| 午夜激情久久久久久久| av线在线观看网站| 少妇人妻一区二区三区视频| 久久久久精品性色| 插逼视频在线观看| 丝袜美腿在线中文| 国产伦理片在线播放av一区| 国产成人精品婷婷| 观看免费一级毛片| 又大又黄又爽视频免费| 免费黄色在线免费观看| 日本黄大片高清| 久久99热这里只频精品6学生| 久久久a久久爽久久v久久| 精品人妻视频免费看| 99久国产av精品国产电影| 久久久久国产网址| 国产综合精华液| 男人添女人高潮全过程视频| 免费电影在线观看免费观看| 欧美高清性xxxxhd video| freevideosex欧美| 国产精品熟女久久久久浪| 岛国毛片在线播放| 亚洲精品久久午夜乱码| 18+在线观看网站| 久久久久久久久大av| 免费看日本二区| 欧美精品一区二区大全| 热99国产精品久久久久久7| www.av在线官网国产| 国产精品三级大全| 夜夜爽夜夜爽视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 五月玫瑰六月丁香| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产一区二区三区av在线| 黄色视频在线播放观看不卡| 大话2 男鬼变身卡| 久久国内精品自在自线图片| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 一级二级三级毛片免费看| 中文字幕久久专区| 大码成人一级视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 少妇丰满av| 亚洲精品成人av观看孕妇| 日本黄大片高清| 欧美成人一区二区免费高清观看| 亚洲在久久综合| 激情五月婷婷亚洲| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 精品久久久久久久久av| 成人综合一区亚洲| av免费在线看不卡| 高清在线视频一区二区三区| 少妇人妻 视频| 热re99久久精品国产66热6| 网址你懂的国产日韩在线| 久久综合国产亚洲精品| 国产又色又爽无遮挡免| 夫妻午夜视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 欧美日韩在线观看h| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲电影在线观看av| 国产免费视频播放在线视频| 黄色一级大片看看| 欧美zozozo另类| 尾随美女入室| 听说在线观看完整版免费高清| 天堂网av新在线| 亚洲av.av天堂| 国产精品蜜桃在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 51国产日韩欧美| 99久久九九国产精品国产免费| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产精品不卡视频一区二区| 嫩草影院精品99| 秋霞伦理黄片| 精品久久国产蜜桃| a级一级毛片免费在线观看| 国产男人的电影天堂91| 精品一区二区三卡| 久久久国产一区二区| 久久久a久久爽久久v久久| 99久久精品热视频| 久久久久久久久久久丰满| 26uuu在线亚洲综合色| 免费看日本二区| 国产黄频视频在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 精品一区二区三区视频在线| 日韩欧美 国产精品| 久久久久网色| 国产成人精品久久二区二区91 | 久久鲁丝午夜福利片| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产伦理片在线播放av一区| 天堂8中文在线网| 尾随美女入室| 午夜免费鲁丝| 日本黄色日本黄色录像| 国精品久久久久久国模美| 99re6热这里在线精品视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 99国产精品免费福利视频| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲在久久综合| 精品一区二区三区av网在线观看 | 日本wwww免费看| 飞空精品影院首页| 久久久久精品久久久久真实原创| 久久人人97超碰香蕉20202| 中文欧美无线码| 在线观看www视频免费| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 99热全是精品| 香蕉国产在线看| 久久久精品区二区三区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 99热全是精品| 国产一区二区三区av在线| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产乱来视频区| 久久99精品国语久久久| 婷婷色av中文字幕| 亚洲人成电影观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 黑丝袜美女国产一区| 丝袜美足系列| 欧美激情高清一区二区三区 | 视频在线观看一区二区三区| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产精品偷伦视频观看了| 丰满饥渴人妻一区二区三| 青草久久国产| 亚洲精品国产av蜜桃| 最黄视频免费看| 中文字幕制服av| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产在线一区二区三区精| 国产一区二区在线观看av| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 激情五月婷婷亚洲| 亚洲男人天堂网一区| 黄色怎么调成土黄色| 啦啦啦 在线观看视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美av亚洲av综合av国产av | 久久毛片免费看一区二区三区| 男女高潮啪啪啪动态图| 人妻一区二区av| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲成色77777| 丰满少妇做爰视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产精品嫩草影院av在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲美女黄色视频免费看| 黄色 视频免费看| 免费在线观看黄色视频的| 丝瓜视频免费看黄片| 国产97色在线日韩免费| 精品一区二区三卡| 一级毛片电影观看| 91精品三级在线观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲四区av| 国产精品 国内视频| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产 一区精品| 亚洲国产成人一精品久久久| 桃花免费在线播放| 在线观看免费视频网站a站| 久久ye,这里只有精品| 亚洲,欧美,日韩| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 欧美最新免费一区二区三区| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲国产欧美一区二区综合| 青春草国产在线视频| 免费观看a级毛片全部| 三上悠亚av全集在线观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 搡老岳熟女国产| 多毛熟女@视频| 国产毛片在线视频| 嫩草影院入口| 男女下面插进去视频免费观看| 久热爱精品视频在线9| 久久性视频一级片| 自线自在国产av| 少妇被粗大猛烈的视频| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 黄片小视频在线播放| 亚洲精品一二三| 精品一区二区免费观看| 久久久久久人人人人人| 久久精品亚洲av国产电影网| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲第一区二区三区不卡| 色播在线永久视频| 看十八女毛片水多多多| av在线播放精品| 国产又色又爽无遮挡免| 久久久精品94久久精品| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 国产精品三级大全| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产精品亚洲av一区麻豆 | bbb黄色大片| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久精品亚洲av国产电影网| 亚洲欧美激情在线| 国产福利在线免费观看视频| 中文字幕精品免费在线观看视频| 久久国产精品大桥未久av| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 深夜精品福利| 欧美久久黑人一区二区| 午夜福利一区二区在线看| 777米奇影视久久| 无遮挡黄片免费观看| 性少妇av在线| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产一区二区在线观看av| 男人舔女人的私密视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 中文字幕亚洲精品专区| 日韩伦理黄色片| 久久久久久久大尺度免费视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久免费观看电影| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产97色在线日韩免费| 亚洲视频免费观看视频| 嫩草影院入口| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 老汉色∧v一级毛片| 操美女的视频在线观看| 两个人免费观看高清视频| av国产精品久久久久影院| 国产av码专区亚洲av| 少妇 在线观看| 午夜av观看不卡| 精品亚洲成国产av| 久久ye,这里只有精品| 性高湖久久久久久久久免费观看| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲精品,欧美精品| 99久久人妻综合| 男女边吃奶边做爰视频| 在线天堂中文资源库| 中文字幕精品免费在线观看视频| 久久99精品国语久久久| 男女午夜视频在线观看| 中文字幕最新亚洲高清| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 日本一区二区免费在线视频| 成年动漫av网址| 最近中文字幕高清免费大全6| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 韩国av在线不卡| 一区二区av电影网| av视频免费观看在线观看| 黄色毛片三级朝国网站| 交换朋友夫妻互换小说| 18禁动态无遮挡网站| 午夜激情久久久久久久| 成年人免费黄色播放视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 欧美日韩成人在线一区二区| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产精品一区二区在线不卡| 免费高清在线观看日韩| 一边摸一边做爽爽视频免费| 精品国产一区二区久久| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产成人免费无遮挡视频| 交换朋友夫妻互换小说| 999久久久国产精品视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲一区中文字幕在线| 操出白浆在线播放| 久久久精品免费免费高清| 美女福利国产在线| 麻豆av在线久日| 亚洲国产精品国产精品| 久久影院123| 欧美激情高清一区二区三区 | 亚洲国产av影院在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 卡戴珊不雅视频在线播放| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲图色成人| 中文字幕最新亚洲高清| 丝袜美腿诱惑在线| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 日本91视频免费播放| 国产激情久久老熟女| 亚洲成人国产一区在线观看 | 好男人视频免费观看在线| 免费观看人在逋| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 日韩大码丰满熟妇| 国产一级毛片在线| 国产成人91sexporn| 在线观看免费视频网站a站| 色视频在线一区二区三区| 久久女婷五月综合色啪小说| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 麻豆av在线久日| 老司机靠b影院| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 丝袜喷水一区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 另类亚洲欧美激情| 成人漫画全彩无遮挡| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久人妻熟女aⅴ| 最近2019中文字幕mv第一页| 91国产中文字幕| 999久久久国产精品视频| 十分钟在线观看高清视频www| 国产淫语在线视频| 亚洲国产精品一区三区| 大香蕉久久网| 又黄又粗又硬又大视频| 日韩av不卡免费在线播放|