自組裝多肽在生物醫(yī)藥領域的研究進展

劉旭，尹彩云，陳海燕，朱頤申

南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，南京211816

分子自組裝[1]是指分子通過分子間的相互作用形成具有有序結(jié)構(gòu)的聚集體，表現(xiàn)出單個分子或低級分子聚集體所沒有的特性與功能。分子自組裝的發(fā)現(xiàn)促進了材料、化學、生物等學科的交叉融合，是近年來備受關注的研究領域。

1993 年美國麻省理工學院的張曙光博士[2]從酵母蛋白中發(fā)現(xiàn)了一個異乎尋常的具有自組裝成β-折疊的離子互補型多肽（AEAEAKAK）2；同年，Engels M 等[3]通過交替改變氨基酸的空間結(jié)構(gòu)，設計并合成了可在水溶液中自組裝形成納米管狀結(jié)構(gòu)的環(huán)肽cyclo-[（QDAEDA）2]，自此開拓了多肽自組裝的新領域。多肽自組裝是分子自組裝的重要組成部分，與其他納米材料相比，自組裝多肽具有良好的生物相容性、易改造、可降解以及免疫反應低等特性[4]。近年來隨著研究的不斷深入，自組裝多肽已被廣泛用于藥物遞送、組織修復、臨床治療等方面[5]。本文介紹了組裝多肽在藥物遞送、生物醫(yī)學檢測、組織工程、疫苗工程等方面的應用。

1 自組裝多肽的概念、設計原則、分類及分析方法

多肽自組裝指多肽通過非共價鍵（如氫鍵、疏水作用、范德華力、π-π 堆積作用等）自發(fā)組裝成高度有序的納米結(jié)構(gòu)[3]，這種組裝結(jié)構(gòu)具有環(huán)境響應性、優(yōu)良的生物相容性和生物降解性。

自組裝多肽的分子設計，是利用多肽分子間或分子片段間非共價鍵作用，形成具有特定排列順序的分子聚集體[4]，其中非共價鍵相互作用是多肽分子發(fā)生自組裝的關鍵[5]。在設計自組裝多肽時，應遵循的分子設計原則包括：①非共價鍵相互作用能維持自組裝多肽的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和完整性，使自組裝體系的能量最低；②多肽分子間空間體積和電性互補，能夠?qū)崿F(xiàn)空間尺寸和方向的重排與堆積[6，7]。制備自組裝多肽目前主要采用化學合成法，包括固相合成法、液相合成法和固-液相結(jié)合合成法[8]。

根據(jù)自組裝過程是否需要外界環(huán)境調(diào)控，自組裝多肽可分為自發(fā)型和觸發(fā)型兩種。自發(fā)型指多肽溶解于水溶液時可自發(fā)地形成組裝結(jié)構(gòu)，如Cavalli S 等[9]設計的兩親性脂肽（ALPs），包含疏水性的磷脂結(jié)構(gòu)及親水性的多肽序列（LE）4，可在水中自組裝成β 折疊的納米纖維結(jié)構(gòu)。觸發(fā)型指多肽在pH、溫度、光照、酶等環(huán)境條件誘導下形成組裝結(jié)構(gòu)[10-12]，如Yang ZM 等[13]設計的兩親性多肽Nap-FFGEY，其在非共價鍵作用下自組裝成納米纖維結(jié)構(gòu)，加入磷酸激酶使酪氨酸（Y）位點磷酸化，形成親水性增加的Nap-FFGEpY，該磷酸化多肽破壞了自組裝結(jié)構(gòu)；進一步加入磷酸酯酶使其去磷酸化，從而恢復自組裝納米纖維結(jié)構(gòu)。磷酸激酶和磷酸酯酶交替調(diào)控多肽的磷酸化和去磷酸化，進而調(diào)節(jié)Nap-FFGEY 的自組裝行為。

自組裝多肽的分析研究多集中于物性力學表征和體內(nèi)外活性等方面，質(zhì)控分析報道較少。其表征包括表面形貌、粒徑、流變學特性和結(jié)構(gòu)分析等。自組裝多肽納米結(jié)構(gòu)的表面形貌觀察[14]主要利用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）、低溫TEM 和原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）進行研究。動態(tài)光散射研究[15]用于分析自組裝多肽粒徑分布。流變學特性采用錐板、平行板或轉(zhuǎn)筒流變儀進行表征，通常測試彈性模量（G′）（也稱儲能模量）和黏性模量（G″）（也稱損耗模量），隨剪切應力、頻率、時間、溫度等的變化規(guī)律。結(jié)構(gòu)分析可通過液質(zhì)聯(lián)用、圓二色譜（circular dichroism，CD）、傅里葉變換紅外光譜、核磁共振和X 射線散射/衍射技術進行研究。自組裝多肽體外評價方法包括酶動力學、結(jié)合力測定、生物活性測定，其中酶動力學測定采用酶促反應；采用生物膜層干涉技術[16]（bio-layer interferometry，BLI）和表面等離子共振技術[17]（surface plasmon resonance，SPR）測定多肽分子之間的結(jié)合力；采用均相時間分辨熒光技術[18]（homogeneous time resolved fluorescence，HTRF）檢測多肽刺激細胞后產(chǎn)生的化學物質(zhì)測定生物活性等。自組裝多肽體內(nèi)評價一般采用動物或動物器官，作用機理明確的檢測相關生物標志物，作用機理不明確則觀察治療效果，如利用小鼠心肌梗死模型（myocardial infarction，MI）研究自組裝多肽RADA16-SVVYGLR 對心肌修復效果[19]。

2 自組裝多肽在生物醫(yī)藥領域的應用

2.1 藥物遞送

近年研究發(fā)現(xiàn)，自組裝多肽因其生物相容性、生物降解性和多功能性，可作為一種高效的物質(zhì)遞送系統(tǒng)，向體內(nèi)轉(zhuǎn)運小分子或蛋白質(zhì)藥物、細胞因子、抗原、遺傳物質(zhì)等，從而提高難溶藥物的生物利用度，增強化療藥物的選擇性，延長藥物作用時間，顯著改善藥物的理化性質(zhì)及生物學活性等，用于藥物開發(fā)和臨床治療[20]。

2.1.1 抗腫瘤藥物遞送 近年來利用自組裝多肽制備納米管、納米顆粒、納米囊泡、納米纖維和納米膠束，封裝了多種類型的抗腫瘤藥物[21，22]，包括阿霉素[23]、姜黃素[24]、氟尿嘧啶[25]和紫杉醇[26]等，在臨床前或臨床試驗中用于癌癥治療[27]。

Gong ZY 等[28]以抗癌藥阿霉素為疏水模型藥，使用兩親性多肽L6K4在中性條件下自組裝形成球形納米顆粒包封阿霉素，它巧妙利用人宮頸癌細胞（Hela）的酸性微環(huán)境來破壞pH 響應的L6K4自組裝納米顆粒結(jié)構(gòu)，使載藥納米顆粒膨脹裂解，實現(xiàn)48 h內(nèi)阿霉素持續(xù)釋放。L6K4負載的阿霉素更易被HeLa細胞攝取，致其癌細胞存活率顯著低于經(jīng)游離阿霉素處理的細胞，表明L6K4包封阿霉素能對腫瘤細胞產(chǎn)生特意性損傷作用，減少了游離阿霉素對正常細胞的毒性。即這種酸響應誘導的自組裝多肽納米顆粒作為一種新穎的抗癌藥物遞送系統(tǒng)初步可行。

2.1.2 中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物遞送 由于血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的阻礙，將治療性多肽或蛋白質(zhì)遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）成為目前治療CNS 疾病的主要挑戰(zhàn)。Cheetham AG 等[29]構(gòu)建了一種修飾多肽自組裝的藥物遞送系統(tǒng)，可將藥物透過BBB 或經(jīng)鼻腔向CNS遞送。

內(nèi)啡肽-1（endomorphin-1，EM-1，序列：YPYFNH2）是一種μ 阿片受體激動劑，但其降解性和有限的膜通透特性限制了臨床應用[30]。Liu H 等[31]設計了兩親性EM-1 衍生物C18-SS-EM1 為多肽遞送載體，在水中自組裝成球形納米顆粒，小鼠尾靜脈注射后在血漿中不易被降解，透過BBB 后多肽遞送載體的二硫鍵斷裂釋放EM-1。近紅外熒光成像顯示，親脂性二烷基碳菁類染料（dialkylcarbocyanines，DiR）標記的C18-SS-EM1 納米顆粒在大腦中的熒光強度明顯高于游離EM-1，表明C18-SS-EM1 透過BBB 到達CNS 部位起效。這種自組裝多肽遞藥系統(tǒng)是一種有效的CNS 藥物遞送形式。

神經(jīng)肽S（neuropeptide S，NPS，序列：SFRNGV GSGAKKTSFRRAKQ）具有較強的抗焦慮活性，然而其代謝穩(wěn)定性差，不能透過BBB，導致應用受限[32]。經(jīng)鼻藥物遞送可使脂質(zhì)修飾的NPS 作為多肽遞送載體直接從鼻腔遞送到大腦而不涉及血腦屏障。Li S等[33]用棕櫚酸修飾NPS 得到可自組裝形成α 螺旋納米纖維的M-3，α 螺旋結(jié)構(gòu)可保護NPS 在經(jīng)鼻腔遞送到大腦作用部位時不易被酶解。離體熒光成像結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠鼻內(nèi)注射近紅外花青素熒光染料（cyanine 7，Cy7）標記的Cy7-M-3 和Cy7-NPS，4 h后腦內(nèi)Cy7-M-3 熒光強度顯著高于Cy7-NPS，這表明M-3 具有更好的膜穿透性和穩(wěn)定性，并在腦內(nèi)發(fā)揮作用。脂質(zhì)修飾多肽類藥物自組裝給藥系統(tǒng)改善了多肽代謝穩(wěn)定性差、易受酶降解的不足，有望用于CNS 的藥物遞送。

2.1.3 心血管藥物遞送 RADA16 和EAK16 等自組裝多肽可促進內(nèi)皮細胞粘附生長、血管生成和胚胎干細胞分化[34]，通過在氨基或羧基末端修飾生物活性多肽序列，可獲得更好的生物學作用。

胸腺素β4（thymosin β4，Tβ4）是一種G-肌動蛋白螯合肽，已被證實可促進心肌梗死后的血管和心肌生成[35]。Wang YL 等[36]將多肽RPRHQGVM（RPR）與RGD 偶聯(lián)到RADA16-I（RADA）C端，得到一種新的功能化自組裝多肽RADA-RPR，Tβ4 包埋于自組裝納米顆粒中，得到RADA-RPR-Tβ4。在小鼠MI 模型內(nèi)注射RADA-RPR-Tβ4，Tβ4 降解緩慢。與游離Tβ4 相比，RADA-RPR-Tβ4 釋放時間延長。研究發(fā)現(xiàn)，RADA-RPR-Tβ4 顯著改善了小鼠的心臟收縮功能，心肌梗死區(qū)域有大量的血管和淋巴管生成，存活心肌增多，梗死面積和瘢痕面積也明顯減小，表明自組裝多肽載藥能夠在心肌促進血管細胞募集和血管形成。

2.2 生物醫(yī)學檢測

自組裝多肽能夠特異性識別病灶部位高表達的生物標志物，實現(xiàn)疾病的精確診斷和有效治療[37]。通過原位和異位構(gòu)建組合各種成像物（即放射性同位素、熒光發(fā)色團等）的自組裝多肽，已開發(fā)出多種高度特異性的自組裝多肽類探針，成為醫(yī)學檢測和成像的重要方法。

在腫瘤診斷方面，腫瘤細胞相比正常細胞處于快速增殖的狀態(tài)，部分酶在腫瘤細胞中高表達，如堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）等。根據(jù)這一特點，可制備基于酶誘導的原位自組裝多肽探針用于腫瘤早期診斷。Zhong YL 等[38]將具有ALP 催化位點的Nap-GFFKpYD 與熒光分子7-二乙氨基香豆素-3-羧酸（（7-（diethylamino）coumarin-3-carboxylic acid，Cou）共價結(jié)合獲得Nap-GFFK（Cou）pYD，荷瘤裸鼠尾靜脈注射后，腫瘤部位高表達的ALP 使Nap-GFFK（Cou）pYD 的磷酸基團脫去，觸發(fā)自組裝，在背部腫瘤區(qū)域聚集形成發(fā)光納米纖維，熒光強度隨時間推移而特異性增強，說明了Nap-GFFK（Cou）pYD可以靶向到達腫瘤部位。這種具有酶響應性的原位自組裝多肽熒光探針可高效鑒別腫瘤細胞及腫瘤組織，有望成為腫瘤早期診斷的分子成像工具。

Fan Z 等[39]研究發(fā)現(xiàn)，WF 二肽自組裝成納米顆粒（dipeptide nanoparticles，DNPs），將多肽的熒光信號從紫外區(qū)紅移至可見光區(qū)，用癌細胞表面高表達的黏蛋白-1（Mucin-1，MUC1）配體修飾DNPs，可以識別位于人肺癌細胞（A549）細胞膜上過表達的MUC1 蛋白，表明DNPs 能夠用于癌癥生物成像。

此外，隨著抗生素濫用現(xiàn)象增加，細菌耐藥性問題日益突出，迫切需要實時準確診斷細菌感染的工具。Yang C 等[40]以自組裝多肽FF 為骨架，以聚集誘導發(fā)光（aggregation-induced emission，AIE）為響應性熒光開啟基序的發(fā)光源，以萬古霉素（vancomycin）為靶向基團識別革蘭陽性菌，設計了多肽-AIE 偶聯(lián)物細菌靶向探針，用于診斷和治療革蘭陽性菌感染。AIE 分子單體不發(fā)光，僅在聚集狀態(tài)下呈現(xiàn)明顯的熒光增強現(xiàn)象，多肽自組裝促進AIE聚集，從而誘導AIE 發(fā)光，同時AIE 通常具有大共軛體系,其強疏水性提供了自組裝驅(qū)動力，分子間π-π 相互作用能夠穩(wěn)定自組裝結(jié)構(gòu)，強化多肽探針的自組裝能力。當細菌感染時，萬古霉素修飾的FF可以特異性地結(jié)合革蘭陽性菌細胞壁中的DADA 序列，從而誘導探針分子自組裝，限制AIE 的分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)而開啟熒光，同時自組裝能夠增強AIE 產(chǎn)生活性氧的能力，最終實現(xiàn)對革蘭陽性細菌的體內(nèi)外特異性檢測和高效光動力殺滅作用。

2.3 疫苗工程

以自組裝納米材料作為載體，其提供的微環(huán)境可能有助于與抗原呈遞細胞（antigen presenting cells，APCs）相互作用，有助于預防疾病和開發(fā)免疫治療疫苗[41]。多肽疫苗設計主要集中在利用抗原蛋白的特定修飾差異以提高選擇性免疫應答，提高免疫原性。

Q11（Ac-QQKFQFQFEQQ-NH2）是一種在疫苗工程中常用的自組裝多肽，Q11 在鹽溶液中通過非共價鍵作用可以自組裝成β 折疊的納米纖維結(jié)構(gòu)。Li SJ等[42]研究了自組裝納米載體改善多肽抗原疫苗的免疫原性，將可識別細胞毒性T 淋巴細胞的HPV16 E744-62（HPV16 型E7 癌蛋白44-62 序列QAEPDRAHYNIVTFCCKCD），抗原肽通過共價鍵連接在Q11 氨基端，在鹽溶液中通過自組裝折疊形成高效呈遞抗原表位的納米纖維疫苗E744-62-Q11，從而提高抗原肽疫苗的免疫原性。小鼠皮下異位移植腫瘤細胞TC-1 模型，分別接種E744-62-Q11 疫苗和Q11，結(jié)果顯示，E744-62-Q11 組小鼠腫瘤重量顯著低于Q11組，腫瘤治愈率高達66.7%，且小鼠脾臟淋巴細胞中E7 特異性分泌干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）的T 細胞水平更高，在腫瘤小鼠體內(nèi)可以顯著誘導抗腫瘤細胞免疫應答。此外，E744-62-Q11 在小鼠體內(nèi)具備良好的安全性，有望轉(zhuǎn)化為治療HPV 腫瘤的新型納米疫苗。

Song YQ 等[43]設計并合成了兩對形態(tài)不同的自佐劑多肽疫苗，多肽疫苗通過自組裝五肽FF-Amp-FF（AmpF）或FFPFF（PF）與E7 片段結(jié)合，形成兩種納米纖維疫苗AmpF-E7（AmpF-E749-57和AmpFE744-57）和兩種納米顆粒疫苗PF-E7（PF-E749-57和PFE744-57）。多肽疫苗誘導樹突狀細胞（dendritic cell，DC）的成熟，抗原呈遞的免疫學結(jié)果顯示，所得多肽疫苗具有自佐劑特性。與PF-E7 相比，AmpF-E7 在DC 中內(nèi)化增強，保留時間延長，因而其在DCs 成熟、淋巴結(jié)聚集、細胞毒性T 淋巴細胞浸潤腫瘤組織，以及最終溶解腫瘤細胞等方面的性能更高。在流式細胞術和細胞攝取實驗中，用多肽疫苗AmpF-E7 處理細胞的定量熒光強度明顯高于游離抗原，證明納米纖維多肽疫苗能改善細胞對抗原的攝取。

2.4 細胞培養(yǎng)

自組裝多肽水凝膠可提供類似細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的微環(huán)境，有利于細胞的黏附、增殖、遷移和分化，可用于細胞的體外培養(yǎng)。

Fukunaga K 等[44]設計的多肽E1Y9（Ac-EYEYKYEYKY-NH2），可在含鈣離子溶液中自組裝成具有β 折疊構(gòu)象的納米纖維，進而形成水凝膠。具有鈣離子響應的E1Y9 自組裝多肽水凝膠可以制備出串狀和球形水凝膠，這種球形水凝膠不僅提供了與細胞相容的環(huán)境，還可以模擬自然組織或器官形狀，為細胞創(chuàng)造良好的結(jié)構(gòu)支撐，適用于細胞的3D 培養(yǎng)。Tsutsumi H 等[45]通過將E1Y9 與生物活性部分偶聯(lián)，進一步設計了E1Y9 的衍生物E1Y9-RGDS（Ac-EYEYKYEYKY-GGG-RGDS -NH2）。E1Y9-RGDS 保持了多肽的自組裝特性，且在將其與成纖維細胞3T3-L1 共同培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，E1Y9-RGDS 水凝膠會促進3T3-L1 的粘附和分化，而且不會引起免疫反應和組織炎癥。

Ai S 等[46]設計的自組裝多肽Biotin-DFYIGSRGD 可在溶液中自組裝成超分子多肽水凝膠（supramolecular peptide hydrogel，SupraGel），將人乳腺癌細胞MCF-7、小鼠乳腺癌細胞4T1 以及小腸干細胞ISCs 分別與SupraGel 培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，3 種細胞都可以有效地分裂成細胞球體，且該球體形態(tài)可以提高細胞存活率，增加生長因子的分泌和保持細胞的多功能性。與傳統(tǒng)的2D 培養(yǎng)細胞相比，3D 培養(yǎng)細胞球明顯更能模擬天然組織和體內(nèi)環(huán)境，從而在細胞生物學研究、組織工程和藥物篩選中發(fā)揮更大的應用潛力。

2.5 組織工程

組織工程方法由3 個關鍵要素（支架、細胞、生長因子）組成[47]，其中支架是提供細胞仿生環(huán)境的關鍵。自組裝多肽支架因有良好的生物相容性、可調(diào)控的生物降解性，已用于神經(jīng)、脊髓和骨組織工程中。

在神經(jīng)組織工程方面，支架材料能與神經(jīng)細胞良好相容，誘導軸突的發(fā)生與延長，抑制瘢痕組織的形成。N-鈣粘蛋白由神經(jīng)細胞表達，控制神經(jīng)網(wǎng)絡中軸突引導，突觸形成，突觸結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)以及星形膠質(zhì)細胞與突觸接觸等[48]。Kaur H 等[49]合成了N-鈣粘蛋白模擬多肽衍生物Fmoc-HAVDI 和Nap-HAVDI，證實了Fmoc-HAVDI 和Nap-HAVDI 水凝膠支持大鼠膠質(zhì)瘤細胞C6 的粘附、增殖和遷移，表現(xiàn)出在神經(jīng)組織工程中的應用潛力。

在脊髓組織工程方面，支架可提供脊髓鄰近細胞生長的環(huán)境和空間，指引神經(jīng)元軸突延伸，防止外界成分干擾和瘢痕形成，使新生組織接近于正常組織結(jié)構(gòu)。脊髓損傷后血脊髓屏障的破壞會導致炎癥和神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕形成，從而抑制軸突生長，并降低移植到損傷部位支架的有效性。Tran KA 等[50]研究了RADA 自組裝多肽納米纖維支架對大鼠脊髓損傷的修復，表明其可以減少脊髓損傷大鼠的炎癥和神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕形成，并增加損傷移植部位的軸突密度，減小脊髓損傷區(qū)域的面積，證明載細胞自組裝多肽支架可用于脊髓損傷的修復。

在骨組織再生方面，自組裝多肽對骨質(zhì)疏松癥和軟骨缺損等骨組織疾病具有理想的治療效果。Li L 等[51]將自組裝多肽水凝膠（self-assembling peptide hydrogel，SAPH）涂覆在聚己內(nèi)酯（polycaprolactone，PCL）支架上，一方面提供了SAPH 納米纖維和微米纖維網(wǎng)絡，形成有利于骨和軟骨細胞生長的仿生ECM 微環(huán)境，另一方面SAPH 顯著改善了PCL 表面疏水性，有利于細胞黏附和ECM 沉積，實現(xiàn)了兔關節(jié)腔骨和軟骨缺損的同步修復。SAPHPCL 為骨和軟骨缺損修復提供了一種新的治療方法，在軟骨再生醫(yī)學領域具有潛在的開發(fā)價值。

3 總結(jié)與展望

目前已有多種自組裝多肽產(chǎn)品用于細胞培養(yǎng)和組織工程研究，如用于細胞3D 培養(yǎng)的PuraMatrix（RADA16），手術止血劑PuraStat（RADA16），用于子宮修復、心肌梗死治療、骨修復和慢性糖尿病潰瘍修復的Sciobio-Ⅰ、-Ⅱ、-Ⅲ和-Ⅳ（EAK16）等。作為Ⅲ類醫(yī)療器械，PuraStat 在歐洲、澳大利亞、新西蘭、東南亞等地均有銷售；Sciobio 系列產(chǎn)品在中國、歐洲、北美等地均有銷售應用。

綜上，自組裝多肽因其特有的性質(zhì)，在藥物遞送、生物醫(yī)學檢測、組織工程、疫苗工程等各領域顯示出廣闊的應用前景。然而，多肽自組裝技術也面臨著較多挑戰(zhàn)：自組裝原理和機制還需深入研究；自組裝結(jié)構(gòu)易受環(huán)境因素影響；自組裝多肽水凝膠的機械性能較低；生產(chǎn)成本較高，大規(guī)模生產(chǎn)面臨較大困難；生物安全性有待更全面地研究；需進一步探尋自組裝多肽生物學作用的評價體系等。