circ_DONSON靶向miR-671-5p影響肺癌細胞放射敏感性的實驗研究

覃 波， 陸 錄， 趙 濤

(湖北省利川市人民醫(yī)院腫瘤科， 湖北 利川 445400)

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，失去最佳手術(shù)治療時期[1]。放療是晚期肺癌治療的主要手段，然而，肺癌細胞對放射線產(chǎn)生的抗性(即放療抵抗)常導(dǎo)致放療效果不佳[2]，因此，增強肺癌細胞的放射敏感性對于提高放療療效、改善患者預(yù)后尤為重要。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)是真核生物中廣泛存在的兩類非編碼RNA，且circRNA可與miRNA靶向結(jié)合，調(diào)控miRNA靶基因的表達，進而發(fā)揮生物學(xué)調(diào)控作用，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及放療抵抗中起重要調(diào)控作用[3～5]。研究顯示，circ_DONSON在神經(jīng)膠質(zhì)瘤和胃癌中的表達均明顯增加，其發(fā)揮促癌基因作用促進腫瘤細胞惡性表型，是神經(jīng)膠質(zhì)瘤和胃癌治療的潛在分子靶點[6,7]。然而，circ_DONSON對肺癌發(fā)生發(fā)展和放療抵抗的影響還未知。Starbase靶基因在線軟件預(yù)測顯示，circ_DONSON可能與miR-671-5p存在靶向調(diào)控關(guān)系。據(jù)報道，miR-671-5p的過表達可通過靶向抑制小腦變性相關(guān)蛋白1阻礙肺癌細胞遷移和侵襲[8]。本研究主要探究了circ_DONSON和miR-671-5p對肺癌細胞放射敏感性的影響及circ_DONSON能否靶向miR-671-5p發(fā)揮作用，以期為改善肺癌放療抵抗提供分子靶點。

1 資料與方法

1.1臨床資料:收集于2018年5月至2020年10月于本院行手術(shù)治療的43例肺癌患者的癌組織及癌旁組織，液氮保存，其中男性25例，女性18例，平均年齡(57.26±7.21)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：首次確診；術(shù)前未行放療、化療等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤患者。本研究符合《赫爾辛基宣言》原則。

1.2細胞和試劑:A549細胞系，中國科學(xué)院上海細胞庫；RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒，大連寶生物；RPMI 1640培養(yǎng)基、細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)、雙熒光素酶活性檢測試劑盒、LipofectamineTM 2000試劑盒、二喹啉甲酸蛋白檢測試劑盒和膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)凋亡檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清，美國Hycolne公司；引物序列、circ_DONSON小干擾RNA(si-circ_DONSON)、亂序無意義陰性序列(si-NC)、miR-671-5p模擬物(mimcs)、模擬對照序列(miR-NC)、miR-671-5p抑制劑(inhibitor)，上海生工；兔抗人活化的半胱天冬酶-3(Cleaved-caspase3)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體及山羊抗兔二抗，中國Abcam公司。

1.3方 法

1.3.1實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測circ_DONSON和miR-671-5p表達在液氮保護下將收集的組織樣本充分研磨，用RNA抽提試劑盒提取組織樣本中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，行PCR擴增。引物序列：circ_DONSON上游5'-GTCGACTAGCGGCTCGACCGC-3'，下游5'-CGATAGGCGCTGCCTAGCCG-3'；GAPDH上游5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'；miR-671-5p上游5'-AGGAAGCCCTGGAGG-3'，下游5'-GAACATGTCTGCGTATCTC-3'；U6上游5'-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3'，下游5'-GTACAACACATTGTTTCCTCGGA-3'。2-△△Ct法計算circ_DONSON相對GAPDH、miR-671-5p相對U6的表達量。

1.3.2細胞培養(yǎng)和照射處理:用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液(完全培養(yǎng)液)培養(yǎng)A549細胞。將對數(shù)期A549細胞接種至6孔板中(1.0×105個/孔)，培養(yǎng)12h后，一次性給予2Gy、4GyX-ray照射[5]，劑量率為1.907Gy/min，源板距50cm。照射后，培養(yǎng)24h，收集細胞，用RT-qPCR法檢測細胞中circ_DONSON和miR-671-5p表達，方法同1.3.1。同時設(shè)置對照組，細胞常規(guī)培養(yǎng)，不進行照射處理。

1.3.3細胞轉(zhuǎn)染:將對數(shù)期A549細胞接種至6孔板中(1.0×105個/孔)，培養(yǎng)24h后，棄培養(yǎng)液，加不含F(xiàn)BS的RPMI 1640培養(yǎng)液。然后用LipofectamineTM 2000脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染si-circ_DONSON、si-NC、miR-671-5p mimic、miR-NC、共轉(zhuǎn)染si-circ_DONSON與miR-671-5p inhibitor(si-circ_DONSON+miR-671-5p inhibitor)。轉(zhuǎn)染6h后，棄培養(yǎng)液，加完全培養(yǎng)液。再培養(yǎng)24h，RT-qPCR法檢測細胞中circ_DONSON或miR-671-5p表達驗證轉(zhuǎn)染效果，方法同1.3.1。

1.3.4CCK-8法檢測細胞增殖活性:將未轉(zhuǎn)染的A549細胞(對照組)、轉(zhuǎn)染si-circ_DONSON、si-NC、miR-671-5p mimic、miR-NC、si-circ_DONSON+miR-671-5p inhibitor的A549細胞均接種至96孔板中(5.0×104個/孔)，培養(yǎng)12h后，均一次性給予4Gy X-ray照射，照射條件同1.3.2。照射后，再培養(yǎng)24h。加10μL CCK-8，孵育2h后，酶標(biāo)儀(450nm)測光密度(optical density，OD)值。OD值越大，說明細胞增殖活性越強。

1.3.5克隆形成實驗檢測細胞集落形成:將未轉(zhuǎn)染的A549細胞(對照組)、轉(zhuǎn)染si-circ_DONSON、si-NC、miR-671-5p mimic、miR-NC、si-circ_DONSON+miR-671-5p inhibitor的A549細胞均接種至6孔板中(1.0×105個/孔)，培養(yǎng)12h后，均一次性給予4Gy X-ray照射，照射條件同1.3.2。照射后，繼續(xù)培養(yǎng)10～14d。當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的集落時，棄培養(yǎng)液。用4%多聚甲醛固定30min，0.4%結(jié)晶紫染色15min，顯微鏡觀察，統(tǒng)計集落形成數(shù)。

1.3.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡:細胞接種及照射處理同1.3.5。照射后，繼續(xù)培養(yǎng)24h。棄培養(yǎng)液，收集各組細胞。利用Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測細胞凋亡。

1.3.7蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞中Cleaved-caspase3表達:細胞接種及照射處理同1.3.5。照射后，繼續(xù)培養(yǎng)24h。然后棄培養(yǎng)液，收集各組細胞。用RIPA試劑提取細胞中總蛋白，經(jīng)二喹啉甲酸試劑盒測蛋白濃度后進行電泳分離。然后將分離蛋白進行轉(zhuǎn)膜和封閉處理后，在4℃冰箱中分別用Cleaved-caspase3(1∶500)和GAPDH(1∶1000)一抗孵育過夜。洗膜后，再于37℃搖床中用山羊抗兔二抗(1∶1000)孵育2h。加顯影液，避光顯影，曝光拍照，Image J軟件分析Cleaved-caspase3相對GAPDH的表達量。

1.3.8雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?由上海生工生物工程有限公司采用PCR技術(shù)擴增含miR-671-5p結(jié)合位點的circ_DONSON核苷酸序列，插入pGL3空載體，構(gòu)建circ_DONSON野生型熒光素酶報告基因載體(WT-circ_DONSON)；同時將結(jié)合位點突變后進行擴增，插入pGL3空載體，構(gòu)建circ_DONSON突變型熒光素酶報告基因載體(MUT-circ_DONSON)。將對數(shù)期A549細胞接種至6孔板中(1.0×105個/孔)，培養(yǎng)24h后，棄培養(yǎng)液。加不含F(xiàn)BS的RPMI 1640培養(yǎng)液。用LipofectamineTM 2000脂質(zhì)體法，分別共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circ_DONSON與miR-671-5p mimic或miR-NC、MUT-circ_DONSON與miR-671-5p mimic或miR-NC。轉(zhuǎn)染6 h后，更換為完全培養(yǎng)液。再培養(yǎng)24 h，裂解細胞。離心(3500 r/min、5 min)，取上清液，檢測熒光素酶活性，結(jié)果以螢火蟲與海腎的熒光強度比值表示。

2 結(jié) 果

2.1circ_DONSON和miR-671-5p在肺癌組織中的表達及其與患者臨床指標(biāo)之間的關(guān)系分析:肺癌組織中circ_DONSON的表達量為4.27±0.38，高于癌旁組織中circ_DONSON的表達量(0.80±0.13，t=56.656，P<0.05)；而miR-671-5p的表達量為0.37±0.07，低于癌旁組織中miR-671-5p的表達量(0.37±0.07，t=34.457，P<0.05)。見圖1。

圖1 肺癌組織中circ_DONSON和miR-671-5p的表達

2.2X-ray對肺癌細胞A549中circ_DONSON和miR-671-5p表達的影響:與對照組肺癌細胞A549比較，A549細胞經(jīng)劑量(2Gy、4Gy) X-ray照射后，細胞中circ_DONSON表達升高(P<0.05)，而miR-671-5p表達降低(P<0.05)。見表1。

表1 X-ray對肺癌細胞A549中circ_DONSON和miR-671-5p表達的影響

2.3沉默circ_DONSON對肺癌細胞增殖凋亡的影響:對照組、轉(zhuǎn)染si-NC、si-circ_DONSON的肺癌細胞A549中circ_DONSON表達分別為1.00±0.00、0.99±0.04、0.16±0.01，三組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1230.529，P<0.05)。轉(zhuǎn)染si-circ_DONSON的A549細胞中circ_DONSON表達顯著低于對照組和轉(zhuǎn)染si-NC的A549細胞(P<0.05)，表明沉默circ_DONSON的A549細胞構(gòu)建成功。與對照組和轉(zhuǎn)染si-NC的A549細胞比較，轉(zhuǎn)染si-circ_DONSON的A549細胞經(jīng)4Gy X-ray照射后，細胞增殖活性和集落形成數(shù)降低(P<0.05)，而細胞凋亡率和細胞中Cleaved-caspase3蛋白表達均升高(P<0.05)。見圖2、表2。

表2 沉默circ_DONSON對X-ray處理的肺癌細胞增殖和凋亡的影響

圖2 沉默circ_DONSON對X-ray處理的肺癌細胞集落形成和凋亡的影響

2.4沉默circ_DONSON靶向調(diào)控miR-671-5p:Starbase靶基因在線軟件預(yù)測顯示的circ_DONSON與miR-671-5p的結(jié)合位點見圖3。共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circ_DONSON與miR-671-5p mimic的肺癌細胞A549熒光素酶活性為0.28±0.02，明顯低于共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circ_DONSON與miR-NC的A549細胞熒光素酶活性1.00±0.09(t=13.526，P<0.05)；共轉(zhuǎn)染MUT-circ_DONSON與miR-671-5p mimic的A549細胞熒光素酶活性為0.99±0.07，與共轉(zhuǎn)染MUT-circ_DONSON與miR-NC的A549細胞熒光素酶活性1.02±0.11比較無顯著差異(P>0.05)，說明circ_DONSON可靶向結(jié)合miR-671-5p。同時，轉(zhuǎn)染si-circ_DONSON的A549細胞中miR-671-5p表達為4.66±0.21，明顯高于轉(zhuǎn)染si-NC的細胞中miR-671-5p的表達1.00±0.02(t=30.051，P<0.05)，說明沉默circ_DONSON促進A549細胞中miR-671-5p表達。

圖3 circ_DONSON與miR-671-5p的互補序列

2.5過表達miR-671-5p對X-ray處理的肺癌細胞增殖和凋亡的影響:對照組、轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-671-5p mimic的肺癌細胞A549中miR-671-5p表達分別為1.00±0.00、0.98±0.09、4.01±0.21，三組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=524.178，P<0.05)。轉(zhuǎn)染miR-671-5p mimic的A549細胞中miR-671-5p表達顯著高于對照組和轉(zhuǎn)染miR-NC的A549細胞(P<0.05)，表明過表達miR-671-5p的A549細胞構(gòu)建成功。與對照組和轉(zhuǎn)染miR-NC的A549細胞比較，轉(zhuǎn)染miR-671-5p的A549細胞經(jīng)4Gy X-ray照射后，細胞增殖活性和集落形成數(shù)降低(P<0.05)，而細胞凋亡率和細胞中Cleaved-caspase3蛋白表達均升高(P<0.05)。見圖4、表3。

圖4 過表達miR-671-5p對X-ray處理的肺癌細胞集落形成和凋亡的影響

表3 過表達miR-671-5p對X-ray處理的肺癌細胞增殖和凋亡的影響

2.6抑制miR-671-5p降低沉默circ_DONSON對X-ray處理的肺癌細胞增殖和凋亡的影響:對照組、轉(zhuǎn)染si-circ_DONSON、共轉(zhuǎn)染si-circ_DONSON與miR-671-5p inhibitor的肺癌細胞A549中miR-671-5p表達分別為1.00±0.00、4.63±0.23、1.26±0.09，三組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=604.953，P<0.05)。共轉(zhuǎn)染si-circ_DONSON與miR-671-5p inhibitor的A549細胞中miR-671-5p表達顯著低于對照組和轉(zhuǎn)染si-circ_DONSON的A549細胞(P<0.05)，表明A549細胞中miR-671-5p表達受到抑制。與轉(zhuǎn)染si-circ_DONSON的A549細胞比較，共轉(zhuǎn)染si-circ_DONSON與miR-671-5p inhibitor的A549細胞經(jīng)4 Gy X-ray照射后，細胞增殖活性和集落形成數(shù)升高(P<0.05)，而細胞凋亡率和細胞中Cleaved-caspase3蛋白表達均降低(P<0.05)。見圖5、表4。

表4 抑制miR-671-5p降低沉默circ_DONSON對X-ray處理的肺癌細胞增殖和凋亡的影響

圖5 抑制miR-671-5p降低沉默circ_DONSON對X-ray處理的肺癌細胞集落形成和凋亡的影響

3 討 論

肺癌的發(fā)生發(fā)展及放療抵抗與原癌基因的激活及抑癌基因的失活密切相關(guān)，探究肺癌中異常表達的基因分子及其對肺癌生發(fā)展和放療抵抗的影響，可為肺癌發(fā)病機制的闡明及治療靶點的選擇提供新途徑。circRNA呈閉合環(huán)狀，穩(wěn)定性較強，且高度保守。當(dāng)前研究顯示，肺癌中存在大量異常表達的circRNA，這些circRNA可通過發(fā)揮miRNA分子海綿作用，調(diào)控miRNA靶基因的表達，進而影響肺癌細胞的惡性表型及放射敏感性，對肺癌發(fā)生發(fā)展及治療效果起調(diào)控作用[9,10]。研究顯示，下調(diào)circ_0086720可通過調(diào)節(jié)miR-375/SPIN1軸增強了肺癌細胞對放射線的敏感性，circ_0086720有可能成為改善肺癌放射治療療效的分子靶點[11]；circPVT1沉默的肺癌細胞進放射線處理后其增殖和侵襲能力降低，說明了沉默circPVT1可促進肺癌細胞對放射線的敏感性[12]。circ_DONSON是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種circRNA，其對肺癌放射敏感的影響還未知。

本研究結(jié)果顯示，肺癌組織中circ_DONSON的表達高于癌旁組織，提示circ_DONSON可能促進肺癌發(fā)展進程；將肺癌細胞置于放射線下照射后，細胞中circ_DONSON的表達增加，而沉默circ_DONSON可降低放射線照射的A549細胞增殖活性和集落形成數(shù)，并提高細胞凋亡率，這表明沉默circ_DONSON可增強A549細胞對放射線的敏感性，circ_DONSON有可能成為改善肺癌放療抵抗的分子靶點。細胞凋亡受多種基因分子的調(diào)控，其中caspase級聯(lián)反應(yīng)在細胞凋亡中起關(guān)鍵調(diào)控作用。caspase3是caspase級聯(lián)反應(yīng)的核心分子，其在受到上游凋亡信號刺激后被活化后生成Cleaved-caspase3，進一步剪切各種細胞底物，誘導(dǎo)細胞凋亡[13]。本研究結(jié)果顯示，沉默circ_DONSON可促進放射線處理的肺癌細胞中caspase3的活化，提示其可能通過調(diào)控caspase級聯(lián)反應(yīng)來影響肺癌細胞凋亡，進而影響肺癌細胞放射敏感性。

為了進一步探究沉默circ_DONSON增強肺癌細胞A549放射敏感性的分子機制，本研究證實了circ_DONSON可靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控miR-671-5p。miR-671-5p參與多種腫瘤的發(fā)展進程。研究顯示，桂枝茯苓丸可通過上調(diào)miR-671-5p的表達削弱人皮膚惡性黑色素瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，具有治療黑色素瘤的潛在價值[14]；骨肉瘤組織和細胞系中miR-671-5p表達下調(diào)，過表達MiR-671-5p了通過靶向抑制釉叢蛋白1(tuftelin 1，TUFT1)的表達阻止骨肉瘤細胞生長、遷移和侵襲，miR-671-5p/TUFT1軸可能為骨肉瘤的治療提供了新靶點[15]；miR-671-5p通過降低乳腺癌細胞的DNA修復(fù)能力增強其對紫外線和化療藥物的敏感性。本研究結(jié)果顯示，miR-671-5p在肺癌組織及放射線照射的肺癌細胞A549中表達減少，提示miR-671-5p有可能參與肺癌放射敏感性；進一步研究發(fā)現(xiàn)，放射線照射的過表達miR-671-5p的A549細胞增殖活性及集落形成數(shù)較未過表達miR-671-5p的A549細胞明顯降低，而凋亡率和細胞中Cleaved-caspase3蛋白表達明顯升高，提示過表達miR-671-5p可增強放射線照射對A549細胞增殖的抑制作用及凋亡促進作用，即過表達miR-671-5p增強了A549細胞的放射敏感性。此外，本研究還顯示，沉默miR-671-5p降低了沉默circ_DONSON對放射線照射的A549細胞增殖和凋亡的影響，提示circ_DONSON可能通過靶向抑制miR-671-5p表達來促進肺癌細胞放療抵抗。

綜上，放射線照射可引起肺癌細胞中circ_DONSON的表達增加，而miR-671-5p表達減少；沉默circ_DONSON可抑制放射線處理的肺癌細胞增殖，并促進其凋亡，增強肺癌細胞放射敏感性，其作用機制可能與靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控miR-671-5p表達有關(guān)。