UPLC-MS/MS測定畜禽肉中利巴韋林藥物與β-受體激動劑殘留量

文 娜，毛瓊玲，左書瑞，陳國通*

(1.新疆維吾爾自治區(qū)分析測試研究院，新疆烏魯木齊 830011；2. 新疆維吾爾自治區(qū)第三人民醫(yī)院檢測中心，新疆烏魯木齊 830011)

利巴韋林又名病毒唑,系廣譜強(qiáng)效的抗病毒藥,為單磷酸次黃嘌呤核苷脫氫酶抑制劑,抑制肌紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)闉踯账?阻礙病毒核酸的合成,阻止病毒復(fù)制和傳播,從而達(dá)到抗病毒的作用[1]。該類藥物易產(chǎn)生耐藥性,使病毒發(fā)生變異,長期使用對機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用,其對人體產(chǎn)生的最突出的安全性問題是溶血性貧血、遺傳毒性、生殖毒性和致癌性等[2]。

β-受體激動劑主要包括克侖特羅(俗稱“瘦肉精”)、妥布特羅、沙丁胺醇、噴布特羅、萊克多巴胺、西馬特羅、氯丙那林、非諾特羅、特布他林共9種，該類化合物曾經(jīng)作為藥物用于治療支氣管哮喘[3]。 這些藥物的高合成代謝潛能使其可被用于運(yùn)動學(xué)和動物飼養(yǎng)學(xué)，以提高肌肉合成、減少身體脂肪，但大劑量的使用會導(dǎo)致其在動物體內(nèi)殘留蓄積，其在肌肉、腎臟、肝臟、肺臟中的殘留蓄積量依次升高，殘留蓄積濃度可達(dá)100～500 ng/g，人食用了這種豬肉后可能會產(chǎn)生劇烈腹痛、肌肉震顫等癥狀[3]，因此限制或禁止在食用動物養(yǎng)殖中使用 β-受體激動劑[3]。

目前還未有利巴韋林和β-受體激動劑殘留同時測定的標(biāo)準(zhǔn)方法。已有的方法都是單獨(dú)檢測這2種藥物[4-8]，對于同一種基質(zhì)來說要進(jìn)行2次前處理、2次上機(jī)，才能完成一個基質(zhì)2個項目的測定，不僅要多耗費(fèi)試劑，還要多耗費(fèi)人力，對于檢測任務(wù)繁重的檢測人員來說效率低下。該研究以現(xiàn)有文獻(xiàn)方法[9-10]為基礎(chǔ),建立了利巴韋林和β-受體激動劑殘留同時檢測的UPLC-MS/MS方法,以期為檢測人員提供技術(shù)幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1儀器。Waters UPLC(H-Class) Xevo TQ-S micro高效液相色譜質(zhì)譜儀(美國 Waters 公司);漩渦振蕩器;高速離心機(jī); 多位氮?dú)鉂饪s儀; Milli-Q 默克超純水制備系統(tǒng)(德國 MERCK公司); Agilent Bond Elut Plexa PCX 固相萃取小柱(60 mg，3 mL，美國 Agilent 公司)。

1.1.2試劑。利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品(純度 99.35%)，購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。利巴韋林-13C5內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。9種受體激動劑標(biāo)準(zhǔn)品克侖特羅、妥布特羅、沙丁胺醇、噴布特羅、萊克多巴胺、西馬特羅、氯丙那林、非諾特羅、特布他林，純度 99%左右，均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。同位素內(nèi)標(biāo)物克侖特羅D-9、沙丁胺醇D-3，均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。甲酸(HPLC級)、甲醇(HPLC級)、β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，均購自德國 Merck 公司。乙酸鈉(分析純)、冰醋酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、異丙醇(分析純)、乙酸乙酯(分析純)、高氯酸(分析純)、氯化鈉(分析純)。去離子水由Milli-Q 超純水系統(tǒng)(德國 Merck公司)制得。

1.1.3樣品來源。全疆14個地州市市場上在售的牛肉、豬肉、羊肉、豬肝、雞肉。

1.2 溶液的配制

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制。分別精密稱取利巴韋林、克侖特羅、妥布特羅、沙丁胺醇、噴布特羅、萊克多巴胺、西馬特羅、氯丙那林、非諾特羅、特布他林標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇分別配制成100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.2.2混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液(1 μg/mL)的配制。分別準(zhǔn)確吸取1.0 mL 利巴韋林、克侖特羅、妥布特羅、沙丁胺醇、噴布特羅、萊克多巴胺、西馬特羅、氯丙那林、非諾特羅、特布他林標(biāo)準(zhǔn)儲備液至 100 mL 容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻。

1.2.3利巴韋林內(nèi)標(biāo)儲備液的配制。稱取適量利巴韋林-13C5內(nèi)標(biāo)，用甲醇溶解,并稀釋配制成100 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液。

1.2.4受體激動劑同位素內(nèi)標(biāo)儲備溶液的配制。稱取適量克侖特羅D-9、沙丁胺醇D-3，用甲醇溶解并稀釋配制成100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

1.2.5同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液的配制。將上述利巴韋林、受體激動劑同位素內(nèi)標(biāo)儲備溶液用甲醇適當(dāng)稀釋，配制成受體激動劑內(nèi)標(biāo)10 ng/mL、利巴韋林內(nèi)標(biāo)100 ng/mL。

1.3 樣品處理稱取2.0 g(精確至 0.01 g) 已制備好的樣品于50 mL離心管中,加入 8 mL乙酸鈉(0.20 mol/L)緩沖液(pH 5.2)，充分混勻，加入50 μLβ-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶,混勻后， 37 ℃水浴12 h。添加100 μL同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液(受體激動劑內(nèi)標(biāo)10 ng/mL，利巴韋林內(nèi)標(biāo)100 ng/mL)于水解后樣品中,加蓋置于漩渦振蕩器振蕩15 min，離心10 min(5 000 r/min),取上清液加入0.1 mol/L高氯酸溶液5 mL，混合均勻，用高氯酸調(diào)節(jié) pH 至 1.0±0.3，以 5 000 r/min 的速度離心 10 min后,將全部上清液置于另一個 50 mL 離心管中，用10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH 至 11.0±0.1,加入10 mL飽和氯化鈉溶液和10 mL異丙醇-乙酸乙酯(6+4)混合溶液,充分提取，在 5 000 r/min 下離心10 min,轉(zhuǎn)移全部有機(jī)相，在40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈蒣9]。

將 PCX柱連接到真空過柱裝置。將上述殘渣溶液上柱,依次用 2 mL水、2 mL 2%甲酸水溶液和 2 mL甲醇洗滌柱子并徹底抽干,最后用 2 mL的 5%氨水甲醇溶液洗脫柱子上的待測成分。 洗脫液在 40 ℃ 水浴下氮?dú)獯蹈蒣9]。準(zhǔn)確加入1.00 mL 0.1%甲酸/水-甲醇溶液 (95+5),超聲混勻。過濾，供UPLC-MS/MS檢測。

1.4 UPLC-MS/MS條件

1.4.1液相色譜條件。色譜柱為Waters BEH-C18柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm); 流動相為含0.1%甲酸的水溶液(A),甲醇(B); 梯度洗脫程序見表1，流速為0.3 mL/min;進(jìn)樣量3 μL;柱溫為30 ℃。

1.4.2質(zhì)譜條件。離子源為ESI電噴霧離子源,正離子模式；毛細(xì)管電壓3.5 kV; 錐孔電壓30.0 V；去溶劑溫度500 ℃；去溶劑氣流1 000 L/h；錐孔氣流20 L/h；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描模式。監(jiān)測離子、碰撞能量等見表2～3。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的選擇由于利巴韋林以原藥、利巴韋林單磷酸酯、利巴韋林二磷酸酯和利巴韋林三磷酸酯等形式存在,所以必須對體內(nèi)磷酸酯化的利巴韋林進(jìn)行酶解才能對利巴韋林總量進(jìn)行測定[10-11]。而受體激動劑也是要進(jìn)行酶解才能對克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺總量進(jìn)行測定，所以該研究采用GB/T 22286—2008方法和SN/T 4519—2016方法對陽性肌肉樣本進(jìn)行酶解，對比酸性磷酸酯酶和β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶酶解后的利巴韋林、9種受體激動劑的總量。結(jié)果表明,按照GB/T 22286—2008方法用β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶酶解 12 h 后的利巴韋林含量比SN/T 4519—2016方法酸性磷酸酯酶酶解測得利巴韋林的量增加了 10%，9種受體激動劑的總量也比酸性磷酸酯酶酶解測得的量高6%。所以該研究選擇β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶37 ℃水浴12 h作為酶解條件。

2.2 固相萃取柱的選擇固相萃取法一直是降低基質(zhì)干擾、富集目標(biāo)物和提高檢測靈敏度最好的凈化方法。該研究嘗試了 MCX、PBA、PCX 等固相萃取小柱,發(fā)現(xiàn)MCX小柱對利巴韋林、受體激動劑的重復(fù)性較差,PCX 小柱的回收率較PBA小柱的優(yōu)勢較為明顯,使得利巴韋林和9種受體激動劑都能得到較好的保留。

2.3 定量方法的選擇一是按照國家標(biāo)準(zhǔn)的要求[9，12]，利巴韋林和受體激動劑都按照內(nèi)標(biāo)法來定量；二是經(jīng)比較,采用內(nèi)標(biāo)法分析得到的利巴韋林和9種受體激動劑回收率在90%以上,比外標(biāo)法計算得到的回收率高。故該研究采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行分析計算。但同位素內(nèi)標(biāo)量少且貴，大批量樣品篩查時成本較高，建議陽性樣品再用內(nèi)標(biāo)法定量。

2.4 色譜柱的選擇該研究時間有點(diǎn)短只是對Waters BEH-C18柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)和ACQUITY UPLC?HSS T3 (150 mm×2.1 mm,1.8 μm)色譜柱進(jìn)行了比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Waters BEH-C18柱能將利巴韋林與內(nèi)源性化合物較好分離，且9種受體激動劑也能較好分離，BEH-C18柱應(yīng)用廣泛，可以檢測多種農(nóng)藥獸藥，方便檢測人員在同一根色譜柱下完成多種檢測任務(wù)，故選擇Waters BEH-C18柱。

2.5 流動相的選擇液相色譜流動相常用的有機(jī)溶劑有甲醇和乙腈，試驗發(fā)現(xiàn),當(dāng)定容液中有甲醇、流動相中有乙腈時，目標(biāo)物色譜峰峰形變寬，影響分離度，將乙腈改成甲醇后，目標(biāo)物色譜峰峰形較好，再比較乙腈、甲醇的毒性、價格、提取率后，建議從提取到流動相都選用甲醇。當(dāng)流動相中加入0.1%甲酸時可以增加利巴韋林和9種受體激動劑的信號響應(yīng),加入乙酸銨時,可以改善色譜峰形[7]，但每次檢測完后需要大量純水清洗色譜柱、泵，清洗不干凈會腐蝕儀器零件，降低柱效，考慮到樣品量、分析時間、色譜柱柱效、儀器耐受等因素,該研究采用甲醇-含0.1%甲酸的水溶液作為流動相。

2.6 質(zhì)譜條件的選擇該研究采用ESI離子源進(jìn)行分析。將 1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液在正離子模式下進(jìn)行母離子掃描,確定利巴韋林和9種受體激動劑的母離子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利巴韋林有m/z245、m/z267這2個母離子，雖然m/z245 響應(yīng)較小,但其為加氫峰且較為穩(wěn)定,故選擇其作為母離子;然后對其子離子進(jìn)行全掃描,其碎片離子主要為m/z113.0、m/z95.9、m/z132.9。m/z113.0 響應(yīng)較高,可作為定量離子。經(jīng)優(yōu)化碰撞能量參數(shù),得到了最佳質(zhì)譜條件,質(zhì)譜檢測參數(shù)見表2。受體激動劑按照國標(biāo)方法找到其母離子及子離子,見表3。

表2 利巴韋林定性定量離子對、錐孔電壓、碰撞能量Table 2 Qualitative and quantitative ion pairs,cone voltage,collision energy of ribavirin

表3 9種受體激動劑的定性離子對、定量離子對、錐孔電壓、碰撞能量Table 3 Qualitative ion pair,quantitative ion pair,cone hole voltage,capillary voltage of 9 receptor agonists

2.7 基質(zhì)影響根據(jù)市場監(jiān)測需求，采集市場的豬肉和雞肉作為基質(zhì),按該方法進(jìn)行測定。選擇其中不含利巴韋林、9種受體激動劑的豬肉和雞肉作為基質(zhì)空白,分別添加定量濃度水平的利巴韋林、9種受體激動劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，與相應(yīng)無基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行比較。結(jié)果表明，樣品基質(zhì)不會干擾目標(biāo)化合物的測定,用內(nèi)標(biāo)法定量更能消除不同因素對結(jié)果的影響。質(zhì)譜圖見圖1～2。

2.8 線性范圍以目標(biāo)物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)、目標(biāo)物的濃度為橫坐標(biāo)繪制各目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。利巴韋林按照濃度為2、5、10、30、50、100、200 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣,結(jié)果表明,利巴韋林濃度在 1～100 μg/kg 呈良好的線性關(guān)系(R2>0.999)。9種受體激動劑按照濃度為 0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣,結(jié)果表明,在0.25～50.00 μg/kg呈良好的線性關(guān)系(R2>0.999)。具體見表4。

2.9 回收率在空白豬肉及雞肉樣品中,添加利巴韋林和克侖特羅、妥布特羅、沙丁胺醇、噴布特羅、萊克多巴胺、西馬特羅、氯丙那林、非諾特羅、特布他林定量檢出限的1倍、3倍、10倍3個水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗。按該研究中前處理方法測定。每個濃度平行測定6個樣品。結(jié)果表明(表5)，10種目標(biāo)物的回收率為84.6%～108.0%,RSD為1.6%～5.2%,滿足食品理化檢測中的質(zhì)控要求[13]。

2.10 方法應(yīng)用應(yīng)用該研究中的方法測定了全疆14個地州市市場上在售的約700個主要樣本(牛肉、豬肉、羊肉、豬肝、雞肉)中利巴韋林和9種受體激動劑殘留量,結(jié)果表明(表6)，個別豬肉中檢出利巴韋林、克倫特羅，牛肉中檢出克倫特羅，其他畜禽肉未發(fā)現(xiàn)非法使用10種藥物的現(xiàn)象。

圖1 利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品定量離子(a)和定性離子(b)質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrum of quantitative ion (a) and qualitative ion (b) of ribavirin standard

圖2 9種受體激動劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定量離子、定性離子質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrum of quantitative ion and qualitative ion of nine receptor agonist reference materials

表4 利巴韋林、9種受體激動劑標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Table 4 Standard working curves of ribavirin and 9 receptor agonists

表5 10種目標(biāo)物回收率測試結(jié)果(n=6)Table 5 Recovery rate test results of 10 target substances

3 結(jié)論與討論

該研究建立了利巴韋林與9種β-受體激動劑的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測方法，提高食品檢測人員檢測效率。在樣品前處理中,采用β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶酶解，用高氯酸調(diào)節(jié) pH,沉淀蛋白后離心,上清液用異丙醇-乙酸乙酯提取,經(jīng)固相萃取柱凈化，前處理步驟可以將利巴韋林和9種受體激動劑同時處理。在UPLC-MS/MS上同時檢測這10種目標(biāo)物，且能達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)要求的檢出限(利巴韋林1.00 μg/kg，9種受體激動劑的檢出限均為 0.25 μg/kg)，線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)良好,回收率在84.6%～108.0%,RSD為1.6%～5.2%，滿足食品理化檢測中的質(zhì)控要求[13]。該方法在一次前處理一次上機(jī)檢測的同時，完成了10種藥物的監(jiān)測，節(jié)省檢測成本，提高工作效率，可用于各種畜禽肉中利巴韋林與β-受體激動劑殘留量的定量檢測及風(fēng)險監(jiān)測。

表6 畜禽肉檢出情況Table 6 Detection of livestock and poultry meat