瑤藥長(zhǎng)柄瓜馥木的化學(xué)成分及抗痛風(fēng)作用的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

劉會(huì)珍，陳佳倩，金 晨，劉 毅，舒積成，黃慧蓮

(江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004)

瑤族醫(yī)藥是中華民族醫(yī)藥領(lǐng)域類獨(dú)樹一幟的分支，由“五虎”“九?！薄笆算@”“七十二風(fēng)”等瑤藥構(gòu)成的“老班藥”最具特色?，庒t(yī)認(rèn)為，在104 種經(jīng)典瑤藥中，“鉆類”瑤藥性能強(qiáng)勁、通達(dá)經(jīng)絡(luò)、透利關(guān)節(jié)，對(duì)瘀阻、濕滯有較為顯著的治療作用。瓜馥木屬植物，又名鉆山風(fēng)、鐵鉆，是瑤藥“十八鉆”之一。長(zhǎng)柄瓜馥木Fissistigmaoldhamiivar.longistipitatum.為番荔枝科(Annonaceae)瓜馥木屬Fissistigma Griff.植物，為該屬的一個(gè)變種，主要分布在中國(guó)的廣西、廣東、福建等地區(qū)[1]。該屬植物多被用作民間傳統(tǒng)草藥，用于活血[2]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[3]和其他炎性疾病[4]，目前從該屬中鑒定分離出的化學(xué)成分包括生物堿[5]、黃酮[6]和萜類[7]等，而在現(xiàn)有文獻(xiàn)中，尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)長(zhǎng)柄瓜馥木的化學(xué)成分進(jìn)行過(guò)研究。因此，為促進(jìn)瑤藥資源合理開發(fā)利用，本文對(duì)長(zhǎng)柄瓜馥木干燥根莖的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，分離得到18個(gè)化合物，分別鑒定為鵝掌楸堿(1)、氧代克列班寧(2)，oxobuxifolina(3)，觀音蓮明堿(4)，O-甲基芒籽堿(5)，芒籽香堿(6)，4,5-Dioxodehydroasimilobine(7)，缺碳金線吊烏龜二酮B(8)，胡椒內(nèi)酰胺 A(9)，胡椒內(nèi)酰胺 C(10)，馬兜鈴內(nèi)酰胺 AIa(11)，馬兜鈴內(nèi)酰胺 Allla(12)，goniothalactam(13)，goniopedaline(14)，馬兜鈴內(nèi)酰胺 BⅢ(15)，5,6,7,8-四甲氧基黃酮(16)，5,8-二羥基-6,7-二甲氧基黃酮(17)，Methylpedicin(18)。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，化合物3、18為首次從瓜馥木屬植物中分離得到，其余化合物均首次從長(zhǎng)柄瓜馥木中分離得到。

1 儀器與材料

EYELA-RE-2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化 EYELA 公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(邦西儀器科技(上海)有限公司)；DLSB-5/20低溫冷卻液循環(huán)泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；高效液相色譜儀AGILENT 1260(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；BT25S 電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)；電子天平(上海花潮電器有限公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水真空泵(鄭州長(zhǎng)城儀器廠)；色譜柱(YMC-Pack ODS-A 250*4.6 mmL.D.,5 μm,12 nm)；色譜柱(YMC-Pack ODS-A 250*10mmL.D.,5 μm,12 nm)(YMC股份有限公司)；ZF-20D暗箱式紫外分析儀(上海光豪分析儀器有限公司)；BS-100A自動(dòng)部份收集器(上海滬西分析儀器廠有限公司)；Triple TOF 5600 串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國(guó)SCIEX公司)；BRUKER AM-400M 核磁共振儀(瑞士 BRUKER 公司)；BRUKER AM-600M 核磁共振儀(瑞士 BRUKER 公司)；C18反相填料購(gòu)自YMC公司；柱層析硅膠(青島海洋化工廠，200-300目,中國(guó))；薄層層析硅膠板(煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司，中國(guó))；Sephadex LH-20 凝膠(Pharmacia 公司)；常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

長(zhǎng)柄瓜馥木于2018年10月采自廣東省河源市連平縣，由江西中醫(yī)藥大學(xué)胡福生老師鑒定為瓜馥木屬長(zhǎng)柄瓜馥木Fissistigmaoldhamiivar.longistipitatum，樣本(20181009)存放于江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

2 提取分離

取長(zhǎng)柄瓜馥木干燥根莖10.5 kg，用95%乙醇加熱回流提取3次，每次3 h，合并提取液，減壓濃縮至無(wú)醇味，得到總浸膏約650 g。用適量蒸餾水將所得浸膏分散均勻，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取至無(wú)色，減壓濃縮得石油醚部位(35 g)、二氯甲烷部位(78 g)、乙酸乙酯部位(75 g)和正丁醇部位(120 g)。二氯甲烷部位經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷/甲醇(100:0→1:1)溶劑梯度洗脫，得到93個(gè)流份。通過(guò)薄層色譜分析，將具有相同主斑點(diǎn)的流份進(jìn)行合并，得到11個(gè)部分(Fr1-Fr11)。

Fr1部位經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚/乙酸乙酯(100:0→1:1)溶劑梯度洗脫，得到12個(gè)流份(Fr1.1-Fr1.12)。Fr1.4部位再次經(jīng)硅膠柱色譜以石油醚/乙酸乙酯(100:1→20:1)溶劑梯度洗脫得到7個(gè)流份(Fr1.4.1-Fr1.4.7)。Fr1.4.4部位通過(guò)制備液相色譜(石油醚：丙酮=7:1)得到化合物18(20 mg)。

Fr3部位經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷/甲醇(100:0→30:1)溶劑梯度洗脫，得到7個(gè)流份(Fr3.1-Fr3.7)。Fr3.3部位再次經(jīng)硅膠柱色譜以二氯甲烷/甲醇(80:1→30:1)溶劑梯度洗脫得到6個(gè)流份(Fr3.3.1-Fr3.3.6)。將Fr3.3.4部位經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠(二氯甲烷:甲醇=1:1)、ODS反相柱(30%→100%甲醇水)純化后得到5個(gè)流份(Fr3.3.4.1-Fr3.3.4.5)。Fr3.3.4.2通過(guò)制備液相色譜(甲醇-水，67:33)得到化合物10(4.1 mg)、化合物16(16 mg)，F(xiàn)r3.3.4.3通過(guò)制備液相色譜(乙腈-水，51:49)得到化合物17(3.1 mg)。將Fr3.3.5部位經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠(二氯甲烷:甲醇=1:1)、ODS反相柱(30%→100%甲醇水)純化后得到6個(gè)流份(Fr3.3.5.1-Fr3.3.5.6)。Fr3.3.5.4通過(guò)制備液相色譜(甲醇-水：57:43)得到化合物1(3.4 mg)。

Fr5部位經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷/甲醇(100:0→20:1)溶劑梯度洗脫，得到9個(gè)流份(Fr5.1-Fr5.9)。Fr5.3部位采用Sephadex LH-20 凝膠(二氯甲烷:甲醇=1:1)柱層析方法得到6個(gè)流份(Fr5.3.1-Fr5.3.6)。Fr5.3.3經(jīng)半制備液相(10%→100%甲醇水)得到10個(gè)流份(Fr5.3.3.1-Fr5.3.3.10)。Fr5.3.3.5部位經(jīng)制備液相色譜(乙腈-水，40:60)得到化合物4(3.8 mg)。Fr5.3.3.7部位經(jīng)制備液相色譜(乙腈-水，45:55)得到化合物5(8.2 mg)、化合物6(2.5 mg)、化合物8(2.7 mg)。

Fr6部位經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷/甲醇(100:0→20:1)溶劑梯度洗脫，得到8個(gè)流份(Fr6.1-Fr6.8)。Fr6.3部位再次經(jīng)硅膠柱色譜以二氯甲烷/甲醇(50:1→25:1)溶劑梯度洗脫得到7個(gè)流份(Fr6.3.1-Fr6.3.7)。將Fr6.3.3部位經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠(二氯甲烷:甲醇=1:1)、ODS反相柱(30%→100%甲醇水)純化后得到5個(gè)流份(Fr6.3.3.1-Fr6.3.3.5)。Fr6.3.3.2通過(guò)制備液相色譜(乙腈-水41:59，)得到化合物7(4.7 mg)。

Fr7部位經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷/甲醇(100:0→15:1)溶劑梯度洗脫，得到6個(gè)流份(Fr7.1-Fr7.6)。Fr7.2部位采用Sephadex LH-20 凝膠(二氯甲烷:甲醇=1:1)柱層析方法得到6個(gè)流份(Fr7.2.1-Fr7.2.6)。Fr7.2.4經(jīng)ODS反相柱(30%→100%甲醇水)純化后得到8個(gè)流份(Fr7.2.4.1-Fr7.2.4.8)。Fr7.2.4.4通過(guò)制備液相色譜(乙腈-水，39：61)得到化合物2(3.1mg)、化合物9(3.3mg)。Fr7.2.4.6通過(guò)制備液相色譜(乙腈-水，43:57)得到化合物3(2.9mg)、化合物12(3.7mg)。

乙酸乙酯部位經(jīng)硅膠進(jìn)行色譜分離，以二氯甲烷/甲醇(100:0→1:1)溶劑梯度洗脫，得到87個(gè)流份。通過(guò)薄層色譜分析，將具有相同主斑點(diǎn)的流份進(jìn)行合并，得到10個(gè)部分(Fr1-Fr10)。

Fr4部位經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷/甲醇(100:0→1:1)溶劑梯度洗脫，得到8個(gè)流份(Fr4.1-Fr4.8)。Fr4.2部位再次經(jīng)硅膠柱色譜以二氯甲烷/甲醇(100:1→10:1)溶劑梯度洗脫得到6個(gè)流份(Fr4.2.1-Fr4.2.6)。將Fr4.2.2部位經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠(二氯甲烷:甲醇=1:1)、ODS反相柱(30%→100%甲醇水)純化后得到6個(gè)流份(Fr4.2.2.1-Fr4.2.2.6)。Fr4.2.2.3通過(guò)制備液相色譜(甲醇-水，46:54)得到化合物11(3.4 mg)、14(4.8 mg)。Fr4.2.2.4通過(guò)制備液相色譜(甲醇-水，56:44)得到化合物13(3.1 mg)。將Fr4.2.4部位經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠(二氯甲烷:甲醇=1:1)、ODS反相柱(30%→100%甲醇水)純化后得到6個(gè)流份(Fr4.2.4.1-Fr4.2.4.6)。Fr4.2.4.3通過(guò)制備液相色譜(乙腈-水，40:60)得到化合物15(5.4 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色無(wú)定形粉末；HR-ESI-MS m/z：276.0652[M+H]+(計(jì)算值275.2582，C17H9NO3)，提示其分子式為C17H9NO3。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：8.82(1H，d，J= 5.0 Hz，H-5)，8.65(1H，d，J=8.1 Hz，H-11)，8.37(1H，d，J=7.8 Hz，H-8)，8.05(1H，d，J= 5.0 Hz，H-4)，7.90(1H，t，J= 7.1 Hz，H-10)，7.67(1H，t，J= 7.7 Hz，H-9)，7.57(1H，s，H-3)，6.51(2H，s，OCH2O)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：149.1(C-1)，106.6(C-1a)，123.1(C-1b)，152.2(C-2)，103.8(C-3)，135.9(C-3a)，125.1(C-4)，144.8(C-5)，144.9(C-6a)，181.7(C-7)，131.2(C-7a)，128.3(C-8)，129.1(C-9)，134.7(C-10)，127.5(C-11)，133.0(C-11a)，103.8(OCH2O)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]對(duì)比，鑒定化合物1為鵝掌楸堿(liriodenine)。

化合物2：黃色無(wú)定形粉末；HR-ESI-MS m/z：336.0864[M+H]+(計(jì)算值335.3102，C19H13NO5)，提示其分子式為C19H13NO5。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：8.77(1H，d，J= 5.1 Hz，H-5)，8.46(1H，d，J=8.9 Hz，，H-11)，7.62(1H，d，J=8.9 Hz，H-10)，7.99(1H，d，J= 5.2 Hz，H-4)，7.51(1H，s，H-3)，6.48(2H，s，OCH2O)，3.94(3H，s，8-OCH3)，3.86(3H，s，9-OCH3)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：153.3(C-1)，106.9(C-1a)，121.4(C-1b)，151.7(C-2)，102.2(C-3)，126.0(C-3a)，118.1(C-4)，144.2(C-5)，150.0(C-6a)，180.8(C-7)，135.1(C-7a)，146.9(C-8)，145.6(C-9)，123.5(C-10)，123.9(C-11)，125.4(C-11a)，102.9(OCH2O)，60.6(8-OCH3)，56.1(9-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]對(duì)比，鑒定化合物2為氧代克列班寧(oxocrebanine)。

化合物3：黃色無(wú)定形粉末；HR-ESI-MS m/z：336.0817[M+H]+(計(jì)算值335.3102，C19H13NO5)，提示其分子式為C19H13NO5。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：8.85(1H，d，J= 5.2 Hz，H-5)，8.46(1H，d，J= 8.9 Hz，H-11)，8.16(1H，d，J= 5.2 Hz，H-4)，7.76(1H，d，J= 2.9 Hz，H-8)，7.44(1H，dd，J= 2.9，8.9 Hz，H-10)，6.44(2H，s，OCH2O)，4.21(3H，s，3-OCH3)，4.21(3H，s，9-OCH3)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：149.3(C-1)，125.4(C-1a)，121.6(C-1b)，137.6(C-2)，134.9(C-3)，130.2(C-3a)，119.0(C-4)，144.1(C-5)，146.1(C-6a)，180.9(C-7)，126.1(C-7a)，109.8(C-8)，158.6(C-9)，122.2(C-10)，128.3(C-11)，131.7(C-11a)，103.3(OCH2O)，60.3(3-OCH3)，55.5(9-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]對(duì)比，鑒定化合物3為oxobuxifolina。

化合物4：黃色油狀物；HR-ESI-MS m/z：292.096 2[M+H]+(計(jì)算值291.3007，C18H13NO3)，提示其分子式為C18H13NO3。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：9.16(1H，d，J= 8.3 Hz，H-11)，8.88(1H，d，J= 5.2 Hz，H-5)，8.39(1H，d，J= 7.9 Hz，H-8)，8.12(1H，d，J= 5.1 Hz，H-4)，7.91(1H，dd，J=8.5，7.5 Hz，H-10)，7.73(1H，s，H-3)，7.68(1H，dd，J=7.5，7.0 Hz，H-9)，4.08(3H，s，1-OCH3)，4.00(3H，s，2-OCH3)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：145.1(C-1)，118.6(C-1a)，121.8(C-1b)，152.7(C-2)，108.4(C-3)，135.8(C-3a)，124.6(C-4)，145.0(C-5)，157.1(C-6a)，182.0(C-7)，131.9(C-7a)，128.5(C-8)，128.7(C-9)，135.0(C-10)，129.4(C-11)，134.3(C-11a)，61.0(1-OCH3)，57.0(2-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[11]對(duì)比，鑒定化合物4為觀音蓮明堿(lysicamine)。

化合物5：黃色無(wú)定形粉末；HR-ESI-MS m/z：322.1070[M+H]+(計(jì)算值321.3267，C19H15NO4)，提示其分子式為C19H15NO4。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：9.09(1H，d，J= 7.9 Hz，H-11)，8.94(1H，d，J= 4.0 Hz，H-5)，8.36(1H，d，J= 7.3 Hz，H-8)，8.28(1H，d，J= 4.0 Hz，H-4)，7.88(1H，t，J= 7.3 Hz，H-9)，7.64(1H，t，J= 7.0 Hz，H-10)，4.14(3H，s，2-OCH3)，4.06(6H，s，1，3-OCH3)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：148.6(C-1)，114.8(C-1a)，122.5(C-1b)，147.5(C-2)，156.9(C-3)，130.8(C-3a)，119.6(C-4)，144.9(C-5)，145.1(C-6a)，181.8(C-7)，131.4(C-7a)，128.4(C-8)，128.8(C-9)，134.4(C-10)，128.0(C-11)，135.1(C-11a)，61.5(1-OCH3)，62.3(2-OCH3)，61.8(3-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[12]對(duì)比，鑒定化合物5為O-甲基芒籽堿(O-methylmoscatoline)。

化合物6：紅色無(wú)定形粉末；HR-ESI-MS m/z：338.1029[M+H]+(計(jì)算值337.3261，C19H15NO5)，提示其分子式為C19H15NO5。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：8.84(1H，d，J= 5.2 Hz，H-5)，8.72(1H，s，H-11)，8.07(1H，d，J= 5.3 Hz，H-4)，7.74(1H，s，H-8)，7.64(1H，s，H-3)，4.07(3H，s，10-OCH3)，4.02(3H，s，2-OCH3)，4.00(3H，s，1-OCH3)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：150.5(C-1)，118.7(C-1a)，120.9(C-1b)，156.4(C-2)，106.8(C-3)，135.1(C-3a)，123.8(C-4)，144.4(C-5)，144.8(C-6a)，180.2(C-7)，126.4(C-7a)，113.3(C-8)，147.4(C-9)，152.8(C-10)，110.6(C-11)，127.1(C-11a)，55.6(1-OCH3)，60.2(2-OCH3)，56.4(10-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[13]對(duì)比，鑒定化合物6為芒籽香堿(atheroline)。

化合物7：黃色無(wú)定形粉末；HR-ESI-MS m/z：294.0765[M+H]+(計(jì)算值293.2735，C17H11NO4)，提示其分子式為C17H11NO4。1H-NMR(400 MHz，C5D5N)δ：9.83(1H，m，H-11)，8.62(1H，s，H-3)，7.99(1H，m，H-8)，7.73(1H，s，H-7)，7.69(2H，m，H-9，10)，4.17(3H，s，1-OCH3)；13C-NMR(100 MHz，C5D5N)δ：154.1(C-1)，152.8(C-2)，118.4(C-3)，126.4(C-3a)，178.3(C-4)，157.0(C-5)，131.8(C-6a)，112.4(C-7)，133.6(C-7a)，128.9(C-8)，128.2(C-9)，127.0(C-10)，128.1(C-11)，127.2(C-11a)，125.3(C-11b)，118.4(C-11c)，59.9(1-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]對(duì)比，鑒定化合物7為4,5-Dioxodehydroasimilobine。

化合物8：黃色粉末；HR-ESI-MS m/z：308.312 4[M+H]+(計(jì)算值307.3001，C18H13NO4)，提示其分子式為C18H13NO4。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.11(1H，s，-NH)，9.47(1H，m，H-11)，8.19(1H，s，H-3)，7.96(1H，m，H-8)，7.70(2H，m，H-9，10)，7.56(1H，s，H-7)，4.11(3H，s，2-OCH3)，4.07(3H，s，1-OCH3)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：152.9(C-1)，155.7(C-2)，112.7(C-3)，127.4(C-3a)，177.1(C-4)，154.1(C-5)，132.6(C-6a)，113.1(C-7)，128.3(C-7a)，130.3(C-8)，127.2(C-9)，124.8(C-10)，128.7(C-11)，123.8(C-11a)，126.1(C-11b)，118.4(C-11c)，60.3(1-OCH3)，56.6(2-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[15]對(duì)比，鑒定化合物8為缺碳金線吊烏龜二酮B(Norcepharadione B)。

化合物9：黃色無(wú)定形粉末；HR-ESI-MS m/z：266.0811[M+H]+(計(jì)算值265.2634，C16H11NO3)，提示其分子式為C16H11NO3。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：9.28(1H，m，H-5)，7.82(1H，m，H-8)，7.71(1H，s，H-2)，7.52(1H，m，H-6)，7.50(1H，m，H-7)，7.10(1H，s，H-9)，4.07(3H，s，3-OCH3)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：172.3(C-1)，116.0(C-1a)，108.9(C-2)，149.6(C-3)，151.6(C-4)，116.9(C-4a)，128.8(C-4b)，129.2(C-5)，126.4(C-6)，127.7(C-7)，129.9(C-8)，135.7(C-8a)，107.3(C-9)，135.8(C-10)，126.2(C-10a)，57.7(3-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[16]對(duì)比，鑒定化合物9為胡椒內(nèi)酰胺A(piperolactam A)。

化合物10：淡黃色無(wú)定形粉末；HR-ESI-MS m/z：310.1076[M+H]+(計(jì)算值309.3160，C18H15NO4)，提示其分子式為C18H15NO4。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：9.09(1H，m，H-5)，7.97(1H，m，H-8)，7.56(2H，m，H-6，7)，7.26(1H，s，H-9)，4.38(3H，s，2-OCH3)，4.11(3H，s，3-OCH3)，3.91(3H，s，4-OCH3)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：166.2(C-1)，109.6(C-1a)，156.2(C-2)，153.4(C-3)，146.1(C-4)，115.5(C-4a)，126.0(C-4b)，125.5(C-5)，125.1(C-6)，126.6(C-7)，128.9(C-8)，133.4(C-8a)，105.3(C-9)，134.3(C-10)，125.1(C-10a)，62.6(2-OCH3)，61.5(3-OCH3)，60.8(4-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[17]對(duì)比，鑒定化合物10為胡椒內(nèi)酰胺C(piperolactam C)。

化合物11：黃色粉末；HR-ESI-MS m/z：282.075 7[M+H]+(計(jì)算值281.2628，C16H11NO4)，提示其分子式為C16H11NO4。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：8.62(1H，d，J=8.3 Hz，H-5)，7.60(1H，s，H-2)，7.37(1H，s，H-9)，7.35(1H，t，J=8.1 Hz，H-6)，7.07(1H，d，J=7.6 Hz，H-7)，3.98(3H，s，4-OCH3)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：168.3(C-1)，120.5(C-1a)，113.3(C-2)，152.0(C-3)，148.9(C-4)，121.8(C-4a)，127.1(C-4b)，117.8(C-5)，125.4(C-6)，111.8(C-7)，153.6(C-8)，124.0(C-8a)，97.9(C-9)，134.0(C-10)，122.3(C-10a)，59.4(4-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[18]對(duì)比，鑒定化合物11為馬兜鈴內(nèi)酰胺AIa(aristololactam AIa)。

化合物12：綠色無(wú)定形粉末；HR-ESI-MS m/z：282.0735[M+H]+(計(jì)算值281.2628，C16H11NO4)，提示其分子式為C16H11NO4。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：8.56(1H，d，J=2.4 Hz，H-5)，7.77(1H，d，J=8.7 Hz，H-8)，7.59(1H，s，H-2)，7.09(1H，dd，J=2.5，8.6 Hz，H-7)，6.99(1H，s，H-9)，4.01(3H，s，4-OCH3)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：168.2(C-1)，121.8(C-1a)，113.2(C-2)，151.7(C-3)，148.8(C-4)，120.0(C-4a)，127.3(C-4b)，111.7(C-5)，155.2(C-6)，116.9(C-7)，129.9(C-8)，127.6(C-8a)，104.1(C-9)，132.5(C-10)，122.5(C-10a)，59.4(4-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[18]對(duì)比，鑒定化合物12為馬兜鈴內(nèi)酰胺Allla(Aristololactam Allla)。

化合物13：黃色粉末，HR-ESI-MS m/z：296.092 1[M+H]+(計(jì)算值295.2894，C17H13NO4)，提示其分子式為C17H13NO4。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：:10.75(1H，s，NH)，8.58(1H，d，J=2.4 Hz，H-5)，7.83(1H，s，H-2)，7.79(1H，d，J=8.7 Hz，H-8)，7.12(1H，dd，J=2.4，8.6 Hz，H-7)，7.06(1H，s，H-9)，4.04(3H，s，3-OCH3)，4.03(3H，s，4-OCH3)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：168.2(C-1)，121.5(C-1a)，109.7(C-2)，150.5(C-3)，153.8(C-4)，119.6(C-4a)，127.3(C-4b)，111.9(C-5)，155.4(C-6)，117.1(C-7)，130.1(C-8)，127.5(C-8a)，105.0(C-9)，132.2(C-10)，123.5(C-10a)，56.9(3-OCH3)，59.9(4-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[19]對(duì)比，鑒定化合物13為goniothalactam。

化合物14：黃色粉末；HR-ESI-MS m/z：296.082 5[M+H]+(計(jì)算值295.2894，C17H13NO4)，提示其分子式為C17H13NO4。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：10.90(1H，s，NH)，9.52(1H，s，OH)，9.12(1H，d，J=5.4，H-5)，7.96(1H，d，J=5.4，H-8)，7.55(2H，m，H-6，7)，7.17(1H，s，H-9)，4.36(3H，s，2-OCH3)，4.04(3H，s，4-OCH3)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：166.6(C-1)，109.2(C-1a)，148.5(C-2)，143.8(C-3)，149.5(C-4)，133.6(C-4a)，115.7(C-4b)，126.3(C-5)，125.6(C-6)，125.9(C-7)，128.7(C-8)，125.0(C-8a)，103.7(C-9)，134.7(C-10)，121.4(C-10a)，62.3(2-OCH3)，59.5(4-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[20]對(duì)比，鑒定化合物14為goniopedaline。

化合物15：淡黃色無(wú)定形粉末；HR-ESI-MS m/z：310.1064[M+H]+(計(jì)算值309.3160，C18H15NO4)，提示其分子式為C18H15NO4。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：8.67(1H，d，J=2.6 Hz，H-5)，7.91(1H，d，J=8.8 Hz，H-8)，7.86(1H，s，H-2)，7.28(1H，dd，J=2.7，8.8 Hz，H-7)，7.11(1H，s，H-9)，4.06(3H，s，3-OCH3)，4.05(3H，s，4-OCH3)，3.93(3H，s，6-OCH3)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：168.2(C-1)，119.6(C-1a)，109.5(C-2)，153.9(C-3)，150.4(C-4)，121.6(C-4a)，127.1(C-4b)，110.1(C-5)，157.0(C-6)，116.2(C-7)，130.1(C-8)，128.8(C-8a)，104.6(C-9)，133.1(C-10)，123.5(C-10a)，57.0(3-OCH3)，59.9(4-OCH3)，55.1(6-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[18]對(duì)比，鑒定化合物15為馬兜鈴內(nèi)酰胺BⅢ(Aristololactam BⅢ)。

化合物16：黃色無(wú)定形粉末；HR-ESI-MS m/z：343.1192[M+H]+(計(jì)算值342.3462，C19H18O6)，提示其分子式為C19H18O6。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：8.06(2H，m，H-2′，6′)，7.62(3H，m，H-3′，4′，5′)，6.87(1H，s，H-3)，4.04(3H，s，7-OCH3)，3.98(3H，s，8-OCH3)，3.85(3H，s，6-OCH3)，3.80(3H，s，5-OCH3)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：160.2(C-2)，107.5(C-3)，175.8(C-4)，147.2(C-5)，143.6(C-6)，151.1(C-7)，137.8(C-8)，147.5(C-9)，114.4(C-10)，131.6(C-1′)，125.9(C-2′)，129.2(C-3′)，131.0(C-4′)，129.2(C-5′)，125.9(C-6′)，61.9(5-OCH3)，61.9(6-OCH3)，61.5(7-OCH3)，61.4(8-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[21]對(duì)比，鑒定化合物16為5,6,7,8-四甲氧基黃酮。

化合物17：黃色無(wú)定形粉末；HR-ESI-MS m/z：315.0864[M+H]+(計(jì)算值314.2895，C17H14O6)，提示其分子式為C17H14O6。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：8.17(2H，m，H-2′，6′)，7.64(3H，m，H-3′，4′，5′)，7.03(1H，s，H-3)，3.95(3H，s，6-OCH3)，3.83(3H，s，7-OCH3)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：164.1(C-2)，105.1(C-3)，183.5(C-4)，145.1(C-5)，136.8(C-6)，148.7(C-7)，131.2(C-8)，142.0(C-9)，107.1(C-10)，131.2(C-1′)，127.1(C-2′)，129.6(C-3′)，132.7(C-4′)，129.6(C-5′)，127.1(C-6′)，61.6(6-OCH3)，61.0(7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)[22]對(duì)比，鑒定化合物17為5,8-二羥基-6,7-二甲氧基黃酮。

化合物18：黃色油狀物；HR-ESI-MS m/z：345.133 5 [M+H]+(計(jì)算值344.3585，C19H20O6)，提示其分子式為C19H20O6。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.95(1H，s，H-α)，7.86(1H，s，H-β)，7.66(2H，m，H-2，6)，7.44(3H，m，H-3，4，5)，4.10(3H，s，-OCH3)，3.89(6H，s，-OCH3)，3.87(3H，s，-OCH3)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ：135.2(C-1)，129.0(C-2)，128.5(C-3)，130.5(C-4)，128.5(C-5)，129.0(C-6)，126.5(C-α)，143.8(C-β)，111.0(C-1′)，151.0(C-2′)，128.5(C-3′)，138.5(C-4′)，137.2(C-5′)，155.1(C-6′)，193.8(C=O)，62.2，61.6，61.4，61.1(-OCH3×4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]對(duì)比，鑒定化合物18為Methylpedicin。

4 化學(xué)成分抗痛風(fēng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

4.1 軟件與方法

4.1.1 活性成分靶點(diǎn)篩選

通過(guò)SwissADME數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swissadme.ch/)檢索得到上述18個(gè)化合物的SMILES號(hào)，利用Swiss TargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)、SEA(http://sea.bkslab.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取化合物潛在的作用靶點(diǎn)，并限定物種來(lái)源為人[24]。

4.1.2 疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

以“gout”作為檢索詞，通過(guò)Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)( https://www.genecards.org/)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)(https://db/idrblab/et/ttd/)檢索得到痛風(fēng)疾病的相關(guān)作用靶點(diǎn)[25]。通過(guò) UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www/uniprot/org/)校正其蛋白名稱為官方名稱，并限定物種來(lái)源為人。將上述活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)與疾病的相關(guān)靶點(diǎn)取交集，獲得長(zhǎng)柄瓜馥木治療痛風(fēng)疾病的共同作用靶點(diǎn)[26]。

表1 從長(zhǎng)柄瓜馥木分離鑒定所得化合物Table.1 Compounds isolated and identified from Fissistigma oldhamii var.longistipitatum

4.1.3 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選得到的共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING11.0(https://string-db.org/)，生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，最低作用閾值設(shè)置為0.400，其他參數(shù)則保留默認(rèn)設(shè)置，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析，根據(jù)靶點(diǎn)在PPI網(wǎng)絡(luò)中的度值(degree)找出關(guān)鍵靶點(diǎn)，度值越大代表其在 PPI網(wǎng)絡(luò)中越重要[27]。

4.1.4 GO和KEGG富集分析

將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID6.7(https://david.ncifcrf.gov/)，選擇生物過(guò)程( biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細(xì)胞學(xué)組分(cellular component，CC)進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)分析；選擇KEGG進(jìn)行靶點(diǎn)基因通路富集分析，篩選得到長(zhǎng)柄瓜馥木治療痛風(fēng)的主要信號(hào)通路[28]。

4.1.5 活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將長(zhǎng)柄瓜馥木化學(xué)成分、KEGG富集分析的主要通路及對(duì)應(yīng)的蛋白靶點(diǎn)，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中對(duì)其進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)[29]。

4.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果

4.2.1 藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

通過(guò)SwissADME和SEA數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)化合物相關(guān)靶點(diǎn)，刪除重復(fù)值，得到化合物潛在作用靶點(diǎn)553；通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到痛風(fēng)疾病相關(guān)靶點(diǎn)717個(gè)。將化合物潛在的作用靶點(diǎn)與疾病的相關(guān)靶點(diǎn)通過(guò)VENNY2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)取交集獲得長(zhǎng)柄瓜馥木治療痛風(fēng)的潛在作用靶點(diǎn)113個(gè)，見圖1。

4.2.2 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)STRING10數(shù)據(jù)庫(kù)，將篩選出的113個(gè)交集靶點(diǎn)輸入，利用Cytoscape 3.7.2設(shè)置節(jié)點(diǎn)的大小隨degree大小變化，構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。該網(wǎng)絡(luò)包含111個(gè)節(jié)點(diǎn)，1133條相互作用連線，平均度值(degree)為20，根據(jù)degree值篩選出degree值靠前的18個(gè)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，其中排名靠前的GAPDH、IL6、VEGFA、MAPK1、SRC、PTGS2、MMP9、TLR4、EGFR等可能為長(zhǎng)柄瓜馥木抗痛風(fēng)作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，關(guān)鍵靶點(diǎn)及其拓?fù)鋮?shù)見表2。

圖1 痛風(fēng)疾病靶點(diǎn)與長(zhǎng)柄瓜馥木化學(xué)成分靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venn diagram of gout disease targets and Fissistigma oldhamii var.longistipitatum targets

圖2 交集靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network diagram of common target

表2 核心靶點(diǎn)拓?fù)鋮?shù)Tab.2 Core targets and topological parameters

4.2.3 GO生物功能與KEGG通路富集分析

采用DAVID 6.7數(shù)據(jù)庫(kù)將113個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行生物功能分析與通路富集分析。根據(jù)P<0.05，進(jìn)行篩選得到245個(gè)生物過(guò)程，34個(gè)細(xì)胞學(xué)組分，49個(gè)分子功能。其中生物過(guò)程分析結(jié)果顯示，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡過(guò)程負(fù)調(diào)控等生物過(guò)程在長(zhǎng)柄瓜馥木治療痛風(fēng)疾病的過(guò)程中發(fā)揮重要作用；細(xì)胞組分分析結(jié)果顯示，其主要存在于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞核質(zhì)中；分子功能分析結(jié)果顯示，其主要與蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合、細(xì)胞因子活性有關(guān)，見圖3。

圖3 GO富集分析Fig.3 Analysis diagram of GO enrichment

通過(guò)KEGG富集分析得到信號(hào)通路，根據(jù)P<0.05，篩選出56條通路，其中主要涉及免疫及炎癥有關(guān)通路，主要包括TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等，見圖4。

圖4 KEGG通路富集分析Fig.4 Enrichment analysis diagram of KEGG

4.2.4 活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物、活性成分、潛在靶點(diǎn)、通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析，見圖5，該網(wǎng)絡(luò)包含146個(gè)節(jié)點(diǎn)，525條相互作用連線。箭頭部分為藥物，即長(zhǎng)柄瓜馥木；三角形部分為18個(gè)活性成分，根據(jù)drgree值篩選出前4的成分為 5,8-二羥基-6,7-二甲氧基黃酮、goniothalactam、5,6,7,8-四甲氧基黃酮、觀音蓮明堿，推測(cè)這些成分為長(zhǎng)柄瓜馥木抗痛風(fēng)作用的關(guān)鍵成分；圓形部分為113個(gè)長(zhǎng)柄瓜馥木治療痛風(fēng)疾病的相關(guān)靶點(diǎn)，根據(jù)drgree值篩選前8的靶點(diǎn)為GAPDH、IL6、VEGFA、MAPK1、SRC、PTGS2、MMP9、TLR4，推測(cè)這些可能為長(zhǎng)柄瓜馥木抗痛風(fēng)作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)；方形部分為富集的14條通路，主要為TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路。

圖5 長(zhǎng)柄瓜馥木“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Network of active ingredient-target-pathway of Fissistigma oldhamii var.longistipitatum

5 結(jié)論

長(zhǎng)柄瓜馥木作為瑤藥，具有通達(dá)經(jīng)絡(luò)、透利關(guān)節(jié)等治療作用，但其化學(xué)成分研究較為薄弱，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究尚不完善。為了促進(jìn)瑤藥資源合理利用與開發(fā)，本研究采用硅膠色譜、Sephadex LH-20凝膠色譜、ODS反向色譜等多種柱色譜以及制備型HPLC等現(xiàn)代分離技術(shù)對(duì)長(zhǎng)柄瓜馥木化學(xué)成分進(jìn)行分離純化，分離得到18個(gè)化合物，其中化合物3，18為首次從瓜馥木屬植物分離得到，并以分離鑒定的18個(gè)單體化合物為研究對(duì)象，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)其治療痛風(fēng)的靶點(diǎn)及信號(hào)通路。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明其分離得到的活性成分5,8-二羥基-6,7-二甲氧基黃酮、goniothalactam、5,6,7,8-四甲氧基黃酮、觀音蓮明堿可能作用于GAPDH、IL6、IL2、ESR1、TLR4、XOD、VEGFA、MAPK1等多個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，調(diào)控TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、NF-κB等多條信號(hào)通路發(fā)揮抗痛風(fēng)作用，表明這些成分可能為長(zhǎng)柄瓜馥木發(fā)揮藥效的直接效應(yīng)物質(zhì)，該研究結(jié)果可為闡明長(zhǎng)柄瓜馥木藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。