調(diào)環(huán)酸鈣對鹽堿脅迫下綠豆苗期生長的調(diào)控作用

侯 雪 陳雨潔 李春苗 方淑梅,2 梁喜龍,2 鄭殿峰,3

（1黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，163319，黑龍江大慶；2黑龍江省植物生長調(diào)節(jié)劑工程技術(shù)研究中心，163319，黑龍江大慶；3廣東海洋大學(xué)，524088，廣東湛江）

隨著人口增加和環(huán)境惡化，土壤鹽堿化已成為日益嚴(yán)重的全球性問題。目前全球約有7%的土地受到鹽堿化威脅，尚無有效措施來控制其傳播[1]。土壤鹽堿化對植物的脅迫效應(yīng)包括鹽脅迫和堿脅迫。根據(jù)含鹽量和pH，鹽堿脅迫的程度可分為輕度（含鹽量小于3‰，pH為7.1～8.5）、中度（含鹽量3‰～6‰，pH 8.5～9.5）和重度（含鹽量超過6‰，pH超過9.5）[2]。中國松嫩平原、澳大利亞維多利亞州和美國加利福尼亞州是世界上3個典型的鹽堿地土壤分布地區(qū)，其中，中國的鹽堿地面積約為1億hm2，東北松嫩平原占373萬hm2，對中國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成一定的不良影響[3]。

綠豆作為我國重要的雜豆類作物之一，因其具有生育周期短（65～90d）、播種范圍廣、抗旱、耐貧瘠和生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)等特性已成為國際市場的高附加值農(nóng)產(chǎn)品[4-6]。同時綠豆具有固氮養(yǎng)地的作用，其不僅可作為間作套種的良好前茬，也成為農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)調(diào)整的重要作物，且可有效提高生態(tài)環(huán)境利用率[7-10]。我國鹽堿土地面積分布廣泛，但目前對提高綠豆耐鹽堿能力的有效栽培技術(shù)研究有限，制約了綠豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展。植物生長調(diào)節(jié)劑已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于提高作物抗逆性、抗倒伏、改善品質(zhì)和促控生長發(fā)育等諸多方面?？梢酝ㄟ^施加生長調(diào)節(jié)劑，使植物向著預(yù)期的方向和程度生長，從而達(dá)到調(diào)控作物生長發(fā)育、提高生態(tài)適應(yīng)能力的作用。

調(diào)環(huán)酸鈣（prohexadione-calcium，Pro-Ca）是一種抑制赤霉素生物合成的新型植物生長調(diào)節(jié)劑，其化學(xué)名稱為3，5-二氧代-4-丙?；h(huán)己烷羧酸鈣，與多效唑及烯效唑等三唑類延緩劑相比，作物殘留傾向低，對環(huán)境無污染，毒理學(xué)和生態(tài)毒理學(xué)特征優(yōu)勢明顯，應(yīng)用前景好，有可能取代三唑類生長延緩劑[11-12]。已有研究[13]表明，外源施加Pro-Ca可減少冷害下番茄果實(shí)的丙二醛（MDA）含量，降低磷脂酶D（PLD）和脂氧合酶（LOX）活性，并增加脯氨酸（Pro）含量來保持細(xì)胞膜的完整性，從而減輕冷害對番茄果實(shí)造成的損傷。暴露于干旱環(huán)境下的禾草經(jīng)過LOX處理后降低了電解質(zhì)滲漏和MDA含量，并顯著提高超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）及過氧化氫酶（CAT）活性，增強(qiáng)植物對干旱的耐受性[14]。Pro-Ca也可減輕鹽分對豆類幼苗的有害影響，研究[15]顯示，Pro-Ca可以通過增加光合色素、總碳水化合物、總可溶性糖、Pro含量和抗氧化酶活性來提高蠶豆幼苗在鹽脅迫下的耐受性。目前，人們對Pro-Ca在植物生長、發(fā)育和脅迫方面有了更加深入的研究，但對鹽堿脅迫下的研究和應(yīng)用還十分有限，尤其是對調(diào)控鹽堿脅迫下的綠豆生理響應(yīng)還鮮見報道。為此，本研究以鹽堿抗性綠豆品種（綠豐2號，幼苗鹽害指數(shù)＜20）和鹽堿敏感性綠豆品種（綠豐5號，60≤幼苗鹽害指數(shù)＜80）為試驗(yàn)材料，探討不同濃度Pro-Ca對綠豆幼苗在鹽堿脅迫下的調(diào)控作用，為深入揭示Pro-Ca抗鹽堿脅迫作用及在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中深入應(yīng)用提供試驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

綠豐2號和綠豐5號均由國家雜糧工程技術(shù)研究中心提供，植物生長調(diào)節(jié)劑調(diào)環(huán)酸鈣（Pro-Ca，5%）由四川國光農(nóng)化股份有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

1.2.1 播種與幼苗培養(yǎng) 選取籽粒飽滿、形狀均一致的綠豆種子，經(jīng)75%乙醇消毒后用無菌水沖洗3次，以蛭石為栽培基質(zhì)在塑料盒（37cm×29cm×11cm）中種植，每盒均播種30粒，出苗后定苗15株。于2019年在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，晝/夜空氣溫度為 23°C～28°C/20°C～25°C，光照強(qiáng)度為18 000lx。播種時每盆加入1.5L蒸餾水，自真葉長出時開始每3d補(bǔ)充1/2 Hoagland營養(yǎng)液0.5L。

1.2.2 鹽堿脅迫處理 當(dāng)幼苗長至復(fù)葉展開期，選取長勢基本一致的綠豆幼苗同時進(jìn)行鹽堿脅迫及調(diào)節(jié)劑處理。其中鹽堿脅迫以模擬典型鹽堿土的實(shí)際情況進(jìn)行，即使用混合鹽堿溶液（NaCl:Na2SO4:NaHCO3:Na2CO3=1:9:9:1，pH=8.5±0.1）濃度為150mmol/L[16]。各處理及對照均透灌1.5L的鹽堿溶液進(jìn)行脅迫處理，處理3d后再補(bǔ)充0.5L鹽堿溶液。

1.2.3 外源Pro-Ca處理 于鹽堿脅迫處理的同時進(jìn)行Pro-Ca調(diào)節(jié)劑處理，分別設(shè)置50、100、150、200mg/L 4個濃度梯度，以蒸餾水為對照（CK），從上向下每盒均勻噴施50mL（葉面形成一層水膜），每個處理均設(shè)置2盒。鹽堿脅迫15d后，各處理均隨機(jī)選取3株，用于生長參數(shù)和相對葉綠素含量（SPAD）的測定，試驗(yàn)設(shè)置4次重復(fù)。以第1片完全展開的復(fù)葉為研究對象，另隨機(jī)選取3株植株葉片混合，取樣后用液氮速凍立即置于-80℃低溫冰箱中保存，用于各項(xiàng)生理指標(biāo)測定，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 生長參數(shù)及生物量 分離地上和地下部分，測量株高、莖粗、地上干重和地下干重，并計算根冠比（R/S），R/S=根干重/地上部干重。

1.3.2 SPAD 以第1片完全展開的復(fù)葉為研究對象，采用便攜式葉綠素儀（日本）測定SPAD。

1.3.3 滲透物質(zhì)含量 取樣后利用蒽酮比色法、磺基水楊酸法和考馬斯亮藍(lán)G-250染色法分別測定可溶性糖、Pro及可溶性蛋白質(zhì)含量。

1.3.4 保護(hù)性酶活性及MDA含量 取樣后分別用氮藍(lán)四唑（NBT）法、愈創(chuàng)木酚法、紫外吸收法和硫代巴比妥酸（TBA）法測定SOD、POD、CAT活性及MDA含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel統(tǒng)計數(shù)據(jù)與繪圖，SPSS 22.0軟件進(jìn)行ANOVA單因素方差分析，Duncan’s進(jìn)行不同處理間的比較檢驗(yàn)，同時使用雙因素方差分析測試噴施Pro-Ca與品種類型對鹽堿脅迫交互作用的主要影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pro-Ca對鹽堿脅迫下綠豆苗期形態(tài)指標(biāo)影響

由表1可知，不同濃度Pro-Ca處理下的綠豐2號株高與CK處理相比分別降低了25.02%、29.64%、32.85%和18.90%，且均與CK處理差異達(dá)顯著水平；而綠豐5號分別較CK處理降低了0.06%、21.72%、0.08%和10.32%，且在100mg/L處理下株高較CK處理降低達(dá)顯著水平。由此可見，Pro-Ca對鹽堿脅迫下綠豆苗期的株高均有不同程度的降低效果。綠豐2號莖粗與CK處理相比無明顯改變，而綠豐5號莖粗則隨Pro-Ca處理濃度的增加呈先增加后降低的趨勢，在100mg/L處理下達(dá)最大值，較CK處理增加了13.33%，說明Pro-Ca對鹽堿脅迫下綠豐5號的莖粗有一定程度的增加效果。Pro-Ca對鹽堿脅迫下苗期綠豆的干物質(zhì)積累量均有不同程度的促進(jìn)作用，綠豐2號和綠豐5號的地上部干重均有不同程度的增加，但各組間與CK處理相比無顯著差異，說明Pro-Ca對鹽堿脅迫下綠豐2號與綠豐5號的地上部干重影響較小。綠豐2號在不同濃度Pro-Ca處理下地下部干重與CK處理相比各組間均呈顯著增加水平，綠豐5號隨Pro-Ca濃度的增加則呈先增加后降低的趨勢，且在100mg/L處理下達(dá)顯著差異水平。根冠比表現(xiàn)為綠豐2號受Pro-Ca影響較大，與CK處理相比分別增加了57.14%、42.86%、28.57%和50.00%，50mg/L處理達(dá)顯著水平。綠豐5號在100mg/L Pro-Ca處理下根冠比雖然增加，但與CK處理相比差異不顯著，說明Pro-Ca可以增加綠豆在鹽堿脅迫下的根冠比，且對綠豐2號影響較為顯著。雙因素分析表明，Pro-Ca對鹽堿脅迫下綠豐2號和綠豐5號的株高、地下部干重和根冠比均有極顯著或顯著的影響，且對綠豐5號莖粗的影響大于綠豐2號。

表1 Pro-Ca對鹽堿脅迫下綠豆苗期形態(tài)指標(biāo)的影響Table 1 Effects of Pro-Ca on plant morphological indexes of mung bean seedlings under salt-alkali stress

2.2 Pro-Ca對鹽堿脅迫下綠豆苗期SPAD的影響

如圖1所示，不同濃度Pro-Ca均一定程度地提高了綠豐2號和綠豐5號SPAD。隨著Pro-Ca濃度的增加，綠豐2號SPAD與CK處理相比分別增加了14.88%、15.77%、14.88%和14.58%，而綠豐5號分別增加了7.86%、18.55%、10.69%和12.58%，且綠豐2號和綠豐5號的SPAD都在100mg/L Pro-Ca處理下達(dá)到峰值，但差異并未達(dá)顯著水平。

圖1 Pro-Ca對鹽堿脅迫下綠豆苗期SPAD的影響Fig.1 Effects of Pro-Ca on SPAD of mung bean seedlings under salt-alkali stress

2.3 Pro-Ca對鹽堿脅迫下綠豆苗期滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

2.3.1 Pro-Ca對可溶性糖含量的影響 由表2可知，綠豐2號和綠豐5號葉片可溶性糖含量隨著Pro-Ca濃度的增加呈先升后降的趨勢，分別在150和100mg/L濃度下葉片可溶性糖含量最高，與其對照相比含量均增加了約2倍，當(dāng)綠豐2號和綠豐5號分別用超過150和100mg/L濃度處理時，葉片可溶性糖含量逐漸降低。說明外源施加Pro-Ca可增加鹽堿脅迫下綠豆苗期可溶性糖含量，從而緩解鹽堿脅迫對綠豆造成的損傷。

2.3.2 Pro-Ca對可溶性蛋白含量的影響 由表2可知，在鹽堿脅迫下，2個綠豆品種在不同濃度Pro-Ca處理下均可增加葉片可溶性蛋白含量。綠豐2號和綠豐5號分別在50和100mg/L的Pro-Ca處理下達(dá)到最大值，與其對照相比分別增加了43.47%和53.83%，隨后逐漸降低。說明在鹽堿脅迫下Pro-Ca對綠豆苗期可溶性蛋白含量調(diào)控的最適濃度分別為50和100mg/L。

2.3.3 Pro-Ca對Pro含量的影響 由表2可知，在鹽堿脅迫下，綠豐2號和綠豐5號葉片的Pro含量隨著Pro-Ca濃度的增加呈先升高后降低的趨勢，且在100和150mg/L處理下Pro含量相對較高，其中，綠豐2號葉片的Pro含量較CK處理分別增加了92.03%和118.89%，綠豐5號葉片的Pro含量較CK處理均增加了187.24%，隨后呈下降趨勢。說明在100和150mg/L處理下，Pro-Ca對Pro的調(diào)節(jié)能力強(qiáng)。雙因素分析表明，不同濃度Pro-Ca對綠豆葉片可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響均達(dá)極顯著差異水平，不同濃度Pro-Ca與不同品種交互作用顯示，除對Pro含量無顯著影響外，對綠豆葉片可溶性糖和可溶性蛋白含量均達(dá)極顯著差異水平。

表2 Pro-Ca對鹽堿脅迫下綠豆苗期滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響Table 2 Effects of Pro-Ca on osmotic adjustment substances in mung bean seedlings under salt-alkali stress

2.4 Pro-Ca對鹽堿脅迫下綠豆苗期抗氧化酶活性的影響

2.4.1 Pro-Ca對SOD活性的影響 從表3可以看出，在鹽堿脅迫下，各處理組綠豆葉片SOD活性均高于CK，并隨著Pro-Ca濃度的增加其活性呈先增加后降低的趨勢，均在100mg/L處理下達(dá)到峰值，與對照相比呈顯著差異水平。綠豐2號和綠豐5號葉片SOD活性較同期CK相比分別增加了16.90%和12.57%，當(dāng)Pro-Ca濃度超過100mg/L時，SOD的活性開始下降。說明鹽堿脅迫下噴施Pro-Ca可提高綠豆葉片的SOD活性，減少綠豆體內(nèi)活性氧自由基對細(xì)胞造成的傷害，且在100mg/L處理下綠豆葉片SOD活性最強(qiáng)，之后隨著濃度的增加SOD活性反而降低。

表3 Pro-Ca對鹽堿脅迫下綠豆苗期SOD，POD和CAT活性的影響Table 3 Effects of Pro-Ca on the SOD,POD and CAT activity of mung bean seedlings under salt-alkali stress

2.4.2 Pro-Ca對POD活性的影響 從表3可以看 出，2個綠豆品種葉片POD活性隨著Pro-Ca濃度的增加呈先升后降的趨勢，且POD活性都在100mg/L處理下顯著高于CK處理并達(dá)到峰值。綠豐2號和綠豐5號葉片的POD活性與CK處理相比分別增加了206.54%和167.09%，當(dāng)Pro-Ca濃度超過100mg/L時POD活性開始下降。說明噴施Pro-Ca可以提高鹽堿脅迫下綠豆葉片的POD活性，從而緩解鹽堿脅迫對綠豆造成的傷害。從總體上來看，100mg/L Pro-Ca處理為最適濃度，且對具有一定耐鹽能力的綠豐2號調(diào)控效果更好。

2.4.3 Pro-Ca對CAT活性的影響 從表3可以看出，2個綠豆品種葉片CAT活性均隨著Pro-Ca濃度的增加呈先上升后降低的趨勢，各處理組綠豆葉片CAT活性均高于CK處理。其中在50、100和150mg/L處理下與CK處理相比達(dá)差異顯著水平，綠豐2號與CK處理相比依次分別增加了8.50%、50.00%和25.71%，綠豐5號分別增加了29.67%、35.17%和16.48%。雙因素分析表明不同濃度Pro-Ca對綠豆葉片SOD、POD和CAT活性的影響均達(dá)極顯著差異水平，但不同濃度Pro-Ca與不同品種交互作用除對CAT影響極顯著外，對SOD和POD活性均無顯著影響。

2.5 Pro-Ca對鹽堿脅迫下綠豆苗期MDA含量的影響

如表4所示，鹽堿脅迫下各處理組綠豆葉片MDA含量均低于CK處理。在100和200mg/L處理下綠豐2號和綠豐5號葉片MDA含量與CK處理相比達(dá)顯著差異水平，且在200mg/L處理下葉片MDA含量均達(dá)到最低，分別比CK處理降低36.07%和17.12%。說明鹽堿脅迫下，外源施加Pro-Ca均可降低綠豆葉片MDA含量，從而降低綠豆膜質(zhì)過氧化程度，增加細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。雙因素分析表明，不同濃度Pro-Ca及不同品種類型對綠豆MDA含量影響達(dá)極顯著差異水平，但交互作用顯示不同濃度Pro-Ca對鹽堿脅迫下綠豐2號和綠豐5號MDA含量無顯著影響。

表4 Pro-Ca對鹽堿脅迫下綠豆苗期MDA含量的影響Table 4 Effects of Pro-Ca on MDA content(mmol/g FW)of mung bean seedlings under salt-alkali stress

3 討論

植物的株高、莖粗、干物質(zhì)積累量及根冠比等生長指標(biāo)是植物耐鹽堿能力最直接的反映和表現(xiàn)。在鹽堿脅迫下，植物的生長指標(biāo)會受到不同程度的抑制，根冠比增加[17-19]。目前，植物生長調(diào)節(jié)劑已被廣泛推廣并應(yīng)用于提高作物的抗性能力方面。本研究發(fā)現(xiàn)，在鹽堿脅迫下，葉面噴施Pro-Ca可在一定程度上降低綠豆株高，促進(jìn)地上部和地下部干物質(zhì)積累，其中，在不同濃度Pro-Ca處理下綠豆的地上部干重雖有不同程度的增加，但不顯著。地下部干重在100mg/L處理下與CK處理相比呈顯著差異水平，說明Pro-Ca對鹽堿脅迫下綠豐2號和綠豐5號的地下部干重影響比地上部更顯著。根冠比增加是植物的一種自我保護(hù)效應(yīng)，有利于植物吸收水分和營養(yǎng)物質(zhì)，降低蒸騰速率和緩解由各種脅迫造成的缺水傷害[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，100mg/L Pro-Ca可增加綠豆根冠比。因此，Pro-Ca有助于緩解鹽堿脅迫對綠豆造成的損傷。

光合作用是植物進(jìn)行正常生命活動最重要的形式之一，而葉綠素含量通常被作為衡量植物葉片光合作用的重要指標(biāo)，鹽脅迫通常會造成植物葉綠素含量下降，減弱光合能力[21]。而應(yīng)用Pro-Ca可以增加植物體內(nèi)葉綠素含量，提高植物光合能力[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，綠豆在Pro-Ca各組處理下均增加了SPAD，且都在100mg/L下達(dá)到峰值，說明外源施加Pro-Ca可以維持鹽堿脅迫下綠豆葉片的SPAD，保證植物進(jìn)行正常的光合作用，增強(qiáng)綠豆對鹽堿脅迫的抗性，這與Bekheta等[15]在蠶豆上施加Pro-Ca可以增加其在鹽脅迫下葉綠素含量的結(jié)果相一致。

滲透調(diào)節(jié)是植物響應(yīng)鹽堿脅迫的一種有效策略，在鹽堿脅迫下，植物通過在代謝過程中積累與合成可溶性糖、可溶性蛋白和Pro等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來平衡體內(nèi)細(xì)胞的滲透勢，進(jìn)而緩解鹽堿脅迫造成的傷害[23-27]。Bekheta等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Pro-Ca可以促進(jìn)鹽脅迫下蠶豆體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累來提高耐鹽性。Aghdam[28]研究發(fā)現(xiàn)，Pro-Ca可以大大增加番茄中Pro含量，從而增強(qiáng)對冷害的抗性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，Pro-Ca可以增加鹽堿脅迫下綠豆葉片的可溶性糖、可溶性蛋白和Pro含量，其中，可溶性糖和Pro含量隨著Pro-Ca的增加呈先增后降的趨勢，且均在100mg/L處理下達(dá)到峰值；綠豐2號和綠豐5號葉片可溶性蛋白含量分別在50和100mg/L的Pro-Ca處理下達(dá)到最大值，隨后逐漸降低。從總體上來看，100mg/L Pro-Ca處理時效果最佳，表明外源施加Pro-Ca可以增加綠豆葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，增強(qiáng)綠豆對鹽堿脅迫的抵抗能力，維持植株正常生長。

鹽堿脅迫可導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧代謝紊亂，造成細(xì)胞膜脂過氧化，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。而抗氧化酶系統(tǒng)是植物對鹽脅迫響應(yīng)抵御鹽害的關(guān)鍵機(jī)制，其中，抗氧化酶SOD、POD和CAT可以清除植物體內(nèi)的活性氧，增強(qiáng)抗膜質(zhì)過氧化作用，緩解鹽堿脅迫的傷害[29]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，外源施加Pro-Ca均可提高綠豆葉片的SOD、POD和CAT活性，且總體上均隨著Pro-Ca濃度的增加呈先上升后下降的趨勢，并在100mg/L處理下達(dá)到峰值，其中Pro-Ca對SOD活性的調(diào)控效果在2個綠豆品種上差異不顯著，而POD活性的增強(qiáng)在耐鹽品種中作用效果更好，CAT的作用效果同樣要低于鹽敏感型品種。MDA是膜脂過氧化反應(yīng)的主要產(chǎn)物之一，在鹽堿環(huán)境下會損傷自身細(xì)胞膜系統(tǒng)，引起膜脂過氧化反應(yīng)，其含量的多少在一定程度上反映膜損傷程度的大小[30-31]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，外源施加Pro-Ca降低了MDA含量，維持了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，這與Ramírez等[32]的研究結(jié)果相似，說明外源施加Pro-Ca可增強(qiáng)綠豆的抗氧化保護(hù)系統(tǒng)，減少植物體內(nèi)過氧化物積累，從而降低膜質(zhì)過氧化程度，增強(qiáng)綠豆在鹽堿脅迫下的抗性能力。

4 結(jié)論

不同濃度的Pro-Ca可以增加綠豆葉片SPAD，保證正常光合活動，提高滲透物質(zhì)可溶性糖、可溶性蛋白和Pro含量，維持植物細(xì)胞滲透勢，同時誘導(dǎo)抗氧化酶SOD、POD及CAT活性增強(qiáng)，降低葉片的MDA含量，以清除過氧化物積累，降低膜質(zhì)過氧化程度，從而增加鹽堿脅迫下綠豆苗期根冠比和地上、地下部干重，緩解鹽堿脅迫對綠豆植株造成的傷害，提高鹽堿抗性。綜合不同濃度Pro-Ca對綠豆的調(diào)控效果，初步確定100mg/L為緩解綠豆鹽堿脅迫的最佳濃度。