芋頭揮發(fā)性代謝物分析及其品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)

郭巨先 黃家昕 李桂花 符梅 羅文龍 王 俊 陸美蓮

（1廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，510640，廣東廣州；2仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，510225，廣東廣州）

芋頭[Colocasia esculenta(L.)Schoot]屬天南星科多年生草本植物，是一種糧菜兼用作物，其營(yíng)養(yǎng)豐富，含有多種礦物質(zhì)和維生素，球莖可食用，同時(shí)具有藥用價(jià)值，能提高機(jī)體免疫力，入藥能治療多種疾病，且用途廣泛，在人體內(nèi)能不同程度地增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫的功能[1-3]。芋頭在我國(guó)具有多年的栽培歷史，且蟲(chóng)害較少，氮素利用效率高，是高產(chǎn)多能的作物。國(guó)內(nèi)種植區(qū)域大部分集中在珠江流域及臺(tái)灣省，因受自身生長(zhǎng)習(xí)性影響，分布趨向南方[4-5]。隨著種植面積的擴(kuò)大和產(chǎn)業(yè)化的形成，栽培芋頭已經(jīng)成為我國(guó)南方地區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)作物[6-7]。我國(guó)廣東地區(qū)芋頭栽培歷史悠久，在長(zhǎng)期發(fā)展中形成了具有一定地方特色和知名度的品種[7]。芋頭的研究多集中在資源評(píng)價(jià)[8-11]、栽培[12]和加工[13-14]等方面。芋頭品種的評(píng)價(jià)因素有抗病性、產(chǎn)量性狀、耐貯存性和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)等[8-11]，其中營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和產(chǎn)量性狀是品種評(píng)價(jià)的重要因素。芋頭作為一種大眾食品，大部分研究[13,15-22]僅對(duì)檳榔芋的淀粉理化性質(zhì)以及香沙芋、紅芽芋和檳榔芋的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行了檢測(cè)和基本定量分析，而對(duì)芋頭資源品質(zhì)相關(guān)性狀的綜合評(píng)價(jià)研究[10-11]較少，并且缺乏有效的數(shù)學(xué)分析方法對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。

主成分分析法具有綜合評(píng)分指標(biāo)和簡(jiǎn)化評(píng)價(jià)程序的功能，能夠表達(dá)待測(cè)品種的綜合信息，是一種科學(xué)的統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)法；聚類分析按照相似歸類的原則，將分析對(duì)象劃分成若干類群。結(jié)合2種分析方法，能夠?qū)⑿誀钕嗨啤I(yíng)養(yǎng)水平相等的品種劃為同類，進(jìn)行優(yōu)良排序，該方法已經(jīng)廣泛用于農(nóng)作物的綜合評(píng)價(jià)[22-23]。但是利用主成分分析法對(duì)芋頭品質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)的研究少見(jiàn)報(bào)道。

本研究收集了18個(gè)來(lái)源于我國(guó)不同地區(qū)的芋頭資源，測(cè)定了13個(gè)農(nóng)藝性狀和常規(guī)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)以及黃酮和總酚等功能保健成分，運(yùn)用主成分分析法和代謝組學(xué)方法對(duì)芋頭品質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，從而篩選出綜合品質(zhì)較佳的品種，為我國(guó)芋頭現(xiàn)代品種的選育和資源開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究引進(jìn)了各地的多子芋品種7個(gè)和魁芋品種11個(gè)（表1），于2019年2月25日定植于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院鐘落潭試驗(yàn)基地，株行距40cm×50cm，采用露地單行種植，常規(guī)肥水管理。2019年12月20日統(tǒng)一采收。

表1 供試芋品種和來(lái)源Table 1 The names and origins of tested taro varieties

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 外觀品質(zhì)指標(biāo) 用GY-1手持式硬度計(jì)測(cè)定硬度，參考《芋種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[24]和《農(nóng)作物種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》[25]測(cè)量芋頭的縱徑、橫徑和單芋重等形態(tài)指標(biāo)，每個(gè)品種設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 總酚及黃酮含量 參考李靜等[26]的方法測(cè)定芋頭中總酚含量。參考鄧菊慶等[32]的方法測(cè)定芋頭總黃酮含量。稱取芋頭根部約2.5g，80℃烘干24h后，研成粉末，并用60%乙醇萃取待測(cè)。精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.7、1.2、1.6和2.0mL，用60%乙醇溶解相應(yīng)濃度后，于510nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，并根據(jù)樣品吸光度計(jì)算樣液的總黃酮含量。以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品25mg，定容后制定標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度，在760nm的紫外光下測(cè)定吸光度，計(jì)算對(duì)應(yīng)的總酚含量。

1.2.3 常規(guī)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì) 參考王鴻飛等[28]的方法測(cè)定芋頭中維生素C（Vc）的含量。按照王春霞等[29]的方法測(cè)定直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量。參考宋萍等[30]的方法測(cè)定粗纖維含量。按照《食用菌中總糖含量的測(cè)定：GB/T 15672-2009》[31]測(cè)定還原糖含量。依照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定：GB 5009.5-2016》[32]測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 揮發(fā)性代謝組學(xué) 揮發(fā)性代謝物分析以外觀和芋香味差異較大的炭步香芋和花都紅芽芋為材料。從-80℃冰箱中取出樣品進(jìn)行液氮研磨，渦旋混合均勻，每個(gè)樣本稱取約1g（液體1mL）于頂空瓶中。分別加入1～2mL飽和NaCl溶液，10μL內(nèi)標(biāo)溶液。全自動(dòng)頂空固相微萃取HS-SPME進(jìn)行樣本萃取，以供GC-MS（Agilent 8890-5977B）分析。SPME進(jìn)樣參數(shù)：老化溫度250℃，老化時(shí)間5min；加熱溫度60℃，加熱時(shí)間10min；吸附時(shí)間20min；解析時(shí)間5min；進(jìn)樣后老化時(shí)間5min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

主成分分析采用初始因子載荷矩陣旋轉(zhuǎn)處理，目的是剔除重復(fù)信息，讓矩陣系數(shù)更加顯著。運(yùn)用軟件SPSS 23.0和Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。GC-MS分析獲取的原始數(shù)據(jù)文件首先由MassHunter軟件（Agilent）進(jìn)行峰提取，獲得特征峰的質(zhì)荷比、保留時(shí)間和峰面積等信息，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同芋品種的外觀指標(biāo)

本研究中大部分芋頭外觀大小存在較大的形態(tài)學(xué)變異（表2）。供試芋頭品種外觀指標(biāo)的變異系數(shù)介于36.30%～94.54%，說(shuō)明芋頭品種的硬度、大小和單芋重等外觀變異較大。其中，多子芋單芋重為37.73～119.67g，而魁芋的單芋重為530.03～1900.01g，多子芋和魁芋的變異系數(shù)均超過(guò)90%，可知芋頭品種對(duì)單芋重的影響最大。其中，單芋重最大值與最小值相差達(dá)到1862.27g，約為50倍。魁芋的縱徑、橫徑和單芋重普遍大于多子芋，而硬度差異不顯著。相關(guān)性分析（表3）表明，硬度與縱徑和單芋重均呈負(fù)相關(guān)，而縱徑與橫徑和單芋重之間存在極顯著正相關(guān)，說(shuō)明外觀指標(biāo)間存在較強(qiáng)的相關(guān)性。

表2 不同芋頭品種的硬度、縱徑、橫徑和單芋重的比較分析Table 2 Variation of hardness,longitudinal diameter,transverse diameter and weight per taro of different taro varieties

表3 不同芋頭品種各外觀品質(zhì)指標(biāo)的皮爾森相關(guān)性分析Table 3 Pearson correlation analysis on appearance quality indexes of different taro varieties

2.2 不同芋品種營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)

各供試芋頭品種基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)存在較大變異（圖1），變異系數(shù)介于11.10%～52.50%，說(shuō)明芋頭品種對(duì)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響較大。變異系數(shù)排序?yàn)橹辨湹矸郏局ф湹矸郏军S酮＞還原糖＞總酚＞粗纖維＞蛋白質(zhì)＞Vc＞干物質(zhì)。其中干物質(zhì)的變異系數(shù)最小，為11.10%。直鏈淀粉的變異系數(shù)最大，為52.50%。其中，多子芋的干物質(zhì)、直鏈淀粉和支鏈淀粉含量要普遍低于魁芋，有5個(gè)多子芋和1個(gè)魁芋的總酚含量相對(duì)較高，而10個(gè)魁芋品種的黃酮類物質(zhì)相對(duì)含量較高。相關(guān)分析結(jié)果（表4）顯示，關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)成分Vc和直鏈淀粉含量均與總酚、黃酮和還原糖含量呈顯著負(fù)相關(guān)。其中還原糖、直鏈淀粉和支鏈淀粉含量之間存在顯著正相關(guān)，而該3個(gè)參數(shù)與粗纖維、還原糖和蛋白質(zhì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)。

表4 9個(gè)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的皮爾森相關(guān)性分析Table 4 Pearson correlation analysis on the nine quality related indexes

圖1 18個(gè)芋頭品種的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)相關(guān)參數(shù)的變異Fig.1 Variation of quality indexes in 18 taro varieties

2.3 芋頭品種性狀的主成分分析

由表5可知，前4個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)82.31%，能反映芋頭營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)參數(shù)變異的大部分信息，因此選取前4個(gè)主成分進(jìn)行芋頭品種綜合分析。第1主成分貢獻(xiàn)率達(dá)到41.42%，主要代表橫徑、支鏈淀粉、干物質(zhì)、黃酮、縱徑和單芋重等特征；第2主成分貢獻(xiàn)率達(dá)到16.96%，主要代表直鏈淀粉、Vc和粗纖維的特征信息；第3主成分貢獻(xiàn)率達(dá)到13.41%，主要代表粗纖維、蛋白質(zhì)和Vc的特征信息；第4個(gè)主成分貢獻(xiàn)率達(dá)到10.52%，主要代表還原糖和總酚的特征信息。

表5 4個(gè)主成分的特征值、貢獻(xiàn)率及累計(jì)貢獻(xiàn)率Table 5 The eigenvalues,contribution rates and the accumulative contribution rates of four principal components

2.4 不同芋品種的綜合評(píng)價(jià)

根據(jù)主成分得分結(jié)果，構(gòu)建了4個(gè)主成分的函數(shù)表達(dá)式，并得出各自的得分，根據(jù)方差貢獻(xiàn)率對(duì)各個(gè)主成分進(jìn)行賦值，得出公式F=0.4142×F1+0.1696×F2+0.1341×F3+0.1052×F4，由此求出各芋頭品種主成分得分（表6）。對(duì)18個(gè)芋頭品種的品質(zhì)性狀進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。由表6可知，第1主成分中除龍巖香芋外，其余10個(gè)魁芋品種得分都較高，而7個(gè)多子芋品種在第1主成分中得分均為負(fù)值。炭步香芋、張溪香芋和乳源香芋的第1主成分大于1，說(shuō)明魁芋品種的優(yōu)勢(shì)在單芋重和淀粉等質(zhì)量性狀和黃酮等功能成分含量上。廣西紅芽芋和荔浦香芋在第2主成分得分較高，說(shuō)明這2個(gè)品種在粗纖維和Vc含量上具有優(yōu)勢(shì)。江西白芽芋、炭步香芋和乳源香芋在第3主成分得分較高，說(shuō)明這些品種在Vc、膳食纖維和直鏈淀粉含量上都有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。龍巖香芋和連州嶺芋在第4主成分得分最高，說(shuō)明這2個(gè)品種還原糖和酚類物質(zhì)具有優(yōu)勢(shì)。

表6 供試芋品種的主成分得分及其排序Table 6 The scores of the principal components and the ranking of the excellent degree of the quality of taro varieties

2.5 差異性揮發(fā)性代謝物分析

通過(guò)GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用法，進(jìn)一步分析了炭步香芋（魁芋）和花都紅芽芋（多子芋）的差異揮發(fā)性代謝物。相對(duì)于花都紅芽芋，炭步香芋具有更長(zhǎng)根莖（圖2a）。主成分分析（圖2b）證明了2種芋頭品種之間的差異比較明顯。共鑒定到76種揮發(fā)性代謝物，這些代謝物豐度差異不同（圖2c）。通過(guò)差異豐度代謝物分析，共發(fā)現(xiàn)了2種極顯著上調(diào)的代謝物（圖2d）。這2種代謝物包括1-甲基乙基-萘和4-甲基-6-庚烯-4-油化物（表7）。因此，這2種顯著上調(diào)的代謝物很可能與炭步香芋香味的生物學(xué)特性有關(guān)。

圖2 炭步香芋和花都紅芽芋的差異揮發(fā)性代謝物比較Fig.2 Comparison on quality related traits and correlation analysis in Tanbuxiang taro and Huaduhongya taro

表7 芋頭的2種差異性揮發(fā)性代謝物Table 7 Two significantly enriched metabolites in two taro varieties

3 討論

芋頭是一種重要的蔬菜兼糧食作物，提高芋頭的經(jīng)濟(jì)價(jià)值一直是我國(guó)芋頭高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)育種的核心。對(duì)于芋頭經(jīng)濟(jì)價(jià)值的評(píng)估，首先要系統(tǒng)調(diào)查芋頭相關(guān)經(jīng)濟(jì)性狀的自然變異，對(duì)于開(kāi)展芋頭的分子設(shè)計(jì)育種亦至關(guān)重要[33-35]，然而國(guó)內(nèi)外對(duì)該方面相關(guān)報(bào)道很少。本研究通過(guò)整合各項(xiàng)形態(tài)學(xué)指標(biāo)、生理生化參數(shù)以及代謝組學(xué)分析，系統(tǒng)闡述了芋頭不同品種間的遺傳變異，揭示了影響芋頭香氣的關(guān)鍵小分子代謝物。

3.1 芋頭感觀與營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)分析

種質(zhì)資源是進(jìn)行育種、科研和生產(chǎn)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。目前國(guó)內(nèi)芋頭種質(zhì)資源最豐富的是國(guó)家種質(zhì)武漢水生蔬菜資源圃，該資源圃共收集并保存了來(lái)自全國(guó)各地的芋頭種質(zhì)資源400多份[33]。如何對(duì)芋頭的種質(zhì)資源進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)是芋頭現(xiàn)代育種的重要科學(xué)問(wèn)題。本研究以來(lái)自我國(guó)不同生態(tài)區(qū)收集的18個(gè)芋頭品種為例，系統(tǒng)分析了各形態(tài)學(xué)指標(biāo)及生理學(xué)參數(shù)，并證明了各品質(zhì)性狀存在著遺傳差異，且變異范圍廣，尤其是單芋重、縱徑、直鏈淀粉和支鏈淀粉，說(shuō)明供試品種中這些營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)蘊(yùn)含著巨大的改良潛力。

3.2 芋頭香氣品質(zhì)相關(guān)代謝物分析

香氣是芋頭食味品質(zhì)最重要的指標(biāo)之一。前人[34-36]根據(jù)芋頭的食味品質(zhì)進(jìn)行了分級(jí)，然而并沒(méi)有一個(gè)量化的指標(biāo)。隨著代謝組學(xué)的發(fā)展，揮發(fā)性代謝物的檢測(cè)已經(jīng)成為經(jīng)濟(jì)作物品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要手段之一[37-38]。本研究利用GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用的方法，對(duì)炭步香芋和花都紅芽芋的揮發(fā)性代謝物進(jìn)行系統(tǒng)分析，共鑒定到了76種揮發(fā)性代謝物，其中炭步香芋1甲基乙基-萘和4-甲基-6-庚烯-4-油化物較花都紅芽芋顯著上調(diào)，這2種代謝物的生理學(xué)功能目前并沒(méi)有相關(guān)報(bào)道，推測(cè)這2種代謝物與芋頭香氣的分子調(diào)控有關(guān)，對(duì)于多子芋和魁芋的香氣相關(guān)代謝物仍需要分子生物學(xué)研究。

3.3 基于主成分分析的芋頭品種綜合評(píng)價(jià)

主成分分析法具有簡(jiǎn)化評(píng)價(jià)指標(biāo)的功能。前人[22-23]對(duì)于園藝經(jīng)濟(jì)作物的果實(shí)品質(zhì)方面已有大量研究。本研究通過(guò)主成分降維的方法，將13項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)簡(jiǎn)化成4個(gè)互相獨(dú)立的綜合指標(biāo)（主成分），其特征值均大于1，累積貢獻(xiàn)率高達(dá)82.31%，說(shuō)明4個(gè)主成分反映了品質(zhì)性狀的大部分特征信息。結(jié)果顯示，魁芋綜合排名前5位依次是張溪香芋＞乳源香芋＞長(zhǎng)亭香芋＞荔浦香芋＞炭步香芋；多子芋以廣西紅芽芋綜合得分最高。

4 結(jié)論

從綜合評(píng)分排序來(lái)看，魁芋排名較前的5個(gè)品種分別是張溪香芋、乳源香芋、長(zhǎng)亭香芋、荔浦香芋和炭步香芋，排名較前的幾個(gè)品種分別從廣東、廣西和福建收集而來(lái)，說(shuō)明這幾個(gè)地區(qū)是芋頭生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)。廣西紅芽芋綜合排名第8位，在多子芋中排名第1位，是優(yōu)質(zhì)的多子芋品種。相對(duì)于花都多子芋，炭步香芋中顯著上調(diào)的代謝物包括1-甲基乙基-萘和4-甲基-6-庚烯-4油化物，說(shuō)明這2種代謝物很可能是檳榔芋品種產(chǎn)生芋香味的主要原因。