豬流行性腹瀉活疫苗與滅活疫苗免疫仔豬抗體反應的評估

杜久斌 唐慧芬 潘曉梅 趙曉英 廖 勇 劉強德 孫彥軍 賀 筍

（天康生物制藥有限公司，新疆烏魯木齊 830001）

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）是豬的一種高致病性接觸性傳染病，屬于冠狀病毒，1971年首次在英國被發(fā)現，隨后比利時、荷蘭、德國、瑞士、法國、匈牙利和保加利亞等國均有該病的報道，我國從80年代證明有豬流行性腹瀉病的發(fā)生。到2000年，該病已在我國全面流行，特別是從2010年起，我國出現新的高致病性PEDV毒株[1]，導致我國免疫豬群中再度發(fā)病，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的危害[2-4]，對PED的預防和防控應以疫苗接種為主，國內外的研究者在PED疫苗研究方面已做了大量工作[5,6]，但目前為止，還沒有研制出特別有效的疫苗可以控制PED疾病的發(fā)生。目前市面上以PED細胞滅活疫苗和PED細胞弱毒活疫苗為主來預防PEDV[7]。在臨床上使用PED滅活疫苗免疫2次后，母豬血清和乳汁中所產生的中和抗體、IgA和IgG水平，高于2針活疫苗免疫和1針活疫苗加1針滅活疫苗的免疫效果[8]。

有效的PED疫苗免疫豬只后能產生較高的中和抗體，保護豬只免受PED病毒的感染[9]。由于臨床受野毒感染的影響，不能客觀評價活疫苗和滅活疫苗所產生的抗體水平[10]。因此，在本研究中，選擇未感染過PEDV的仔豬免疫商品化PED細胞活疫苗和滅活疫苗，綜合評價不同疫苗免疫仔豬后血清的抗體反應情況。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

豬流行性腹瀉病毒：豬流行性腹瀉病毒（XJ-DB2株）代次F14代，病毒含量106.0 TCID50/mL，批號：20150917。

細胞：Vero細胞，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，由天康生物制藥公司保管、傳代。

疫苗：PED細胞活疫苗、滅活疫苗均為市售疫苗。

試劑盒：豬流行性腹瀉IgA抗體檢測試劑盒，購自愛德士公司，批號：21028；豬流行性腹瀉IgG抗體檢測試劑盒，購自Biovet Inc公司，批號：230204。

試驗動物：選用PED抗原、抗體陰性妊娠母豬所產1月齡仔豬。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗分組及免疫

篩選產前15 d左右妊娠母豬運輸至試驗動物舍，隔離飼養(yǎng)。母豬分娩后仔豬母乳喂養(yǎng)至1月齡，將仔豬分成3組，每組5頭。第Ⅰ組免疫活疫苗，10頭份/頭，免疫1次；第Ⅱ組免疫滅活疫苗，2 mL/頭，首次免疫完間隔14日加強免疫1次；第Ⅲ組為空白對照組，不做免疫。試驗動物分組及免疫情況見表1。

表1 實驗動物分組及免疫

1.2.2 樣品采集

試驗豬只于首免時、一免后14日和一免后28日分別采集血清，用于抗體水平檢測。

1.2.3 抗體檢測

將待檢血清、陽性血清和陰性對照血清56℃水浴滅活30 min。用MEM（含10 μg/mL胰酶）對滅活后的待檢樣品、陽性對照和陰性對照血清在96孔U型板內進行2倍（1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32…1∶256稀釋）系列稀釋。每個稀釋度4孔，每孔100 μL。用MEM（含10 μg/mL胰酶）將檢驗病毒稀釋成病毒含量為200 TCID50/0.1 mL的病毒液。將稀釋好的病毒液按每孔100 μL加到含有血清的96孔U型板中，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱內中和1 h。取培養(yǎng)24～48 h的96孔培養(yǎng)板細胞，棄去培養(yǎng)液，將中和1 h的病毒與血清的混合物轉移至96孔培養(yǎng)板相應的孔內，每孔100 μL，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察5日，用Spearman Karber法計算血清中和抗體效價。按抗體檢測說明書進行IgA、IgG抗體檢測。

2 試驗結果與分析

2.1 中和抗體結果

3組試驗豬免疫前血清中和抗體效價均不高于1∶2，免疫后14日，活疫苗抗體效價在1∶10左右，滅活疫苗抗體效價在1∶25左右；免疫后28日，活疫苗抗體效價在1∶8左右，滅活疫苗抗體效價在1∶180左右。具體結果見圖1。

圖1 不同疫苗免疫豬只后的中和抗體檢查

2.2 IgA抗體結果

3組試驗豬免疫前和免疫后血清IgA抗體水平均為陰性，無論是活疫苗免疫組還是滅活疫苗免疫組，血清IgA抗體水平均無升高。具體結果見圖2。

圖2 不同疫苗免疫豬只后IgA抗體檢測結果

2.3 IgG抗體結果

活疫苗免疫組和空白對照組免疫前后IgG抗體均為陰性；滅活疫苗免疫組免疫后14日IgG抗體S/P值在2.3左右，免疫后28日S/P值在3.0左右。具體結果見圖3。

圖3 不同疫苗免疫豬只后IgG抗體檢測結果

3 討論

對于主要在腸道上皮細胞中復制的腸病毒，局部產生的病毒特異性IgA抗體是黏膜表面初級適應性防御的最重要功能[11,12]。血清中IgG抗體反應很少參與預防大多數腸道病毒感染[11]。血清或黏膜IgA抗體水平已被用來預測疫苗的效力和個體或畜群對腸道傳染病如輪狀病毒感染的免疫狀態(tài)。因此，PEDV血清IgA抗體檢測廣泛用于評估感染和疫苗對PEDV的免疫效果[13,14]。

本試驗通過未感染過PEDV的豬只肌肉注射PED滅活疫苗和PED活疫苗，對產生的IgA、IgG和中和抗體進了綜合評估。結果顯示，活疫苗免疫豬只不能產生I-gA抗體，而IgA主要由黏膜系統(tǒng)產生，說明肌肉注射PED活疫苗不能使PED疫苗弱毒進入腸道的腸壁纖毛上皮細胞增殖，從而不能誘導豬腸壁黏膜產生IgA抗體。

試驗前，篩選臨床上PED抗原、抗體陰性豬進行PED滅活疫苗免疫試驗，免疫后豬只產生了較高的IgA抗體、IgG抗體和中和抗體水平。分析原因可能是臨床陰性豬只之前感染過PED野毒，感染后的B細胞免疫反應，有全身性和黏膜性PEDV IgA抗體反應，在腸系膜淋巴結和回腸中有PEDV IgA抗體記憶的B細胞[15]。這時使用滅活疫苗免疫，就能夠再次激活IgA。這也是本次試驗選用臨床PED抗原、抗體陰性母豬，在試驗動物房生產，使用生產的仔豬進行的原因。

4 結論

豬流行性腹瀉活疫苗和滅活疫苗肌肉接種未感染過PEDV的豬只均不能產生IgA抗體。

豬流行性腹瀉活疫苗肌肉接種未感染過PEDV的豬只不能產生IgG抗體，可以產生較低水平的中和抗體。

豬流行性腹瀉滅活疫苗肌肉接種未感染過PEDV的陰豬只，能產生高水平的中和抗體和高水平的IgG抗體。

從以上結論可以看出，肌肉接種未感染過PEDV的豬只，PED滅活疫苗所產生的抗體反應高于接種活疫苗所產生的抗體，從所產生的抗體水平來看，滅活疫苗的效力高于活疫苗所產生的效力。