黑藻抗氧化肽制備及其活性表征*

唐裕芳， 梁 帆， 石 宇， 汪德穎， 周 蓉，李玉芹， 王 唯， 盧 婷， 曾婷婷， 周韶華， 陳雅琪

(湘潭大學(xué) 化工學(xué)院，湖南 湘潭 411105)

0 引言

氧化應(yīng)激損傷及自由基代謝失調(diào)會(huì)加速機(jī)體衰老，引發(fā)多種慢性疾病，嚴(yán)重危害機(jī)體健康[1-4].攝取一定的抗氧化劑，能消除體內(nèi)過多自由基(如O2-和NO-)，能延緩身體衰老，預(yù)防炎癥、癌癥、心腦血管病、阿爾茨海默病等疾病的發(fā)生.與人工合成抗氧劑相比，酶解植物源、動(dòng)物源、微生物源蛋白得到的抗氧化肽因其結(jié)構(gòu)相對簡單、活性強(qiáng)、易于機(jī)體吸收、安全無毒副作用等特點(diǎn)而備受青睞[5-12].如可利用西瓜籽[13]、鴨胸肉[14]、鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白[15]等材料制備不同來源的抗氧化肽.

黑藻(Hydrillaverticillata(Linn.f.)Royle)屬水鱉科黑藻植物，其繁殖速率快，粗脂肪和纖維含量較低，常被用作魚類餌料、飼料和農(nóng)田綠肥.而黑藻細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量較高(>25.3%)[16]，因而是制備抗氧化肽的良好原料.目前利用黑藻蛋白制備抗氧化肽鮮有報(bào)道.本研究以黑藻蛋白為原料，利用酶法水解黑藻蛋白制備酶解物，采用響應(yīng)面法優(yōu)化酶解黑藻蛋白工藝條件，分離純化酶解物制得黑藻抗氧化肽，同時(shí)對其自由基清除能力進(jìn)行考察，以期為黑藻多肽開發(fā)和高值化利用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黑藻粗提蛋白粉購于西安澤朗生物科技有限公司；胰蛋白酶， ABTS，過硫酸鉀，甲醇，甲醛，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，硝基藍(lán)四氮唑(NBT)，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，三羥甲基氨基甲烷(Tris)均購于上海麥克林生化科技有限公司；氫氧化鈉，鹽酸，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉購于西隴科學(xué)股份有限公司.G-25葡聚糖凝膠購于西寶生物科技股份有限公司，化學(xué)試劑均為分析純級(jí)別.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑藻蛋白質(zhì)提取及含量測定稱取80 g黑藻粗提蛋白粉懸浮于800 mL超純水中，充分溶解后4 ℃離心20 min，取上清液減壓抽濾后，所得濾液于30%、40%、50%、60%、70%、80%和90% 飽和硫酸銨溶液中沉淀黑藻蛋白，選擇最佳的硫酸銨濃度，離心所得沉淀物以超純水溶解后裝入透析袋，透析除鹽48 h后，真空冷凍干燥得黑藻蛋白.采用凱氏定氮法測定黑藻蛋白質(zhì)含量.

1.2.2 影響黑藻蛋白酶解物制備的因素100 mg/mL的黑藻蛋白溶液在37 ℃酶解溫度和pH 7.0條件下，以不同酶底比(2%、4%、6%、8%、10%、12%和14%)分別加入胰蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)，酶解4 h后，考察酶底比對黑藻蛋白酶解物的影響.

100 mg/mL黑藻蛋白溶液中加入酶底比為8%的胰蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)，在37 ℃酶解溫度和pH 7.0條件下，分別酶解1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h和7 h后，考察酶解時(shí)間對黑藻蛋白酶解物的影響.

100 mg/mL黑藻蛋白溶液中加入酶底比為8%的胰蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)，在37 ℃酶解溫度，pH值分別為6、6.5、7、7.5、8、8.5、9條件下，酶解6 h，考察pH值對黑藻蛋白酶解物的影響.

酶解完畢后均于90 ℃滅酶活10 min，4 000 r/min離心10 min，所得上清液冷凍干燥后即得黑藻蛋白酶解物，測定其對ABTS自由基的清除率(方法見1.2.5節(jié)).

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化黑藻蛋白酶解物制備條件在上述酶底比、酶解時(shí)間、酶解pH實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上(固定酶解溫度37 ℃, 固液比1∶10)，采用Design Expert 10進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，設(shè)置酶底比、酶解時(shí)間、酶解pH值3個(gè)因素3種水平，按中心組合設(shè)計(jì)，以酶解物對ABTS自由基的清除率為響應(yīng)值尋找最佳黑藻蛋白酶解工藝條件.試驗(yàn)因素及水平如表1所示.

表1 響應(yīng)面法試驗(yàn)因素與水平Tab.1 Coded levels for independent variables used in response surface analysis

1.2.4 黑藻抗氧化肽的分離純化黑藻蛋白酶解物經(jīng)截留分子量3 kDa和10 kDa超濾離心(4 ℃, 6 000 r/min離心15 min)，按1.2.5的方法測定分離所得的兩個(gè)多肽組分P-1(MW<3 kDa)和P-2(MW為3～10 kDa)抗氧化性能.抗氧化性能較強(qiáng)的組分進(jìn)一步經(jīng)Sephadex G-25凝膠柱(20 mm×70 mm)層析分離：上樣體積為1 mL，上樣濃度為60 mg/mL，洗脫液為超純水，洗脫流速為0.5 mL/min，8 min收集一管，測定每管洗脫液在280 nm處的吸光(OD)值，收集峰值處洗脫液，凍干，并測定其抗氧化性能.

1.2.5 抗氧化性能測定

(1)DPPH自由基清除率測定

將0.1 mmol/L的DPPH-甲醇溶液(反應(yīng)啟動(dòng)管)和純甲醇溶液(未啟動(dòng)管)分別與500 μL樣品溶液等體積混合，搖勻避光靜置30 min后，于517 nm處測定反應(yīng)體系的吸光度值.DPPH自由基的清除率根據(jù)公式(1)計(jì)算.

(1)

其中A0, Ai0, Ai分別為蒸餾水空白組、反應(yīng)未啟動(dòng)管和反應(yīng)啟動(dòng)管的吸光度值.

(2)ABTS自由基清除率的測定

將7.4 mmol/L的ABTS溶液和2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液等體積混合，在黑暗室溫環(huán)境放置12 h后用pH 7.4的PBS溶液將其稀釋至OD734=0.7±0.02，此溶液為ABTS工作液.將800 mL ABTS工作液和pH 7.4的PBS溶液分別與200 mL樣品以4∶1的體積比混合搖勻，作為反應(yīng)啟動(dòng)管和未啟動(dòng)管，測定其在734 nm處的吸光值，根據(jù)公式(1)計(jì)算對ABTS自由基的清除率.

(3)超氧陰離子清除率測定

將100 μL 0.78 mmol/L的還原型輔酶I(NADH)和 700 μL 16 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)混合作為反應(yīng)未啟動(dòng)管，100 μL 0.78 mmol/L的NADH，100 μL 0.5 mmol/L的氯化硝基四氮唑蘭(NBT)和600 μL 16 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)3種溶液混合作為反應(yīng)啟動(dòng)管，所有管中加入100 μL待測樣品溶液，混勻后再分別加入100 μL 0.1 mmol/L的吩嗪硫酸甲酯(PMS)，反應(yīng)完成后在波長560 nm處測定其吸光值，根據(jù)公式(1)計(jì)算對超氧陰離子自由基的清除率.

(4)羥基自由基清除率測定

1 mL樣品中依次加入300 μL 9 mmol/L的FeSO4溶液和 300 μL 8 mmol/L 的H2O2啟動(dòng)反應(yīng)作為反應(yīng)啟動(dòng)管，只加300 μL 9 mmol/L的FeSO4溶液，不加H2O2作為反應(yīng)未啟動(dòng)管，全部試管搖勻后靜置10 min；然后向所有試管加入300 μL由50%乙醇配制的9 mmol/L的水楊酸乙醇溶液，于37 ℃水浴鍋反應(yīng)30 min，冷卻至室溫，在510 nm測定其吸光值，根據(jù)公式(1)計(jì)算出對羥基自由基的清除率.

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 2018，Design Expert 10 軟件分析，每組試驗(yàn)重復(fù)3次.

2 結(jié)果與分析

2.1 黑藻粗提蛋白粉中蛋白質(zhì)提取率及蛋白質(zhì)含量

本論文采用飽和硫酸銨溶液分級(jí)沉淀黑藻蛋白質(zhì)，最終確定使用80%飽和硫酸銨溶液提取黑藻蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)提取率為58.7%.凱氏定氮法測定出黑藻粗提蛋白粉中的蛋白質(zhì)含量為73.64%±2.0.

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

不同酶底比、酶解時(shí)間、酶解pH值單因素對胰蛋白酶酶解黑藻蛋白的影響如圖1所示.從圖1(a)可以看出，隨著酶底比的增加，酶解物對ABTS自由基清除率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢.在酶底比為8%時(shí)，所得酶解物對ABTS自由基的清除率最高，為65.1%.酶底比低時(shí)(2%～6%)，對酶來說，底物較為充足，不能將全部底物酶解轉(zhuǎn)化為酶解產(chǎn)物，因而酶解產(chǎn)物較少，對ABTS自由基清除率較低；隨著酶底比增加底物與酶接觸機(jī)會(huì)增多，酶解更充分，產(chǎn)生較多的酶解產(chǎn)物，對ABTS自由基清除率也較高；但隨著酶底比的進(jìn)一步增加(>8%)，可能出現(xiàn)酶與底物的結(jié)合位點(diǎn)飽和和競爭抑制現(xiàn)象，從而影響底物的酶解，致使酶解物對自由基清除率降低[17].因此，適中的酶底比對獲得自由基清除率較高的酶解產(chǎn)物尤為重要.

酶解時(shí)間也是獲得高活性酶解產(chǎn)物的關(guān)鍵因素.從圖1(b)可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長，獲得的酶解產(chǎn)物對ABTS自由基清除率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢.在酶解時(shí)間1～5 h范圍內(nèi)，酶解產(chǎn)物對自由基清除率緩慢增加，在酶解6 h所得酶解物對ABTS自由基的清除率最高，達(dá)到65.8%，而在酶解時(shí)間>6 h后，酶解產(chǎn)物對自由基清除效率又顯著性下降.造成這種現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)楫?dāng)水解的時(shí)間過短時(shí)，黑藻蛋白大分子沒有水解成具有生物活性的小分子多肽，因而對自由基清除率較低.但水解時(shí)間太長，蛋白質(zhì)過度水解成氨基酸或已沒有生物活性短肽鏈的物質(zhì)，其對自由基清除率也較低[18-19].

從圖1(c)可以看出，在pH 7.5時(shí)，所得酶解物對ABTS自由基的清除率最大.這可能是因?yàn)閜H影響胰蛋白酶分子上氨基和羧基的解離狀態(tài)，進(jìn)一步影響胰蛋白酶的活性，或使蛋白酶的空間構(gòu)象發(fā)生改變，甚至破壞酶的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白酶失活而影響對蛋白質(zhì)的酶解，造成酶解物中疏水基團(tuán)未完全暴露，從而影響酶解物的抗氧化性能[20-21].

圖1 酶底比(a)、酶解時(shí)間(b)、酶解pH值(c)對酶解物清除ABTS自由基的影響Fig.1 Effect of enzyme-to-substrate ratio(a), hydrolysis time(b) and hydrolysis pH(c) on the scavenging radical performance of hydrolysates

通過以上單因素試驗(yàn)結(jié)果得出，胰蛋白酶酶解黑藻蛋白質(zhì)的最佳酶解條件：酶底比為8%、酶解時(shí)間6 h、酶解pH 值7.5，為下一步的響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了理論依據(jù).

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

單因素實(shí)驗(yàn)雖能篩選出酶解反應(yīng)的最佳條件，但不能分析各因素之間相互作用是否顯著[22].為了全面考察影響酶解物抗氧化性能的因素，本論文采用響應(yīng)面法繼續(xù)優(yōu)化胰蛋白酶酶解制備黑藻蛋白酶解物的條件.以酶底比(A)、酶解時(shí)間(B)、酶解pH值(C)為自變量，以ABTS自由基清除率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，繼續(xù)優(yōu)化酶解條件，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示.

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Experimental design and results for response surface analysis

表2(續(xù))

用Design Expert 10 軟件對表2的結(jié)果進(jìn)行多元分析，得到 ABTS自由基清除率(P)與酶底比(A)、酶解時(shí)間(B)和酶解pH值(C)的二元多項(xiàng)式回歸方程為：ABTS自由基清除率(P)=66.70-0.44×A+1.14×B-0.23×C-0.04×AB+1.27×AC+1.01×BC-4.39×A2-0.56×B2-1.87×C2.

表3 模型回歸方程方差分析Tab.3 Analysis of variance (ANOVA) of regression equation

分別固定各因素中的1個(gè)因素在0水平, 得其余2個(gè)因素的交互作用影響自由基清除的三維響應(yīng)面圖和等高線圖, 可以直觀地反映各因素的交互作用對酶解產(chǎn)物清除自由基的影響, 如圖2所示.從圖2(a-1)可知，時(shí)間一定時(shí)，酶底比增加，ABTS自由基的清除率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，說明較少或較多的酶底比都會(huì)降低酶解物對自由基的清除率.從圖2(b-1)可知，pH值一定時(shí)，酶底比增加，ABTS自由基的清除率先增大后減小，說明合適的酶底比對酶解產(chǎn)物清除自由基性能尤為重要.從圖2(c-1)看出，pH值一定時(shí)，隨著酶解時(shí)間的增加，ABTS自由基的清除率先增大后減小，但減小的趨勢不明顯，說明較短或較長的時(shí)間都不利于提高酶解物對自由基的清除率.

圖2 酶底比與酶解時(shí)間(a-1、a-2)、酶底比與pH(b-1、b-2)、酶解時(shí)間與pH值(c-1、c-2)雙因素交互影響ABTS自由基清除率的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots showing the interactive effects of variables on ABTS radical scavenging percentage

等高線是響應(yīng)面在水平方向的投影，等高線的形狀可反映出交互作用是否顯著，橢圓等高線表示兩因素交互作用顯著，圓形等高線表示交互作用不顯著[23].圖2(a-2)、2(b-2)、2(c-2)的等高線都為橢圓形，說明酶底比與酶解時(shí)間、酶底比與酶解pH值、酶解時(shí)間與酶解pH值的兩因素交互作用對ABTS自由基清除率的影響顯著.

如果一個(gè)響應(yīng)面坡度相對平緩, 表明處理?xiàng)l件的變化對響應(yīng)值的影響不大, 相反, 如果一個(gè)響應(yīng)面坡度非常陡峭, 表明響應(yīng)值對于處理?xiàng)l件的改變非常敏感[24].圖2(a-1)、2(c-1)顯示, 固定酶解時(shí)間，酶底比和酶解pH值響應(yīng)面的坡度明顯比較陡峭，并且酶底比響應(yīng)面的坡度更陡峭些，該結(jié)果得出與前面方差分析一致的結(jié)論：各因素對黑藻蛋白酶解物的抗氧化活性的影響順序?yàn)槊附鈺r(shí)間(B)>酶底比(A) > 酶解pH值(C).

通過軟件Design Expert 10分析，得到最佳酶解工藝條件：酶底比8.57%、時(shí)間5.91 h、pH 7.25，所得酶解物對ABTS 自由基的清除率達(dá)到65.6%.考慮到實(shí)際實(shí)驗(yàn)，最佳酶解條件?。好傅妆?.6%、時(shí)間5.9 h、酶解pH值 7.3，該優(yōu)化條件下制備的黑藻蛋白酶解物對ABTS 自由基的清除率達(dá)到67.9%，說明響應(yīng)面得出的最優(yōu)條件具有可行性.

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

黑藻蛋白質(zhì)及其胰蛋白酶酶解物對ABTS、DPPH、羥基自由基和超氧陰離子的清除率見圖3.從圖3可以看出，相對于黑藻蛋白質(zhì)，黑藻蛋白質(zhì)胰蛋白酶酶解物對上述4種自由基的清除率均大幅度提升，分別從38.2%、20.4%、13.9%、28.3%提升到67.9%、40.1%、25.3%、50.1%.這可能是由于黑藻蛋白質(zhì)經(jīng)胰蛋白酶酶解成不同分子量的多肽，增加了黑藻蛋白質(zhì)酶解物對上述4種自由基的清除性能[25].其中，酶解物對ABTS自由基清除率最高，對超氧陰離子自由基清除率次之，這可能是由于不同體系中自由基的形成和清除機(jī)理差異所致.帥鳴[26]研究米渣抗氧化肽得出相同的結(jié)論：米渣蛋白經(jīng)酶解后抗氧化性能增強(qiáng)，且對不同體系的自由基呈現(xiàn)不同的清除能力.

圖3 黑藻蛋白質(zhì)及其胰蛋白酶酶解物對4種自由基的清除率(黑藻蛋白質(zhì)和酶解物濃度：1 000 μg/mL)Fig.3 Scavenging percentage of HVR protein and its hydrolysates to four kinds of radicals(concentration of HVR protein and its hydrolysates: 1 000 μg/mL)

2.5 黑藻抗氧化肽的分離純化及抗氧化性能

為了進(jìn)一步純化黑藻蛋白酶解物以得到抗氧化性能更好的黑藻抗氧化肽，本實(shí)驗(yàn)依次采用超濾和Sephadex G-25凝膠色譜柱分離黑藻蛋白酶解物.黑藻蛋白酶解物經(jīng)過超濾后得到兩組不同分子量分布的組分P-1(<3 kDa)和P-2(3～10 kDa)，P-1和P-2對ABTS、DPPH、羥基自由基和超氧陰離子的清除率見圖4.從圖4可以看出，組分P-1和P-2對上述4種自由基的清除率均有濃度依賴性，且不同濃度的組分P-1對4種自由基的清除率均顯著高于組分P-2對4種自由基的清除率.另外，比較圖3和圖4可以看出，組分P-1對4種自由基的清除率(80.6%、43.1%、31.4%、52.1%)均顯著高于未經(jīng)超濾處理的酶解物對4種自由基的清除率(67.9%、40.1%、25.3%、50.1%).這結(jié)果說明小分子量黑藻多肽的抗氧化性能比大分子量黑藻多肽的抗氧化性能強(qiáng).這可能是由于低分子量的多肽有更多能與自由基結(jié)合的活性位點(diǎn)暴露出來[27].這結(jié)果與He等[28]研究油菜籽抗氧化肽、Wang等[29]研究雙髻鯊肌肉抗氧化肽以及Jiang等[30]研究泥鰍抗氧化肽的結(jié)論一致：小分子肽具有較強(qiáng)的抗氧化能力.

注：大寫字母表示不同濃度之間的差異，小寫字母表示不同組分之間的差異.圖4 超濾后的黑藻抗氧化肽對DPPH (a)，ABTS (b)，超氧陰離子(c)，羥基 (d) 4種自由基的清除率Fig.4 Scavenging percentage of antioxidant peptides prepared by ultrafiltration to DHHP(a),ABTS(b) radical, superoxide anion(c), hydroxyl radical(d)

將組分P-1(<3 kDa)進(jìn)一步采用Sephadex G-25凝膠色譜柱分離，在各峰值處收集兩組分洗脫液，分別冷凍干燥后得到P-1-A 和P-1-B.P-1-A 和P-1-B對ABTS、DPPH、羥基自由基和超氧陰離子的清除率見圖5.從圖5可以看出，P-1-A 和P-1-B對不同自由基的清除率不同，但清除率均隨濃度升高而增加，組分P-1-A 對4種自由基清除率均顯著高于組分P-1-B對4種自由基的清除率.比較圖5和圖4可以看出，在濃度1 000 μg/mL時(shí)，P-1-A對4種自由基清除率(88.18%、48.2%、35.5%、54.4%)均顯著高于P-1對4種自由基的清除率( 80.6%、43.1%、31.4%、52.1%).這結(jié)果說明組分P-1經(jīng)Sephadex G-25凝膠色譜柱分離后可以獲得抗氧化性能更好的黑藻抗氧化肽P-1-A.這實(shí)驗(yàn)結(jié)果與李婷婷[31]研究鴨胸肉抗氧化肽的結(jié)論一致：Sephadex G-25凝膠色譜柱分離后，獲得抗氧化性能更好的鴨胸肉抗氧化肽.

注：大寫字母表示不同濃度之間的差異，小寫字母表示不同組分之間的差異.圖5 Sephadex G-25凝膠柱分離的黑藻抗氧化肽對DPPH (a)，ABTS (b)，超氧陰離子(c)，羥基自由基(d)的清除率Fig.5 Scavenging percentage of antioxidant peptides prepared by separating on G-25 Sephadex column to DHHP(a),ABTS(b), superoxide anion(c), hydroxyl radical(d)

3 結(jié)論

在溫度37 ℃、固液比為1∶10條件下，以ABTS自由基清除率為響應(yīng)值，單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化胰蛋白酶酶解黑藻蛋白最佳工藝條件為：酶底比8.6%、酶解時(shí)間5.9 h、酶解pH 值7.3，3個(gè)因素的影響順序?yàn)椋好附鈺r(shí)間>酶底比>酶解pH值.黑藻蛋白酶解物在1 000 μg/mL時(shí)對ABTS、DPPH、羥自由基、超氧陰離子的清除率分別為67.9%、40.1%、25.3%、50.1%.采用超濾和Sephadex G-25凝膠柱依次分離純化，所得黑藻抗氧化肽P-1和P-1-A對ABTS、DPPH、羥自由基、超氧陰離子的清除率分別顯著提升到80.6%、43.1%、31.4%、52.1%和88.2%、48.2%、35.5%、54.4%，說明黑藻蛋白酶解物經(jīng)超濾和Sephadex G-25凝膠柱分離后，成功獲得清除自由基性能更強(qiáng)的黑藻抗氧化肽.同時(shí)，也說明黑藻蛋白可以制備抗氧化性能較強(qiáng)的抗氧化肽.本研究為開發(fā)黑藻抗氧化肽應(yīng)用于食品、保健品等方面及藥理學(xué)研究方面提供了更為有效的依據(jù)，將產(chǎn)生廣闊的經(jīng)濟(jì)效益和良好的環(huán)境效益.