HILIC-MS/MS結(jié)合酶解-QuEChERS凈化法測(cè)定含雞源成分中成藥中利巴韋林及其代謝物總殘留

李高天， 王紅青， 彭 彥， 尹湘君， 季旭明， 阮家釗*

(1.杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 杭州 310022；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053)

利巴韋林是一種嘌呤核苷類似物，能抑制多種核酸病毒引起的疾病，曾廣泛應(yīng)用于治療動(dòng)物病毒性傳染病，如雞痘、雞傳染性喉氣管炎等[1]。但利巴韋林具有一定的遺傳、生殖毒性和致癌性，禽畜濫用可能會(huì)導(dǎo)致藥物殘留，使其通過食物鏈進(jìn)入人體從而影響人體健康[2-3]。

我國中藥材資源豐富，動(dòng)物源性藥材使用廣泛[4-5]。人們熟知的中成藥烏雞白鳳丸由烏雞、黃芪等 20 味藥材組成，收載于《中國藥典》[6]；雞內(nèi)金是雞的砂囊內(nèi)壁，其藥用價(jià)值可溯源于《神農(nóng)本草經(jīng)》[7]。養(yǎng)殖戶為了提高雞的抵抗力，往往會(huì)在養(yǎng)殖過程中濫用利巴韋林，導(dǎo)致雞肉、雞骨、砂囊等各組織中會(huì)有利巴韋林及其代謝物的殘留和蓄積[8-9]，給含雞源成分中成藥的質(zhì)量安全帶來較大隱患。

雞肉食品中利巴韋林及其代謝物總殘留檢測(cè)目前主要的檢測(cè)方法有 ELISA法、HPLC法、HPLC-MS/MS等[10-14]，然而含雞源成分中成藥中利巴韋林及其代謝物總殘留卻未見相關(guān)的檢測(cè)依據(jù)。本研究采用親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HILIC-MS/MS)結(jié)合酶解-QuEChERS凈化法對(duì)含雞源成分中成藥中利巴韋林及其代謝物總殘留進(jìn)行測(cè)定。

1 材料

1.1 儀器 AB SCIEX Qtrap 4000超高效液相色譜-串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國AB SCIEX公司，配置島津LC-30AD超高效液相色譜儀)；Mili-Q 去離子水發(fā)生器(美國Millipore 公司)；KQ3200V超聲波發(fā)生器(昆山市超聲儀器有限公司)；SHZ-B 水浴恒溫振蕩儀(上海智誠分析儀器制造有限公司)；MS3 旋渦混合器(德國IKA公司)；SBEQ-CR1012 固相萃取裝置(美國Waters 公司)；4-16K高速離心機(jī)(德國Sigma 公司)；N-EVP-111 氮吹濃縮儀(美國Organomation Assicociates 公司)。

1.2 試劑與藥物 利巴韋林對(duì)照品(德國Dr.Ehrenstorfer公司，批號(hào)G154277，純度99.3%)；13C5利巴韋林內(nèi)標(biāo)(加拿大Toronto Research Chemicals公司，批號(hào)10-MRS-156-1，含量99.4%)；酸性磷酸酶(美國Sigma公司，批號(hào)SLBV3717，活性≥0.4 unit/mg)；親水脂平衡(HLB)、陽離子交換(MCX)、苯硼酸基弱陽離子(PBA)固相萃取小柱、15 mL QuEChERS凈化管(含400 mg PSA、400 mg C18、1 200 mg無水硫酸鎂)，購于美國Agilent公司。烏雞白鳳丸(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號(hào)18035367)；復(fù)方雞內(nèi)金片(石藥控股集團(tuán)河北永豐藥業(yè)有限公司，批號(hào)00519040141)。甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，購于德國Merck公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC BHE HILIC色譜柱 (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)；流動(dòng)相 5 mmol/L乙酸銨(含0.2%甲酸)(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～2 min，5%A；2～4 min，5%～30%A；4～5 min，30%～60%A；5～5.1 min，60%～5%A；5.1～10 min，5%A)；體積流量0.4 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

2.2 質(zhì)譜條件 正離子電離 (ESI+)；霧化氣壓力379 kPa；氣簾氣壓力172 kPa；噴霧電壓5 500 V；去溶劑氣溫度500 ℃；去溶劑氣壓力345 kPa；碰撞氣壓力69 kPa；多反應(yīng)監(jiān)測(cè) (MRM)模式；碰撞室出口電壓 (CXP)12.5 V；射入電壓 (EP)10 V。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1，MRM定量離子圖見圖 1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

圖1 MRM定量離子圖

2.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱取100%水平利巴韋林對(duì)照品10 mg，置于100 mL量瓶中，甲醇溶解至刻度，質(zhì)量濃度為100 mg/L，-20 ℃避光保存，臨用前稀釋成2 mg/L；將13C5利巴韋林內(nèi)標(biāo)用甲醇定容至100 mL，配成 100 mg/L貯備液，臨用前稀釋至1 mg/L，即得。

2.4 供試品溶液制備 取烏雞白鳳丸、復(fù)方雞內(nèi)金片適量，研細(xì)，烘干，精密稱取5.0 g 粉末，置于50 mL 離心管中，精密加入1 mg/L 內(nèi)標(biāo)工作液25 μL，加30 mL含乙腈(1%乙酸)渦旋混勻5 min，超聲提取10 min，加酸性磷酸酶50 μL，在37 ℃下酶解60 min，4 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液，再加入10 mL含1%乙酸的乙腈至殘?jiān)校瑴u旋混勻，離心，合并上清液至50 mL，吸取12 mL，置于15 mL QuEChERS凈化管內(nèi)，渦旋混勻2 min，靜置5 min使樣液與填料充分接觸，4 000 r/min離心2 min，轉(zhuǎn)移10 mL上清液于另一試管中，氮?dú)獯蹈桑尤? mL乙腈溶解殘?jiān)?.22 μm濾膜過濾。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 為了消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，本實(shí)驗(yàn)在烏雞白鳳丸、復(fù)方雞內(nèi)金片中添加標(biāo)準(zhǔn)工作液，使其含量分別為1.0、2.5、5.0、10.0、50.0、100.0 μg/kg，按”2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，定量離子與內(nèi)標(biāo)校正離子峰面積之比為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得方程分別為Y=0.201 1X-0.014 5(R2=0.999 8)、Y=0.219 5X-0.044 8(R2=0.999 4)，在1.0～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。再以 3 倍信噪比(S/N)為檢出限，10倍信噪比(S/N)為定量限，測(cè)得兩者分別為0.3、1.0 μg/kg。

2.5.2 方法回收率、精密度試驗(yàn) 取空白樣品適量，分別以1、2、10倍定量限進(jìn)行方法回收率試驗(yàn)，日內(nèi)每個(gè)添加水平每天平行測(cè)定 6 次，連續(xù)3 d，結(jié)果見表2。

表2 利巴韋林方法回收率、精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 利巴韋林及其代謝物總殘留測(cè)定 采用MRM 模式，利巴韋林有 2個(gè)檢測(cè)通道，每個(gè)通道對(duì)應(yīng)1個(gè)監(jiān)測(cè)離子對(duì)，若 2個(gè)通道中均出現(xiàn)與對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰，并且 2個(gè)子離子相對(duì)豐度與對(duì)照品一致，則可判定檢出該成分。各成分豐度均符合歐盟2002/657/EC 法規(guī)關(guān)于定性判斷時(shí)相對(duì)離子豐度得允許偏差范圍[15]，可判斷這些子離子相對(duì)豐度一致。根據(jù)定量監(jiān)測(cè)離子對(duì)離子流圖中的色譜峰峰面積，采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算7批烏雞白鳳丸、4批復(fù)方雞內(nèi)金片中利巴韋林及其代謝物總殘留，結(jié)果見表 3，可知均未檢出。

表 3 利巴韋林及其代謝物總殘留測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 提取溶劑選擇 采用已報(bào)道的20 g/L三氯乙酸、0.1%甲酸-20 mmol/L乙酸銨/甲醇、乙腈(1%乙酸)對(duì)樣品進(jìn)行提取[16-18]，發(fā)現(xiàn)三氯乙酸提取液在后續(xù)氮吹濃縮時(shí)無法完全吹干，影響后續(xù)QuECHERS凈化便利性；甲酸-乙酸銨/甲醇提取液在氮吹時(shí)有大量粘稠狀物質(zhì)附著于試管底部，嚴(yán)重影響利巴韋林的回收率和精密度，可能是甲醇體系對(duì)樣品中的雜質(zhì)共萃取較多，而凈化過程又無法完全吸附導(dǎo)致；乙酸乙腈與前兩種提取液相比，提取的雜質(zhì)較少，有利于后續(xù)的QuECHERS凈化和氮吹濃縮。因此，本實(shí)驗(yàn)采用乙腈(1%乙酸)作為提取劑。

3.2 凈化條件選擇 采用親水親脂平衡、磺酸基強(qiáng)陽離子、苯硼酸基弱陽離子三種固相萃取小柱和QuECHERS凈化管凈化，發(fā)現(xiàn)三種固相萃取小柱雖然去除雜質(zhì)效果較好，但回收率明顯偏低(HLB柱凈化回收率為40.1%～55.4%，MCX柱為45.1%～59.4%，PBA柱為 59.2%～66.5%)。QuECHERS凈化管內(nèi)的PSA能有效去除烏雞白鳳丸內(nèi)的蜂蜜和復(fù)方雞內(nèi)金片的外包糖衣中的多糖類雜質(zhì)，C18能有效吸附動(dòng)物組織中的油脂等非極性成分[19]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明QuECHERS凈化管的回收率明顯高于固相萃取柱，并且操作簡單，凈化時(shí)間短。

3.3 色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)考察了Waters X-Bridge C18(4.6 mm×50 mm, 2.5 μm)、Agilent ZORBAX SB-Aq(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm)、Waters ACQUITY UPLC BHE HILIC (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)，發(fā)現(xiàn)同一質(zhì)量濃度利巴韋林(1.0 μg/L)的峰面積分別為2 293、1 975、2 265。雖然Waters X-Bridge C18反相柱和Waters ACQUITY UPLC BHE HILIC親水柱響應(yīng)相近，但利巴韋林在Waters X-Bridge C18柱上不易保留，和基質(zhì)中的尿苷類似物難以基線分離，而尿苷類似物相對(duì)分子質(zhì)量均為244.2，在質(zhì)譜ESI+源中的碎片離子質(zhì)荷比與利巴韋林也相同[20]，因此在實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)無法準(zhǔn)確定量。Agilent ZORBAX SB-Aq柱的響應(yīng)與其他兩種柱子相比略低，可能是超高比例水相作為流動(dòng)影響了利巴韋林的離子化[21]。Waters ACQUITY UPLC BHE HILIC親水填料色譜柱起始的水相比例為95%，對(duì)目標(biāo)物的離子化影響小，且通過調(diào)整流動(dòng)相梯度變化確定了“2.1”項(xiàng)下的色譜條件。

將0.5 mg/L利巴韋林對(duì)照品及其13C5內(nèi)標(biāo)溶液以10 μL/min體積流量注入離子源，在正離子檢測(cè)方式下進(jìn)行母離子掃描，得到準(zhǔn)分子離子[M+H]+峰；優(yōu)化各離子對(duì)的去簇電壓、碰撞能量等，得到最佳的二級(jí)質(zhì)譜條件[22]；選擇響應(yīng)值高、基線噪音低的離子對(duì)作為監(jiān)測(cè)離子對(duì)，確定了“2.2”項(xiàng)下的質(zhì)譜條件。

4 結(jié)論

本研究建立酶解-QuEChERS凈化法結(jié)合親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定含雞源成分中成藥中利巴韋林及其代謝物總殘留的分析方法。該方法簡便、快速、靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)，可滿足實(shí)際樣品檢測(cè)的需要，同時(shí)也為其他動(dòng)物源性中成藥的殘留檢測(cè)提供參考。