三棱中含氮類成分的研究

鄧可眾， 劉 聰， 楊 堃， 宗 琪， 王雨晴， 熊 英*

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330004；2.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶 401121)

三棱為黑三棱科黑三棱屬植物黑三棱SparganiumstoloniferumBuch.-Ham.的干燥塊莖, 具有破血行氣、消積止痛之效,用于治療癥瘕痞塊、痛經(jīng)、瘀血經(jīng)閉、胸痹心痛、食積脹痛[1]。三棱含有苯丙素、黃酮、生物堿、三萜以及環(huán)二肽等多種成分[2]，目前有關(guān)苯丙素類(如阿魏酸蔗糖酯衍生物)的研究較多[3-4]，但僅報(bào)道了5個(gè)生物堿[2,5]、3個(gè)環(huán)二肽[6]，其中環(huán)(苯丙氨酸-酪氨酸)的抗凝效果顯著，鋁絡(luò)合生物堿Grailsine-Al-glycoside具有抗HeLa宮頸癌活性[5]，表明該類含氮化合物也是三棱藥效成分。本實(shí)驗(yàn)主要報(bào)道三棱中含氮類成分，以期為其活性成分的闡明、藥材及相應(yīng)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高及開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

Avance HD型核磁共振儀 (德國(guó)Bruker公司，600 MHz)；BS224S電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)；EYELA 1100旋蒸儀(上海愛(ài)朗儀器有限公司)；ZF-1三用紫外分析儀(上海寶山顧村電光儀器廠)；Triple TOF 5600 質(zhì)譜儀(美國(guó)AB SCIEX公司)；Waters 2489 Alliance Separations Module制備HPLC儀(美國(guó)Waters公司)；ODS-AQ色譜柱(20 mm×250 mm，5 μm，日本YMC公司)。Sephadex LH-20(美國(guó)Amersham公司)；XAD-16大孔樹脂(美國(guó)羅門哈斯公司)；GF254薄層硅膠 (青島海洋化工廠)；柱色譜硅膠 (100～200、200～300目，青島海洋化工廠)。純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；色譜純甲醇 (國(guó)藥集團(tuán)上海有限公司)；石油醚、乙酸乙酯、乙醇、二氯甲烷等試劑均為分析純；顯色試劑為10%硫酸乙醇、2%茚三酮試劑以及改良碘化鉍鉀。

三棱于2016年購(gòu)于江西省樟樹藥材市場(chǎng)，經(jīng)重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院楊堃副主任藥師鑒定為黑三棱科黑三棱屬黑三棱SparganiumstoloniferumBuch.-Ham.的干燥塊莖。

2 提取與分離

取三棱干燥塊莖40 kg，粉碎后用95%、65%乙醇依次滲漉提取，減壓濃縮得浸膏2.7 kg，加水混懸，水飽和的石油醚、乙酸乙酯(約30 L)依次萃取，減壓濃縮得石油醚層80 g、乙酸乙酯層180 g。取乙酸乙酯層浸膏180 g，經(jīng)ODS柱以甲醇-水梯度洗脫，得12個(gè)流分，其中第9流分(2.4 g)經(jīng)硅膠柱以二氯甲烷-甲醇梯度洗脫，再經(jīng)制備HPLC甲醇-水(4∶6)純化得化合物1(26.6 mg)。乙酸乙酯萃取后的剩余物采用大孔樹脂柱分離，以水及30%、50%、70%、95%乙醇依次洗脫，30%乙醇洗脫部分經(jīng)開放ODS柱分離以甲醇-水(2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、1∶0)梯度洗脫，得到15個(gè)組分，其中組分2析出結(jié)晶，再經(jīng)重結(jié)晶得化合物8(2.0 mg)；組分3經(jīng)Sephadex LH-20甲醇-水(6∶4)洗脫，得化合物4(10.5 mg)、5(2.0 mg)；組分4經(jīng)Sephadex LH-20以甲醇-水(6∶4)洗脫，再經(jīng)制備HPLC以甲醇-水(2∶8)純化得化合物2(9.2 mg)、3(13.7 mg)；組分5經(jīng)Sephadex LH-20以甲醇-水(6∶4)洗脫，再經(jīng)制備HPLC以甲醇-水(2∶8)純化得化合物6(7.9 mg)。將50%乙醇洗脫部分經(jīng)硅膠柱，以二氯甲烷-甲醇(5∶1、4∶1、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、1∶2、1∶3、1∶5、1∶10、0∶1)梯度洗脫，共得到12個(gè)組分，第2組分經(jīng)Sephadex LH-20柱層析以甲醇-水(6∶4)洗脫，再經(jīng)MCI柱層析以甲醇-水(0∶1～1∶0)梯度洗脫，重結(jié)晶純化得化合物7(180 mg)、9(34 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色油狀物，ESI-MSm/z239.2[M+H]+，分子式C12H17NO4。1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)δ: 9.46 (1H, s, H-6′)，7.01 (1H, d,J=4.2 Hz, H-3′)，6.31 (1H, d,J=4.2 Hz, H-4′)，4.51 (2H, s, H-7′)，4.38 (2H, m, H-4)，3.68 (3H, m, H-5)，3.37 (3H, s, H-8′)，2.38 (2H, t,J=7.2 Hz, H-2)，2.03 (2H, m, H-3)；13C-NMR (CD3OD，150 MHz)δ: 174.2 (C-1)，30.8 (C-2)，26.6 (C-3)，45.0 (C-4)，51.3 (C-5)，133.0 (C-2′)，125.1 (C-3′)，112.1 (C-4′)，140.2 (C-5′)，180.3 (C-6′)，65.5 (C-7′)，57.4(C-8′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]基本一致，故鑒定為methyl4-[formyl-5-(methoxymethyl)-1H-pyrrol-1-yl]butanoate。

化合物2：淡黃色針狀結(jié)晶，ESI-MSm/z：231.1[M-H]-，分子式C13H16N2O2。1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)δ: 1.76 (3H，d，J=7.2 Hz, H-10), 3.04 (1H, m, H-4a), 3.46 (1H, dd,J=4.8, 16.8 Hz, H-4b), 3.98 (1H, m, H-3), 4.73 (1H, d,J=6.6 Hz, H-1), 7.07 (1H, t,J=7.2 Hz, H-6), 7.16 (1H, t,J=7.2 Hz, H-7),7.36 (1H, d,J=7.8 Hz, H-8), 7.50 (1H, d,J=7.8 Hz, H-5);13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)δ: 17.1 (C-10), 24.3 (C-4), 51.1 (C-1), 59.8 (C-3), 107.9 (C-4a), 112.3 (C-8), 119.2 (C-5), 120.6 (C-6), 123.3 (C-7), 127.5 (C-4b), 131.4 (C-8a), 138.6 (C-9a), 173.4 (C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]基本一致，故鑒定為(1S,3S)-1,2,3,4-tetrahydro-1-methyl-β-carboline-3-carboxylic acid。

化合物3：淡黃色針狀結(jié)晶，茚三酮不顯色，薄層原位水解反應(yīng)顯陽(yáng)性，提示為肽類。ESI-MSm/z：275.1[M-H]-，分子式C14H16N2O4。13C-NMR中有2個(gè)酰胺羰基碳的特征信號(hào)δ168.6，168.1，推測(cè)為環(huán)二肽。1H-NMR中的δH7.23 (2H, m, H-9,13), 7.32 (2H, m, H-10,12), 7.26 (1H, m, H-11)為單取代苯環(huán)的5個(gè)質(zhì)子信號(hào)，對(duì)應(yīng)的6個(gè)芳環(huán)碳信號(hào)為δC134.9 (C-8), 130.3 (C-9,13), 128.5 (C-10,12), 127.5 (C-11)，1H-1H COSY譜顯示1個(gè)亞甲基δH2.98 (1H, dd,J=4.8, 13.8 Hz, H-7b)，3.30 (1H, m, H-7a)和1個(gè)次甲基δH4.34 (1H, m, H-3)具有鄰位偶合的關(guān)系，HMBC譜顯示該3個(gè)氫質(zhì)子與苯環(huán)上的δC134.9 (C-8)及酰胺羰基碳δC168.6均有遠(yuǎn)程相關(guān)，以上NMR數(shù)據(jù)與苯丙氨酸[9]十分相似，推測(cè)分子中存在1個(gè)苯丙氨酸片段；此外，1H-NMR中顯示1個(gè)次甲基質(zhì)子信號(hào)δH3.83 (1H, m, H-6)，高場(chǎng)部分還有2個(gè)亞甲基質(zhì)子信號(hào)δH1.32 (1H, m, H-14a), 0.98 (1H, m, H-14b), 1.88 (2H, m, H-15)。1H-1H COSY 譜顯示亞甲基δH1.32，0.98與亞甲基δH1.88和次甲基δH3.82 均有偶合關(guān)系，表明結(jié)構(gòu)中存在-CH-CH2-CH2-基團(tuán)；13C-NMR中除酰胺羰基碳信號(hào)δC168.6外，還可見(jiàn)δC174.8 (C-16)的羧基碳信號(hào)，HMBC 譜顯示2個(gè)羰基碳δC174.8、168.1與亞甲基δH1.32，0.98、亞甲基δH1.88均有遠(yuǎn)程相關(guān)，推測(cè)分子中還存在1個(gè)谷氨酸結(jié)構(gòu)片段，故鑒定為環(huán)(谷氨酸-苯丙氨酸)，該化合物已有人工合成的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)所得為新天然產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

圖1 化合物3結(jié)構(gòu)和主要HMBC與1H-1H COSY相關(guān)Fig.1 Structure and correlations between key HMBC and 1H-1H COSY of compound 3

表1 化合物3的1H-NMR(600 MHz，CD3OD)及13C-NMR(150 MHz，CD3OD)數(shù)據(jù)

化合物4：白色粉末，ESI-MSm/z：261.1[M+H]+，分子式C15H20N2O2。1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)δ: 4.33 (1H, m, H-3), 3.82 (1H, m, H-6), 3.30 (1H,J=3.6, 13.8 Hz, H-7a), 2.94 (1H, dd,J=4.8, 13.8 Hz, H-7b), 7.22 (2H, m, H-9,13), 7.29 (2H, m, H-10,12), 7.21 (1H, m, H-11), 0.88 (1H, m, H-14a), 0.11 (1H, m, H-14b), 1.42(1H, m, H-15), 0.75 (3H, d,J=6.6 Hz, H-16), 0.73 (3H, d,J=6.6 Hz, H-17);13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)δ: 170.7 (C-2), 57.3 (C-3), 169.2 (C-5), 54.1 (C-6), 39.4 (C-7), 136.5 (C-8), 131.6 (C-9,13), 129.7 (C-10,12), 128.6 (C-11), 45.2 (C-14), 24.7 (C-15), 23.4 (C-16), 21.4 (C-17)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]基本一致，故鑒定為環(huán)(亮氨酸-苯丙氨酸)。

化合物5：白色粉末，ESI-MSm/z：180.1[M-H]-，分子式C9H11NO3。1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)δ:6.99 (2H, d,J=8.4 Hz, H-2′,6′), 6.71 (2H, d,J=8.4 Hz, H-3′,5′), 4.03 (1H, t,J=3.6 Hz, H-2), 2.80 (1H, dd,J=3.6, 14.4 Hz, H-3a), 2.42 (1H, dd,J=4.8, 14.4 Hz, H-3b);13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)δ: 170.7 (C-1), 127.1 (C-1′), 132.8 (C-2′,6′), 116.4 (C-3′,5′), 158.1 (C-4′), 57.6 (C-2), 50.5 (C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]基本一致，故鑒定為酪氨酸。

化合物6：白色粉末，ESI-MSm/z：164.2[M-H]-，分子式C9H11NO2。1H-NMR (D2O, 600 MHz)δ: 7.32～7.21 (5H, m, H-2′,3′,4′,5′,6′), 3.88 (1H, m, H-2), 3.17 (1H, m, H-3a), 3.01 (1H, m, H-3b);13C-NMR (D2O, 150 MHz)δ: 173.9 (C-1), 58.0 (C-2), 36.3 (C-3), 135.0 (C-1′), 129.3 (C-2′,6′), 129.1 (C-3′,5′), 127.6 (C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]基本一致，故鑒定為苯丙氨酸。

化合物7：白色針狀結(jié)晶，ESI-MSm/z：130.1[M+H]+，分子式C5H7NO3。1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)δ: 4.27 (1H, dd,J=4.8, 9.0 Hz, H-5), 2.51 (1H, m, H-3a), 2.36 (2H, m, H-4), 2.19 (1H, m, H-3b);13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)δ: 179.7(C-2), 174.3 (C-6), 55.6 (C-5), 29.0 (C-3), 24.7 (C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]基本一致，故鑒定為焦谷氨酸。

化合物8：淡黃色針狀結(jié)晶，ESI-MSm/z：275.1[M-H]-，分子式C15H20N2O3。1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)δ: 4.03 (1H, t,J=3.6 Hz, H-3), 3.45 (1H, m, H-6), 3.10 (1H, dd,J=3.6,14.4 Hz, H-7a), 2.78 (1H, dd,J=4.8, 14.4 Hz, H-7b), 6.79 (2H, d,J=8.4 Hz, H-9,13), 6.51 (2H, dd,J=8.4 Hz, H-10,12), 0.68 (1H, m, H-14a), 0.11 (1H, m, H-14b), 1.22 (1H, m, H-15), 0.65 (3H, d,J=6.6 Hz, H-16), 0.63 (3H, d,J=6.6 Hz, H-17);13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)δ: 168.7(C-2), 55.6 (C-3), 167.1(C-5), 52.1(C-6), 37.4(C-7), 125.1(C-8), 130.8 (C-9,13), 114.4 (C-10,12), 156.1 (C-11), 43.2 (C-14), 22.7 (C-15), 21.4 (C-16), 20.3(C-17)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]基本一致，故鑒定為環(huán)(亮氨酸-酪氨酸)。

化合物9：白色粉末，ESI-MSm/z：268.1[M+H]+，分子式C10H13N5O4。1H-NMR (DMSO-d6, 600 MHz)δ: 8.23 (1H, s, H-8)，8.02 (1H, s, H-2)，7.26 (2H, s, NH2)，5.74 (1H, d,J=6.0 Hz, H-1′), 4.48 (1H, dd,J=11.4,6.0 Hz, H-2′)，4.02 (1H,brs, H-3′), 3.84 (1H, d,J=3.6 Hz, H-4′), 3.55 (1H, m, H-5′a), 3.45 (1H, m, H-5′b), 5.36 (1H, d,J=6.0 Hz, 2′-OH), 5.32 (1H,brs, 3′-OH), 5.10 (1H, d,J=4.2 Hz, 5′-OH)；13C-NMR (DMSO-d6，150 MHz)δ: 153.8 (C-2), 150.4 (C-4), 120.8 (C-5), 155.6 (C-6), 141.4 (C-8), 89.3 (C-l′), 74.9 (C-2′), 72.1 (C-3′), 87.3 (C-4′), 63.0 (C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]基本一致，故鑒定為腺苷。

4 討論

前期課題組對(duì)三棱粗提物進(jìn)行家兔體外APTT(活化部分凝血酶原時(shí)間)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)三棱石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位及水部位具有較好的抗凝活性，時(shí)間分別為16.4、22.0、21.7、27.5 s(空白為13.3 s)，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)乙酯部位和乙酸乙酯萃取后剩余的極性較大部位(正丁醇、水)化學(xué)成分進(jìn)行研究，從中分離鑒定了9個(gè)含氮化合物，其中化合物3為新天然產(chǎn)物，1～2、4～7為首次從該屬植物中分離得到。環(huán)二肽類成分的薄層層析直接采用茚三酮試劑無(wú)法顯色，參考文獻(xiàn)[15]的原位水解法即先用濃鹽酸水解，然后再噴灑茚三酮試劑的顯色方法。生物堿、環(huán)二肽均為三棱中活性成分類型[5-6]，本實(shí)驗(yàn)為活血中藥三棱藥效物質(zhì)的全面闡明提供了化學(xué)成分基礎(chǔ)。