膠質(zhì)母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)相關(guān)基因的篩選、表達(dá)和臨床預(yù)后分析

林 藝，王 策，康 勛，康 莊，陳 峰，江 波，李文斌

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院腫瘤綜合治療中心，北京 100070

腦膠質(zhì)瘤是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性惡性腦腫瘤之一，約占原發(fā)性腦腫瘤的30%，原發(fā)惡性腦腫瘤的80%［1］。高級別腦膠質(zhì)瘤［世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）Ⅲ～Ⅳ級］惡性程度高、侵襲性強(qiáng)，尤其膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中位總生存期為12～15個月，容易復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)后患者的中位總生存期為3～6個月［2-3］。因此，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)是臨床棘手的問題。突破的關(guān)鍵在于深入探究膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，尋找復(fù)發(fā)相關(guān)的分子標(biāo)志物，針對相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)化研究。在神經(jīng)腫瘤領(lǐng)域，基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）和中國腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜（Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA）數(shù)據(jù)庫已經(jīng)實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)公開，為膠質(zhì)瘤相關(guān)的標(biāo)志物研究提供了新的途徑［4-5］。本研究通過對GEO、癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和CGGA等公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行挖掘，篩選膠質(zhì)母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)相關(guān)基因，并分析表達(dá)、臨床病理學(xué)參數(shù)及臨床預(yù)后的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤相關(guān)的基因芯片數(shù)據(jù)來源

基因芯片數(shù)據(jù)來源于GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫，檢索策略為Recurrent［All Fields］AND (Glioblastoma［MeSH Terms］OR Glioblastoma［All Fields］）。研究納入標(biāo)準(zhǔn)為采用手術(shù)切除樣本（原發(fā)腫瘤和復(fù)發(fā)腫瘤均大于10例）進(jìn)行RNA檢測的數(shù)據(jù)集，排除標(biāo)準(zhǔn)為采用細(xì)胞培養(yǎng)或動物模型（Xenograft）等處理過的樣本研究。數(shù)據(jù)集GSE62153和GSE58399符合研究標(biāo)準(zhǔn)，包含膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者組織標(biāo)本的樣本，表達(dá)數(shù)據(jù)和實(shí)驗平臺等信息見表1。研究通過R軟件，下載了標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)數(shù)據(jù)，利用Biobase、GEOquery和limma等數(shù)據(jù)包，尋找膠質(zhì)母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)相關(guān)的差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG），并以P＜0.05，logFC＞1或logFC＜-1作為篩選條件進(jìn)行后續(xù)分析。

表1 研究入選GEO數(shù)據(jù)集合信息Tab.1 Information about the GEO data and series

1.2 生物信息相關(guān)分析

基因功能及通路分析：利用R工具“org.Hs.eg.db”“clusterProfiler”“enrichplot”對DEG進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號富集分析。GO分析包括生物過程（biological process）、細(xì)胞組成（cellular component）和分子功能（molecular function）3個部分。利用STRING工具構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，尋找蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系。Hub基因的篩選通過PPI網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape中的“Hub”計算生成。生存分析、表達(dá)分析使用GEPIA和CGGA數(shù)據(jù)庫相關(guān)在線Survival分析工具。STRING、GEPIA和CGGA數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址見表2。

表2 生物信息相關(guān)在線分析工具Tab.2 Databases related to bioinformatics analysis

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用R4.0.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，使用limma數(shù)據(jù)包中的Studentt檢驗方法篩選DEG。在GO通路分析中，數(shù)據(jù)間差異比較采用ANOVA檢驗。KEGG中選擇差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行研究。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率的比較采用log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。癌組織和癌旁組織表達(dá)量差異采用配對t檢驗用來比較，χ2檢驗比較臨床病理學(xué)參數(shù)組間差異（n＜5時行連續(xù)校正χ2檢驗）。

2 結(jié) 果

2.1 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)相關(guān)基因的生物信息學(xué)篩選和富集分析

GSE62153數(shù)據(jù)集納入病例43例，包括25例原發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和18例復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病例。GSE58399數(shù)據(jù)集納入病例105例，包括72例原發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和33例復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。GSE62153數(shù)據(jù)集篩選到40個DEG，上調(diào)基因34個，下調(diào)基因6個。GSE58399數(shù)據(jù)集篩選到19個DEG，上調(diào)基因16個，下調(diào)基因3個。GO功能分析結(jié)果提示GSE62153的DEG主要參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、髓鞘、肌動蛋白結(jié)合及中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成等11個生理過程（表3）。而GSE58399的DEG主要參與上皮細(xì)胞遷移的正調(diào)控（表4）。KEGG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析結(jié)果顯示，GSE62153和GSE58399的DEG存在共同富集—組氨酸代謝（圖1，表4）。

圖1 GSE62153數(shù)據(jù)集KEGG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集Fig.1 Enrichment of KEGG signaling pathway in GSE62153 dataset

表3 GSE62153 GO功能分析結(jié)果Tab.3 GSE62153 GO function analysis

表4 GSE58399 GO功能及KEGG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析結(jié)果Tab.4 GSE58399 GO function and KEGG signal pathway enrichment analysis

2.2 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及Hub基因挖掘

PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建基于GSE62153和GSE58399篩選出來的DEG，通過STRING數(shù)據(jù)庫，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)，共有20個蛋白分子構(gòu)建成為核心相互作用網(wǎng)絡(luò)，相關(guān)基因為MOG、ASPA、ERMN、PTGDS、MOBP、CLDN11、NKX6-2、CNDP1、SH3GL2、OPALIN、KLK6、MYBPC1、SH3G L3、P LP1、TME M125、AK R1C3、CARNS1、HLA-DPA1、HHATL和SEPP1基因（圖2）。而后利用Cytscape軟件對構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析和Hub基因挖掘，結(jié)果篩選出10個Hub基因，分別為MOBP、OPALIN、ERMN、PLP1、MOG、CLDN11、ASPA、TMEM125、KLK6和NKX6-2基因（圖3）。為進(jìn)一步獲得膠質(zhì)母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)的關(guān)鍵核心基因，通過Venn圖工具取出GSE62153和GSE58399芯片的DEG的交集，結(jié)果提示共有6個DEG（圖4）。最后再選擇排名前5的Hub基因與GSE62153和GSE58399篩選出來的DEG取交集，結(jié)果提示共有3個基因，分別為ERMN、MOG和MOBP基因。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network

圖3 Hub基因篩選圖Fig.3 Bioinformatics screening of Hub gene

圖4 DEG與Hub基因韋恩圖Fig.4 Venn diagram of DEG and Hub gene

2.3 ERMN、MOG和MOBP基因mRNA的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系

為分析ERMN、MOG和MOBP基因在膠質(zhì)瘤中的預(yù)后價值，研究通過GEPIA進(jìn)行生存分析，Kaplan-Meier法結(jié)果顯示，在TCGA數(shù)據(jù)庫676例膠質(zhì)瘤病例中，ERMN、MOG和MOBP基因高表達(dá)者預(yù)后均優(yōu)于低表達(dá)組，總生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖5）。為進(jìn)一步驗證該生存分析結(jié)果，研究進(jìn)一步利用CGGA mRNA芯片數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示，ERMN、MOG和MOBP基因與膠質(zhì)瘤患者的總生存率均顯著相關(guān)（P＜0.000 1，圖5），ERMN、MOG和MOBP基因高表達(dá)組預(yù)后優(yōu)于低表達(dá)組。

圖5 基于TCGA和CGGA膠質(zhì)瘤病例的生存分析Fig.5 Survival analysis of TCGA and CGGA database

2.4 ERMN、MOG和MOBP基因mRNA在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)

通過GEPIA分析ERMN、MOG和MOBP基因在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況。ERMN、MOG和MOBP基因在低級別膠質(zhì)瘤和對照組織之間的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和對照組織之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖6）。ERMN、MOG和MOBP基因在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織內(nèi)的表達(dá)水平低于對照組織。研究進(jìn)一步通過CGGA數(shù)據(jù)庫分析ERMN、MOG和MOBP基因在腫瘤不同分級（WHOⅡ、Ⅲ和Ⅳ級）組織間的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，ERMN、MOG和MOBP基因在不同分級組織內(nèi)的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），且隨著膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的級別升高，ERMN、MOG和MOBP基因的表達(dá)逐漸降低（圖6）。

2.5 ERMN、MOG和MOBP基因mRNA表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

通過提取CGGA數(shù)據(jù)庫的臨床數(shù)據(jù)和表達(dá)譜數(shù)據(jù)，進(jìn)一步分析ERMN、MOG和MOBP基因的表達(dá)情況與膠質(zhì)瘤臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果顯示，ERMN、MOG和MOBP基因的表達(dá)與WHO分級、異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）狀態(tài)和臨床病理學(xué)參數(shù)相關(guān)（P＜0.001，表5）。MOBP基因的表達(dá)與患者年齡（P＜0.001）和MGMT基因甲基化狀態(tài)相關(guān)（P=0.022，表5）。

表5 ERMN、MOG和MOBP基因mRNA的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系Tab.5 Association between ERMN,MOG and MOBP genes expressions and the patient's clinicopathological characteristics in patients with glioma（n）

3 討 論

膠質(zhì)瘤是一類原發(fā)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常見惡性腫瘤。盡管在過去的幾十年中，其治療已有很大進(jìn)展，但是大多數(shù)患者的臨床結(jié)局仍然很差。Nieder等［6］報道惡性膠質(zhì)瘤患者復(fù)發(fā)后生存時間為6～8個月，而出現(xiàn)第2次進(jìn)展患者的中位生存期僅為14周。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者總體預(yù)后差，即使接受手術(shù)聯(lián)合放療和替莫唑胺化療標(biāo)準(zhǔn)治療方案治療，復(fù)發(fā)率和死亡率仍較高。Stupp方案延長了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的總生存期和無進(jìn)展生存期，但總生存期不足15個月，而5年生存率也低于10%［7］。

文獻(xiàn)［8］報道，復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者接受挽救療法［化療和（或）再次放療］的中位生存期為5.3個月。一項納入167例復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的Ⅱ期臨床試驗［9］，將患者隨機(jī)分入貝伐珠單抗單藥治療和聯(lián)用伊立替康組，總生存期分別為9.2和8.7個月。一項病例系列研究［10］顯示，Ⅳ級患者接受立體定向放療（stereotactic radiosurgery，SRS）后的中位無進(jìn)展生存期為4.6個月。復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞患者應(yīng)用貝伐珠單抗聯(lián)合SRS（n=20），患者的6個月無進(jìn)展生存率達(dá)65%［11］。2006—2009年一項復(fù)發(fā)膠母細(xì)胞瘤Ⅲ期臨床試驗［12］將237例復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者按l∶1隨機(jī)分配接受單純電場療法治療組（n=120）或最優(yōu)化療組（n=117），結(jié)果顯示，腫瘤治療電場組與最優(yōu)化療組的中位總生存期分別為6.6和6.0個月（P=0.27），中位無進(jìn)展生存期分別為2.2和2.1個月（P=0.16）。復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤尚無標(biāo)準(zhǔn)治療方案，美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南推薦考慮臨床試驗。

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤具有高度異質(zhì)性，其進(jìn)化過程表現(xiàn)出高度分支化特征，按照分支模式及進(jìn)化速率的估算，與復(fù)發(fā)相關(guān)的克隆往往在診斷前已存在。接受替莫唑胺治療的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中有17%（17/100）復(fù)發(fā)并伴有高突變腫瘤，但未接受替莫唑胺治療的患者中沒有發(fā)生高突變［13］。Nandeesh等［14］研究表明，復(fù)發(fā)性腫瘤中SOX2表達(dá)的顯著增加可能表明這些腫瘤中存在具有干樣特性的未分化細(xì)胞，這種改變可能增加的侵襲性和干性，抵抗放療和化療。Zhang等［15］將23例患者切除的標(biāo)本進(jìn)行了外顯子組測序，該組病例均為初始低級別膠質(zhì)瘤，而后出現(xiàn)復(fù)發(fā)性腫瘤，在43%的病例中，至少有一半的初始腫瘤突變在復(fù)發(fā)時未被發(fā)現(xiàn)，包括TP53、ATRX、SMARCA4和BRAF中的驅(qū)動突變，10例接受替莫唑胺治療的患者中有6例腫瘤發(fā)展為高級別膠質(zhì)瘤，復(fù)發(fā)腫瘤發(fā)生超突變，并帶有TMZ誘導(dǎo)突變特征，即視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（retinoblastoma，RB）和蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian targets of rapamycin，mTOR）的驅(qū)動突變［15］。Kim等［16］通過采用多基因組學(xué)方法分析初次和再次手術(shù)的26對配對腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本，證實(shí)復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤獲得了大量新的基因突變。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)的兩種腫瘤進(jìn)化途徑：大多數(shù)局部復(fù)發(fā)的腫瘤共有大多數(shù)初始腫瘤突變，與線性進(jìn)化一致。在遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)時，初始和復(fù)發(fā)腫瘤之間的遺傳差異導(dǎo)致關(guān)鍵膠質(zhì)母細(xì)胞瘤驅(qū)動基因/途徑改變的變化。本研究所選用兩個數(shù)據(jù)集分析產(chǎn)生的DEG交集并不多，這可能是因為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)后驅(qū)動復(fù)發(fā)增長的基因改變較多，與初始腫瘤不同。

本研究篩選出了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)相關(guān)的關(guān)鍵基因3個，即ERMN、MOG和MOBP基因。ERMN是參與髓鞘形成過程的必需基因，而少突膠質(zhì)細(xì)胞主要是形成髓磷脂的細(xì)胞，是葉酸代謝中斷的主要靶標(biāo)［17-19］。在少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟過程中，髓鞘特異性蛋白，如蛋白脂蛋白（protein lipoprotein，PLP）和髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）在少突膠質(zhì)細(xì)胞中依次表達(dá)。MOG則是一種表達(dá)在髓鞘和少突膠質(zhì)細(xì)胞膜的表面糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員。MOG最先由Linnington等［20］于1984年利用小鼠單抗確定并命名，其特異性表達(dá)在少突膠質(zhì)細(xì)胞和髓鞘表面的I型膜結(jié)合糖蛋白位于髓鞘結(jié)構(gòu)的最外層［21］。在脫髓鞘病變的急性、亞急性及緩解期，MOG抗體均可出現(xiàn)［22］。MOBP是構(gòu)成中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂的第三大蛋白質(zhì)。像髓磷脂堿性蛋白一樣，MOBP主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂的致密線，提示在髓磷脂的緊實(shí)或穩(wěn)定中起作用。

通過本次生物信息學(xué)分析，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)GSE62153和GSE58399的DEG KEGG通路富集分析結(jié)果存在交集—組氨酸代謝［23］。組氨酸代謝途徑可調(diào)節(jié)甲氨蝶呤藥物敏感性，提示甲氨蝶呤鞘內(nèi)注射化療對復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療價值可能源自于組氨酸代謝。甲氨蝶呤是目前臨床廣泛應(yīng)用的抗腫瘤化療藥物，主要適用于白血病和某些其他類型的實(shí)體腫瘤，特別是原發(fā)性中樞神經(jīng)淋巴瘤。大劑量甲氨蝶呤是原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤的首選治療方案。Ommaya囊作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的常用輔助裝置，臨床常用于腦室內(nèi)引流與給藥，尤其顱內(nèi)感染和顱內(nèi)腫瘤的局部用藥。1976年Romodanov等［24］對52例惡性腦腫瘤患者進(jìn)行甲氨蝶呤鞘內(nèi)注射能夠讓腫瘤縮小，病理形態(tài)學(xué)分析提示，其對惡性腦腫瘤具有明顯的破壞作用。1991年Nierenberg等［25］對5例多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者給予甲氨蝶呤治療，尸檢發(fā)現(xiàn)甲氨蝶呤治療患者腫瘤組織出現(xiàn)液化性壞死。李豐展等［26］分析了甲氨蝶呤經(jīng)Ommaya 鞘內(nèi)注射間質(zhì)化療聯(lián)合同步放化療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，發(fā)現(xiàn)其復(fù)發(fā)時間為（13.61±3.83）個月，中位生存時間為2.10個月（1.35～2.70個月），優(yōu)于常規(guī)放化療的（10.31±2.20）個月和1.55個月（1.30～2.10個月）。我們團(tuán)隊前期基礎(chǔ)研究［27］結(jié)果顯示，甲氨蝶呤通過下調(diào)RAS/MAPK/MYC/CD47信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87生長。甲氨蝶呤鞘內(nèi)注射治療復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者在臨床應(yīng)用中取得了一定的效果，未來應(yīng)進(jìn)一步深入研究其具體機(jī)制。

綜上所述，生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，ERMN、MOG和MOBP基因的表達(dá)改變與膠質(zhì)瘤的臨床病理學(xué)參數(shù)及患者預(yù)后有關(guān)，有可能成為甄別復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的標(biāo)志物。本研究所利用的開放數(shù)據(jù)庫病例涵蓋東、西方膠質(zhì)瘤人群，預(yù)后分析結(jié)果顯示，東西方人群的基因類型并沒有顯著差異。ERMN、MOG和MOBP基因的預(yù)后預(yù)測價值還需要進(jìn)一步利用中國的病例樣本在蛋白水平進(jìn)行驗證，以期尋找到診療標(biāo)志物，并對其功能和機(jī)制進(jìn)行研究，為膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)診斷、預(yù)后預(yù)測提供線索和依據(jù)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。