環(huán)孢素（微乳型）滴眼液抑菌劑抑菌效力研究

楊熠倩，馬一平

（天津市眼科醫(yī)院，天津 300020）

環(huán)孢素滴眼液的適應證以結膜干燥綜合癥為主，同時對眼角膜移植術（OOKP）術后免疫排斥具有效防治作用，療效顯著［1］。為滿足臨床不同需要，本院自制環(huán)孢素（微乳型）滴眼液，而滴眼液尤其是多效量滴眼液，若其缺乏充分抗菌效能，一定要添加抑菌劑來抑制滴眼液存放與應用期間沾染的微生物。現(xiàn)今臨床應用的多數(shù)滴眼液皆加入了抑菌劑，最常用到的為羥苯酯類：羥苯甲酯（methylparaben）、羥苯乙酯（ethylparoben）、羥苯丙酯（propylparaben）和羥苯丁酯（butylparaben），其中羥苯乙酯對角膜結膜的毒性最小，并且對細菌、真菌的抑菌效能都很強，在對抑菌劑進行選擇方面，因同時具備抑菌功能與毒性效應，故需格外重視其于制劑內(nèi)的處方量，所以應保證所選抑菌劑于滴眼液有效期內(nèi)具備充分抑菌性能，由此檢測抑菌劑的抑菌效力，找到適宜比例的抑菌劑用量。本文依照《中國藥典》中抑菌劑效力檢查法指導原則針對添加0.10%、0.07%和0.05%羥苯乙酯的環(huán)孢素滴眼劑的抑菌效力進行考查，分析其抑菌劑加入的科學性［2］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高壓蒸汽滅菌器（日本Hirayama儀器制造公司）；1300 Series A2型二級型生物安全柜（Thermo Fisher Scientific公司）；MJ－150－112真菌培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；KB115型恒溫培養(yǎng)箱（德國Binder公司）。

1.2 菌種 此項研究中，所涉及菌株的傳代次數(shù)應控制為≤5代（取自菌種存儲中心的干燥冷凍菌種是第0代）。借助適當?shù)木N存儲技術來存儲試驗用菌種，從而對實驗菌株的生物學性能起到有效保障。大腸埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44102］、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26003］、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（B）10104］、白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98001］、黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F）98003］，皆取自中國食品藥品檢定研究院，在菌株傳代數(shù)方面，皆是第3代［3］。

1.3 培養(yǎng)基及稀釋劑 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（STA）、氯化鈉（NaCl）-蛋白胨緩沖溶液、0.9%滅菌NaCl溶液（內(nèi)含0.05%聚山梨酯80），上述各試劑皆由中國藥品生物制品檢定所提供，同時基于2020年版《中國藥典》所示配制、滅菌，所用方法為高壓蒸氣滅菌法，最后分裝。

1.4 供試品 環(huán)孢素（微乳型）滴眼液（批號20200420），由天津市眼科醫(yī)院制劑室生產(chǎn)。

2 試驗方法

2.1 菌液的制備 向胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（STA）或胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）內(nèi)接種銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物，于35℃進行24 h培養(yǎng)，再添加適量的無菌NaCl溶液（0.9%），洗脫處理瓊脂表面的培養(yǎng)物，然后將菌懸液吸入到滅菌試管中，添加適量無菌NaCl溶液（0.9%），同時借助比濁法，完成菌懸液（菌含量為108cfu/ml）的制備［4］。

向沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）或 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）內(nèi)接種白色念珠菌，于25℃進行48 h培養(yǎng)。通過適量滅菌NaCl溶液（0.9%）洗脫處理瓊脂表面的培養(yǎng)物，然后將菌懸液吸入到滅菌試管里，再加入適量滅菌NaCl溶液（0.9%），同時借助比濁法，完成菌懸液（菌含量為108cfu/ml）的制備。

向沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）斜面上接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物，置于25℃進行7 d培養(yǎng)，再添加5 ml的0.9%滅菌NaCl溶液（內(nèi)含0.05%聚山梨酯80），洗脫處理孢子。然后將孢子懸液吸入到滅菌試管里，通過0.9%滅菌NaCl溶液（內(nèi)含0.05%聚山梨酯80）完成孢子懸液（孢子含量為50~100 cfu/ml）的制備。并借助平皿法，對1 ml菌懸液的菌量展開測定［5］。

將已完成配制的菌懸液移至室溫中，放置時間不得超過2 h，如果存放溫度為2~8℃，那么存放時間不得超過1 d。可將黑曲霉孢子懸液存放于2~8℃溫度條件下，應保證于已證實的貯存期內(nèi)應用。

2.2 培養(yǎng)基的適用性檢查 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌各100 cfu，并分別向滅菌平皿內(nèi)轉移，隨即馬上傾注胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌皆安排2個平皿的平行制備，充分混合，凝固，再移至35℃環(huán)境中，培養(yǎng)2 d，計數(shù)，取白色念珠菌、黑曲霉菌皆100 cfu，移至滅菌平皿內(nèi)，馬上傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌皆安排2個平皿的平行制備，充分混合，凝固，再移至25℃環(huán)境中培養(yǎng)3 d，計數(shù)。此外，通過相應對照培養(yǎng)基取代被檢培養(yǎng)基開展以上試驗，結果見表1。由此發(fā)現(xiàn)，被檢培養(yǎng)基上的平均菌落量≥對照培養(yǎng)基上70%的平均菌落量，同時在菌落形態(tài)大小上，雙方相當，可見被檢培養(yǎng)基具備適用性［6］。

表1 適用性試驗結果

2.3 供試品接種 抑菌劑效力與試驗用容器特征（諸如體積、形狀、材質(zhì)與封口形式等）可能存在聯(lián)系。所以，當供試品各包裝容器裝量可充分滿足試驗用，且容器便于完成試驗菌液、取樣、混合等無菌操作時，通常直接向供試品原包裝容器內(nèi)種植試驗菌。向無菌容器內(nèi)放置供試品時，應包裝此容器材質(zhì)對供試品諸如吸附性等特性不產(chǎn)生影響，尤其需防止對供試品酸堿度產(chǎn)生影響，酸堿度可在較大程度上影響抑菌劑活性，并且容器口徑大小需方便供試品混勻與進出操作。

取包裝完整的供試品5份，每份供試品為2 ml的環(huán)孢素（微乳型）滴眼液，分別將含菌量為106cfu/ml金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、大腸埃希菌和黑曲霉菌各20 μl接種于5個供試品中，徹底混合，保證試驗菌均勻分布于供試品內(nèi)［7］，在試驗過程中，應將供試品放置于25℃遮光存放，存放溫度波動需盡量最小化，同時避免污染的發(fā)生。

2.4 培養(yǎng)和計數(shù) 除了特定要求，在培養(yǎng)時間上，酵母菌與霉菌為120 h，即5 d；細菌為72 h，即3 d。逐日查看菌落生長狀況；對菌落量進行統(tǒng)計。如有必要，應妥善增加培養(yǎng)時間到7 d，再統(tǒng)計菌落量，同時報告。對于平板上顯示片狀生長狀態(tài)的菌落，無需統(tǒng)計。待完成菌落數(shù)的點計，對各稀釋級供試液的菌落量均值展開求解，基于菌量報告規(guī)則報告菌量。如果同稀釋級2個平皿的平均菌落量≥15，那么2個平皿的菌落量相差倍數(shù)應低于1倍［8］。

胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基用于細菌計數(shù)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于酵母菌與霉菌計數(shù)；酵母菌計數(shù)還可應用YPD（酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）。當面對特殊狀況，如果胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上有酵母菌與霉菌生長，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上有細菌生長，那么需各自點計酵母菌與霉菌、細菌菌落量。再將胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上的酵母菌與霉菌或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上的細菌量，與沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的酵母菌與霉菌或胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的細菌量展開對比，將菌落量多的培養(yǎng)基內(nèi)的菌量當做計數(shù)結果［9］。

2.5 菌數(shù)報告規(guī)則 霉菌最好選擇菌落數(shù)均值＜100 cfu、酵母菌與細菌的最好選取菌落數(shù)均值＜300 cfu的稀釋級，當做菌數(shù)報告（有效數(shù)字應取2位）的依據(jù)。通過最多的菌落數(shù)均值與稀釋倍數(shù)相乘所得值，對10 cm2、1 g或1 ml供試品內(nèi)所含菌量進行報告。

倘若不同稀釋級的平板皆未長有菌落，或只最小稀釋級的平板長有菌落，但菌落數(shù)均值＜1時，通過小于1與最小稀釋倍數(shù)相乘所得值對菌數(shù)做出報告。

基于菌數(shù)測量結果，求解1 ml（g）供試品各被測菌加入量，還有不同間隔時間的菌量，同時完成向lg值的換算［10］。

2.6 設計試驗條件 平行操作以下3組含有不同濃度抑菌劑的環(huán)孢素滴眼液：A組含0.10%的羥苯乙酯，B組含0.07%的羥苯乙酯，C組含0.05%的羥苯乙酯，裝量均為10 ml，分別接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉孢子懸液，同上述方法加菌液分別在6 h、24 h、7 d、14 d和28 d各個時間點進行測試［11］。

2.7 抑菌效力評價標準 環(huán)孢素滴眼液抑菌效力評價標準按照《中國藥典》2020年版四部通則1121“抑菌效力檢查法”中眼用制劑的抑菌效力判斷標準。該判斷標準分為A、B兩個標準，“A”所指為應實現(xiàn)的抑菌效力標準，若遇特殊狀況，如抑菌劑和AR風險增大可能相關，那么應滿足“B”的抑菌效力條件［12］，見表2。

表2 《中國藥典》2020年版眼用制劑抑菌效力判斷標準

3 結果

參照《中國藥典》2020年版四部通則1121抑菌效力檢查法對眼用制劑抑菌效力進行判斷。試驗結果顯示，對于真菌與細菌，A組、B組皆表現(xiàn)較強的抑制效能。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌以及黑曲霉在抑菌劑濃度上調(diào)的情況下皆顯示大幅降低表現(xiàn)，皆可實現(xiàn)“A”抑菌效力標準，同2020年版《中國藥典》所示判斷標準相符，均符合規(guī)定。C組真菌抑菌效力能達到“A”，細菌抑菌效力在“B”上，據(jù)文獻報道羥苯乙酯是比較安全優(yōu)良的抑菌劑未報道有增加不良反應的風險規(guī)定特殊情況下，如抑菌劑和AR發(fā)生率提高可能相關，那么最低應滿足“B”的抑菌效力條件，所以C組只能作為最低有效濃度，據(jù)文獻報道，抑菌劑在樣品儲存過程中，會隨時間逐漸增加抑菌性逐漸減弱，所以不會首選C組。故應選擇B組的濃度作為環(huán)孢素滴眼液的處方濃度［13］。見表3。

表3 環(huán)孢素（微乳型）滴眼液抑菌效力試驗結果

4 討論

倘若藥物缺乏充分的抗菌功能，那么需基于制劑特性（諸如水制劑）加入適當?shù)囊志鷦?，從而避免正常存放以及應用期間制劑可能出現(xiàn)微生物污染與滋生現(xiàn)象，特別是多劑量包裝的制劑，防止受到藥物微生物變質(zhì)與污染影響，傷及病人［14］。向環(huán)孢素（微乳型）滴眼液內(nèi)加入的抑菌劑是羥苯乙酯，此物質(zhì)具備良好穩(wěn)定性，不管是酸性介質(zhì)，還是堿性介質(zhì)，皆具有效性，可在較強程度上抑制霉菌，同時對銅綠假單胞菌存在良好的抑菌防腐表現(xiàn)，使得滴眼液質(zhì)量得到有效保障。并且其對角膜結膜的毒性最小。然而用量不足，達不到有效抑菌濃度，用量過大又易引起不良反應，此外，諸多因素皆與抑菌劑的抑菌效力相關，影響抑菌劑有效性的因素為溶液的pH、容器及包裝等。因此對藥物中所加抑菌劑的抑菌效力進行測定非常重要。此次研究借鑒2020年版《中國藥典》所示環(huán)孢素（微乳型）滴眼液內(nèi)羥苯乙酯抑菌劑3個濃度水平開展效力測定，確定最佳濃度，對醫(yī)療機構更為有效地控制制劑質(zhì)量有著積極作用。