調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析肺栓塞患者外周血中l(wèi)ncRNAs、miRNAs和mRNAs的差異表達(dá)①

何麗麗，曹國磊，馬榮輝，唐 樂，佟玉珊，李 宏，羅 琴

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院呼吸神經(jīng)內(nèi)科，烏魯木齊 830011）

肺栓塞綜合征是指體循環(huán)的各種栓子脫落阻塞肺動脈及其分支引起肺循環(huán)障礙的臨床病理生理綜合征，最常見的肺栓子為血栓，由血栓引起的肺栓塞也稱肺血栓栓塞癥（Pulmonary thromboembolism，PTE）[1]。與缺血性心臟病相比，PTE是第三大常見的心血管死亡原因[2]。非編碼RNA是指序列上缺乏明顯的開放讀碼框，不具有編碼蛋白能力的一類RNA，包括長鏈非編碼RNA(lncRNAs)、環(huán)狀RNA(CircRNAs)和微小RNA(MiRNAs)，其不能編碼蛋白，這一類RNA能夠在低氧環(huán)境下受低氧誘導(dǎo)因子（HIF）調(diào)控，參與慢性血栓栓塞性肺動脈高壓的形成[3]。lncRNAs與miRNAs均在缺氧調(diào)節(jié)中有重要作用，近年來有研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs[4]和miRNAs[5]在PTE患者血清中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，其作用機(jī)制尚不清楚。本研究采用高通量測序的方法探究肺栓塞患者及健康人血液中的差異表達(dá)基因（DEGs），進(jìn)行l(wèi)ncRNAs、miRNAs和mRNAs的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析，篩選可能的作用分子，為PTE的后續(xù)研究及診療策略奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料以2019年1月-12月新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院呼吸神經(jīng)內(nèi)科收治的4例肺栓塞患者為PTE組，男女各2例，年齡53～58歲，平均年齡（55.00±2.16）歲，選擇同期4例健康體檢者為對照組，男女各2例，年齡50～58歲，平均年齡（52.50±3.78）歲，兩組患者基本資料具有可比性（P＞0.05）。本研究通過新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會審批（批準(zhǔn)號：2019BC007），受試者均知情同意且簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)[1]

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)PTE組納入標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)肺動脈造影明確肺動脈存在血栓；對照組選取標(biāo)準(zhǔn)，選取與PTE組性別比例、年齡相當(dāng)，相同地區(qū)健康人群作為對照組。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)PTE組排除標(biāo)準(zhǔn):有心腦血管疾病史、內(nèi)分泌疾病史、免疫疾病史、惡性腫瘤病史，既往有血栓栓塞性疾病病史；對照組排除標(biāo)準(zhǔn):既往有心腦血管、血液、內(nèi)分泌、肝腎疾病、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、哮喘等病史的人群。

1.3 方法

1.3.1 樣本制備及總RNA提取采用BD 762165 Blood RNA Tube全血RNA采血管采集受試者外周靜脈血，取2.5 mL至RNA保存管，30次/min渦旋30 s，置于-80℃冰箱穩(wěn)定保存。按TRIzol? Reagent試劑盒說明操作測定血漿中的總RNA。的總RNA。

1.3.2 illumina轉(zhuǎn)錄組測序選擇8個RNA樣本采用HiSeq2500(美國Illumina平臺)測序，分別對lncRNAs（鏈特異性建庫）、miRNAs（小RNA文庫）進(jìn)行建庫，通過片段去除、鏈合成、端部修理和A-尾部及適配器連接、PCR擴(kuò)增、群集生成、質(zhì)量控制后，進(jìn)行綜合測序。

1.3.3 篩選DEGs采用R語言對DEG軟件包數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并進(jìn)行t檢驗(yàn)。用DEG軟件包對差異表達(dá)的lncRNAs、miRNAs、mRNAs進(jìn)行分析，將P值設(shè)置為0.05，同時進(jìn)行差異表達(dá)的miRNAs、mRNAs相關(guān)性分析。

1.3.4 DEGs的代謝/信號通路（KEGG）和基因本體（GO）富集分析對基于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的差異表達(dá)基因，進(jìn)行富集分析。使用KOBAS軟件對差異表達(dá)的miRNA同時進(jìn)行疾病、KEGG和GO的分析，其中GO包含了生物進(jìn)程（BP）、細(xì)胞成分和分子功能（MF）3部分。

1.3.5 靶基因預(yù)測以mRNA的3‘UTR區(qū)域作為靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫，使用靶基因預(yù)測軟件miRanda（3.3a）對差異miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測，以明確靶基因?qū)Φ臄?shù)量。預(yù)測軟件miRanda的閾值設(shè)置為：Score≥140且Energy≤-20 kcal/mol。在共表達(dá)分析得到的lncRNA-mRNA關(guān)系對的基礎(chǔ)上，通過軟件lncT ar預(yù)測其是否存在靶向調(diào)控，對結(jié)果中的lncRNA-mRNA對進(jìn)行調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可視化繪制。

1.3.6 ceRNA（lncRNA-miRNA-mRNA）預(yù)測通過targetscan軟件預(yù)測ceRNA，在僅有l(wèi)ncRNA和mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)的情況下，基于軟件預(yù)測的miRNA結(jié)合數(shù)據(jù)，進(jìn)行ceRNA預(yù)測分析，預(yù)測與lncRNAmRNA共同匹配共享的microRNA。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較與對照組比較，PTE組年齡、性別惡性腫瘤病史、血栓病史、免疫系統(tǒng)疾病病史、制動、創(chuàng)傷及PTESI分級差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 PTE組與健康對照組一般資料比較

2.2 測序結(jié)果

2.2.1 illumina轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果PTE組與健康對照組靜脈血之間存在大量DEGs,共有1 109個上調(diào)基因和1 288個下調(diào)基因，其中包括TLR3、TLR4等已知的與PTE相關(guān)的基因。

2.2.2 差異表達(dá)的lncRNAs、miRNAs、mRNAs的分布情況通過基因測序檢測差異表達(dá)的lncRNAs中有195個 上 調(diào)：包 括AL359715.1、MIAT、LINC02432、AC099524.1、LINC01754、TPRG1-AS1、AC012306.2、AL645933.2、LINC02432、NBR2、MALAT1等；235個lncRNAs下 調(diào):包 括LINC00667、AC245014.1、AL513314.2、LINC00963、PRKCQ-AS1、LINC01801、LINC01237、AC092683.1、AL158210.1等,見圖1A。差異表達(dá)的mRNAs中有731個上調(diào)，790個下調(diào),見圖1B；下 調(diào)mRNA top10包 括：CUL9、VAMP7、PITPNM2、KRBOX4、MZT2B、TCEA3、MED23、SLC35C2、C19orf25、FAM107B；上 調(diào)top 10包 括：WDYHV1、LTBP4、MIA、NFATC1、ENOPH1、TP53I11、MS4A4A、AL109811.4、SLC9A9、INTS2；差異表達(dá)的miRNA分為已知的和新發(fā)現(xiàn)的，新發(fā)現(xiàn)的miRNA中有25個上調(diào)，8個下調(diào),見圖1C，已知的miRNA中有16個上調(diào)，14個下調(diào),見圖1D。

圖1 差異表達(dá)的DEGs分布火山圖

2.2.3 DEGs的GO及KEGG分析對于KEGG途徑富集分析，以P＜0.05為篩選條件，結(jié)果顯示DEGs主要參與的通路有基因表達(dá)、Wnt信號通路、細(xì)胞周期蛋白激酶1(PLK1)在G2/M期的活性調(diào)節(jié)、TLR級聯(lián)中MAP激酶的活化、細(xì)胞周期、DNA重建等，見圖2。

圖2 差異基因在代謝/信號通路中的富集分析

2.2.4 靶基因預(yù)測計(jì)算差異表達(dá)miRNAs(known miRNAs 和 novel miRNAs)和差異表達(dá)基因兩兩間的表達(dá)相關(guān)系數(shù)，篩選顯著負(fù)相關(guān)的關(guān)系對。miRanda軟件預(yù)測miRNA-靶基因，與上一步的結(jié)果取交集，并構(gòu)建miRNA-基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。miRNA-lncRNA調(diào)控關(guān)系68對，其中靶基因數(shù)目最多的為miR-1260a及miR-1260b，見圖3A、B。

圖3 A miR-1260a靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 B miR-1260b靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

2.2.5 ceRNA（lncRNA-miRNA-mRNA）預(yù)測通過 ceRNA預(yù)測分析表明，在差異表達(dá)基因中預(yù)測與ln-cRNA-mRNA共同匹配共享的microRNA，共有11對調(diào)控關(guān)系，其中調(diào)控關(guān)系最多的為miR-1260b和miR-1260a，見表2。

表2 lncRNA-mRNA預(yù)測ceRNA表

3 討論

PTE具有高發(fā)病率與高致死率，了解及掌握PTE發(fā)病機(jī)制及其基因調(diào)控機(jī)制對于PTE的診斷及治療具有重要指導(dǎo)意義。本研究通過對PTE患者及健康人血液中DEGs的分析顯示，PTE及健康人血液中存在大量基因差異性表達(dá)，包括,lncRNAs、miRNAs及mRNAs，這與Starikova I[6]等學(xué)者的研究一致。

因循環(huán)中的miRNAs穩(wěn)定存在于血漿、血清和其他體液中，因此大部分研究將其應(yīng)用于血栓栓塞性疾病的診斷中?，F(xiàn)有報(bào)道顯示，血栓栓塞性疾病具有診斷意義的miRNA有miR-134、miR-28-3P、miR-1233、miR-27a、miR-134等[7]。其中一項(xiàng)大鼠深靜脈栓塞模型研究[8]顯示，在低氧狀態(tài)下，miR-13b-3p、miR-15a-5p、miR-92a-3p、miR-195-5p、miR-497-5p能靶向調(diào)控mRNA引起內(nèi)皮功能障礙，導(dǎo)致血栓形成。本研究差異表達(dá)的miRNA中并未找到上述幾類miRNA,考慮與血液標(biāo)本物種差異、鑒定DEGs方法不同相關(guān)。但相同的是，經(jīng)過miRNA-mRNA調(diào)控分析顯示，在PTE患者血液中，存在miRNA-mRNA調(diào)控機(jī)制，且存在miRNA-lncRNA調(diào)控機(jī)制。本研究中共預(yù)測出miRNA-mRNA調(diào)控關(guān)系140對，其中靶基因調(diào)控關(guān)系最多的為miR-1260b及miR-1260a。

目前miR-1260a及miR-1260b的研究甚少，且集中于惡性腫瘤，包括前列腺癌[9]、非小細(xì)胞肺癌[10]、宮頸癌[11]等惡性腫瘤中，暫無miR-1260b及miR-1260a關(guān)于PTE的研究。本研究顯示，miR-1260b及miR-1260a共同 調(diào) 控 的 靶 基 因有HAUS5、NFIC、ARHGEF12，經(jīng)過KEGG分析顯示，其參與的通路有：癌癥途徑、癌癥中的蛋白多糖、血管平滑肌收縮、血小板活化等。由此可見miR-1260b及miR-1260a可能作用于靶基因通過以上甚至更多通路引導(dǎo)PTE形成。

有研究發(fā)現(xiàn)在深靜脈血栓患者內(nèi)皮祖細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一系列與DVT相關(guān)的新的lncRNAs，由此揭示lncRNA可能在血栓栓塞性疾病中發(fā)揮重要作用[5]。本研究亦在PTE患者及健康人外周血中發(fā)現(xiàn)大量差異表達(dá)lncRNA，這些基因的功能尚待進(jìn)一步開發(fā)及探索。lncRNAs和miRNAs在許多過程中發(fā)揮著相似的關(guān)鍵作用，包括細(xì)胞增殖、凋亡和癌癥發(fā)生[12-13]。本研究首次于PTE中發(fā)現(xiàn)lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，且在所有調(diào)控關(guān)系中，miR-1260a、miR-1260b關(guān)系最為密切，這兩種miRNA有可能成為PTE診療的潛在靶點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組后組擬開展進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過對PTE患者及健康對照組的外周血進(jìn)行基因測序發(fā)現(xiàn)大量差異表達(dá)的DEGs，在PTE中建立了一個基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這些DEGs可能通過基因表達(dá)、Wnt信號通路、TLR級聯(lián)中MAP激酶的活化等信號通路可能參與了PTE的發(fā) 生。miR-1260b和miR-1260a可能作為ceRNA在PTE的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，有望成為PTE的潛在診治靶點(diǎn)。