發(fā)酵蟲草多糖提取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化、免疫活性研究

王蘭英，姜 玲，趙 靜，李紹平*

1.珠?？萍紝W院 藥學與食品科學學院，廣東 珠海 519041

2.澳門大學 中藥質(zhì)量研究國家重點實驗室， 澳門 999078

冬蟲夏草(C.sinensis)作為藥用真菌中的珍稀品種，主要是麥角菌科真菌冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾幼蟲上，侵染后使蟲體僵化在幼蟲頂部長出子座和僵蟲菌核，形成干燥的蟲和菌的復(fù)合體[1]，其內(nèi)含豐富的生物活性物質(zhì)，具有廣泛藥理作用。目前，由于自然環(huán)境的破壞和人為過度采伐等諸多因素導(dǎo)致野生蟲草資源遠遠不能滿足市場的需求。發(fā)酵蟲草菌粉是從青海野生冬蟲夏草中人工分離獲得的麥角菌科真菌冬蟲夏草(C.sinensis(Berk.)Sae.)的無性世代——中華束絲孢(SynnematumsinenseYinetShen sp.now)經(jīng)人工液體深層發(fā)酵、干燥加工獲得菌絲體的干燥粉末[2]。發(fā)酵蟲草菌粉成分、藥理作用與天然冬蟲夏草基本一致[3]，是天然冬蟲夏草最好的替代品[4]。發(fā)酵蟲草菌粉主要由多糖類、核苷類、氨基酸及其衍生物、甾醇類、醇類、鞘脂類等多種成分構(gòu)成[5-6]，其中多糖研究一直以來都是新資源功能食品及保健食品研發(fā)的熱點，具有提高機體免疫[7]、抗氧化[8-9]、保肝護肝[10]、抗腫瘤[11]、平衡血脂血糖[12]等作用。本試驗中所用發(fā)酵蟲草菌粉樣品分離自青海野生冬蟲夏草，鑒定菌株后并已成功投入規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，以菌絲體生產(chǎn)活性多糖及生物量為指標獲得穩(wěn)定高產(chǎn)發(fā)酵工藝。從發(fā)酵蟲草菌粉中提取得到的蟲草多糖樣品具有濃郁奶香味，是菌粉中主要活性成分之一。作者通過對該菌株發(fā)酵生產(chǎn)蟲草菌粉及發(fā)酵液樣品提取的多糖進行體外抗氧化活性及免疫活性能力的比較，以期為該菌株發(fā)酵蟲草菌粉及發(fā)酵液的利用和開發(fā)提供科學參考。

1 材料

1.1 菌種及菌粉樣品

蟲草菌由澳門大學中華醫(yī)藥研究院提供。發(fā)酵蟲草菌粉取自100 L發(fā)酵罐中穩(wěn)定發(fā)酵、離心干燥處理后的樣品。

1.2 主要試劑

脂多糖(LPS)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、modified griess：Sigma-Aldrich Lab and Production Materials；三羥基氨基甲烷、聯(lián)苯三酚、水楊酸、鐵氰化鉀、2，2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)、抗壞血酸：上海源葉生物科技有限公司；濃鹽酸：茂名市雄大化工有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：上海思域化工科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)：阿法埃莎(中國)化學有限公司；無水乙醇：國藥集團化學試劑有限公司；七水硫酸亞鐵：鞏義市金源化工有限公司；30%過氧化氫：武漢純度生物科技有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉：北京福瑞生物科技有限公司；三氯乙酸、三氯化鐵、過硫酸鉀：西隴化工股份有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

FA2204B型精密天平：上海精密儀器儀表有限公司；PS-10AD型超聲儀：深圳市良誼實驗室儀器有限公司；移液槍：賽默飛世爾科技公司；HWS-24型水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；XH-B型旋渦混合器：江蘇天翎儀器有限公司；UV-2600型紫外光譜儀、IRPrestige-21型紅外光譜儀：日本島津；酶標儀：珀金埃爾默企業(yè)管理(上海)有限公司。

2 試驗方法

2.1 多糖提取工藝優(yōu)化

2.1.1 多糖提取方法

將蟲草菌絲體干燥至恒質(zhì)量，粉碎過50目篩。精確稱取0.100 g菌絲體粉末，以30∶ 1 (mL/g)的液料比加入蒸餾水，并于80 ℃水浴鍋中浸提2 h。4 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液，殘渣重復(fù)上述操作3次，合并濾液，濃縮至原體積的1/3。三氯甲烷-正丁醇(體積比為4∶ 1)與多糖濃縮液以1∶ 5進行振蕩充分混合，4 000 r/min離心5 min除蛋白層。用活性炭(0.02 g/mL)除色素，40 ℃攪拌脫色2 h，重復(fù)3次后過濾收集濾液。濾液以1∶ 3逐滴、振搖加入無水乙醇，于4 ℃冰箱靜置過夜。4 000 r/min離心獲得沉淀，分別用乙醚、丙酮、無水乙醇洗滌，烘干即得多糖樣品。

2.1.2 單因素試驗

以液料比30∶ 1 (mL/g)，提取溫度80 ℃，提取時間2 h為考察基礎(chǔ)條件。精確稱取0.100 g菌絲體粉末，分別以液料比20∶ 1、30∶ 1、40∶ 1、50∶ 1、60∶ 1、70∶ 1、80∶ 1、90∶ 1、100∶ 1 (mL/g)，提取溫度30、40、50、60、70、80、90 ℃，提取時間0.5、1、1.5、2、2.5、3 h進行提取，考察各因素對多糖提取的影響。

2.1.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上以提取時間、液料比、提取溫度為因素，每個因素取3個水平，使用L9(33)正交表進行試驗。

2.1.4 多糖含量測定

從上述提取獲得的多糖樣品溶液中吸取0.01 mL,補水至1.00 mL，采取蒽酮-硫酸法測定多糖含量[13]。以葡萄糖為對照繪制質(zhì)量濃度梯度為0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的葡萄糖標準曲線，在0～0.10 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，其擬合線性回歸方程為y=2.625 7x-0.001，決定系數(shù)R2=0.999 9。按下式計算蟲草多糖含量(W)：

式中: C為樣品糖含量，mg/mL；D為樣品溶液稀釋倍數(shù)；V為所測樣品提取液總體積，mL；m為樣品質(zhì)量，mg。

2.2 多糖樣品制備

按上述優(yōu)化后的提取工藝對發(fā)酵蟲草菌粉和發(fā)酵液進行多糖提取及純化處理，獲得蟲草胞內(nèi)粗多糖、胞內(nèi)純化多糖、發(fā)酵液粗多糖、發(fā)酵液純化多糖樣品。精確配制4種多糖樣品溶液質(zhì)量濃度為10mg/mL，超聲輔助振蕩使其溶解完全，即得蟲草多糖樣品母液。

2.3 蟲草多糖特征吸收峰的檢測

2.3.1 紫外光譜法分析多糖樣品

按2.2中步驟配制4種多糖樣品母液，以超純水為對照，使用島津UV-2600在200～800nm波長范圍內(nèi)間隔為1nm進行多糖樣品光譜掃描。

2.3.2 紅外光譜法分析多糖樣品

采用傅里葉紅外色譜法，分別稱取提前干燥至恒定質(zhì)量0.001g4種蟲草多糖樣品和0.100gKBr粉末，在研缽中研磨均勻并壓制成待測片劑樣品，在4 000～400cm-1范圍進行光譜掃描。

2.4 多糖樣品的抗氧化能力分析

2.4.1 蟲草多糖對DPPH自由基清除能力的測定

配制抗壞血酸和多糖樣品(0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00mg/mL)，取上清液。參考劉城移等[14]的方法，加1.00mLDPPH(2mmol/L)溶液，渦旋混合5s，避光放置30min，測定多糖樣品反應(yīng)液于517nm下的吸光度Ax；以樣品溶液與無水乙醇反應(yīng)液為對照組，吸光度為Ad；空白參比溶液為蒸餾水，和DPPH溶液混合，測得的吸光度為Ao。陽性對照抗壞血酸組按上述操作進行處理，按下式計算DPPH自由基清除率。

2.4.2 蟲草多糖對羥基自由基清除能力的測定

配制抗壞血酸和多糖樣品(同2.4.1)，取上清液。參考Chen等[15]的方法略加修改，等體積依此加入1.00mL硫酸亞鐵(9mmol/L)、H2O2(8.8mmol/L)和鄰羥基苯甲酸溶液(9mmol/L)，混勻后在水浴37 ℃下反應(yīng)30min，靜置25min后測定510nm處樣品溶液吸光度Ax；空白參比溶液以等體積H2O代替多糖樣品反應(yīng)，測得的吸光度為Ao；對照組以等體積H2O代替鄰羥基苯甲酸、硫酸亞鐵和H2O2溶液反應(yīng)，測得的吸光度為Ad。陽性對照抗壞血酸組按上述操作進行處理，按下式計算樣品羥基自由基清除率。

2.4.3 蟲草多糖總還原能力測定

配制抗壞血酸和多糖樣品(同2.4.1)，取上清液。參考何晉浙等[16]的方法進行總還原力測定，空白參比溶液為2.500mLH2O代替多糖樣品進行同樣反應(yīng)，測定各組溶液700nm下的吸光度?？箟难峤M按多糖樣品的操作進行處理作為陽性對照。

2.4.4 蟲草多糖對超氧陰離子自由基清除能力的測定

配制抗壞血酸和多糖樣品(同2.4.1)，取上清液。參考何晉浙等[16]的方法略加修改，依次加入2.250mLTris-HCl緩沖溶液、2.00mL樣液、0.050mL60mmol/L聯(lián)苯三酚溶液，振蕩搖勻后加入0.020mLHCL溶液(10mol/L)終止反應(yīng)，測定反應(yīng)溶液325nm下的吸光度Ax。空白組以2.00mLH2O取代樣品反應(yīng)測得的吸光度為Ao。對照組以H2O取代聯(lián)苯三酚反應(yīng)測得的吸光度為Ad?？箟难峤M按上述操作進行處理作為陽性對照，按下式計算超氧陰離子自由基清除率。

2.4.5 蟲草多糖對ABTS自由基清除能力的測定

配制抗壞血酸和多糖樣品(同2.4.1)，取上清液。參考梁紅敏等[17]的方法，分別取1.00mL樣品溶液，加3.000mLABTS溶液，黑暗條件下放置1h，測定734nm處的吸光度Ax。空白參比溶液為等體積H2O代替多糖樣品反應(yīng)測得的吸光度為Ao。對照組以磷酸鹽緩沖液代替ABTS，吸光度為Ad?？箟难峤M按上述操作進行處理作為陽性對照，按下式計算ABTS自由基清除率。

2.5 蟲草多糖免疫活性能力測定

2.5.1 多糖對RAW264.7巨噬細胞增殖能力的影響

用PBS溶液配制蟲草胞內(nèi)及發(fā)酵液粗多糖樣品(500、250、125、62.500、31.250、15.625、7.813、3.906μg/mL)和陽性對照組脂多糖(LPS，0.4μg/mL)。參考Deng等[18]的方法進行試驗，于570nm下測定吸光度。細胞活力表示為多糖處理組和未經(jīng)多糖處理的空白試驗組之間的吸光度的比值。

2.5.2 多糖對巨噬細胞釋放NO的影響

配制脂多糖(LPS)和多糖樣品(同2.5.1)，取上清液。參考Wu等[19]的方法進行試驗，于540nm下測定吸光度。細胞NO的產(chǎn)生量表示為多糖處理組與LPS處理組之間的吸光度之比。

2.6 統(tǒng)計學分析

每次試驗重復(fù)測定3次，采用Origin軟件處理數(shù)據(jù)作圖，用Excel、SPSS軟件進行結(jié)果分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗結(jié)果及分析

液料比對多糖提取的影響如圖1a所示，隨著液料比增加多糖含量隨之增加，當液料比達到90∶ 1 (mL/g)時達到最高值。提取時間對多糖提取的影響如圖1b所示，當提取時間低于1.5h時，多糖含量顯著增加，在1.5h達到最高值，超過1.5h后多糖含量降低。提取溫度對多糖提取的影響如圖1c所示，隨著溫度的上升，多糖含量隨之增加，在60 ℃達到最高值。因此，在單因素優(yōu)化試驗中液料比為90∶ 1 (mL/g)、提取時間為1.5h、提取溫度為60 ℃條件下粗多糖百分含量最高。

圖1 單因素對多糖含量的影響

3.2 正交試驗結(jié)果及分析

正交試驗因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test design

正交試驗結(jié)果如表2所示，影響發(fā)酵蟲草菌粉多糖提取的因素重要性排序為A>B>C，最佳熱水浸提條件組合為A3B3C2，即提取溫度為65 ℃，液料比為95∶ 1 (mL/g)，提取時間為1.5h。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

3.3 蟲草多糖紫外光譜分析

如圖2所示，4種多糖樣品在200nm附近出現(xiàn)強吸收峰，從發(fā)酵蟲草菌粉提取的2種多糖樣品在260nm和280nm處有較強吸收峰，純化處理后的胞內(nèi)純化多糖樣品的核酸(260nm)、蛋白質(zhì)及多肽(280nm)含量相對較少。從發(fā)酵液中提取的多糖在260nm和280nm處無明顯吸收峰，但胞外多糖相較于胞外純化多糖紫外光譜來看，在260nm和280nm處有較小的凸起峰，判斷可能存在少量的核酸及蛋白質(zhì)[20-21]。

圖2 發(fā)酵蟲草菌粉及發(fā)酵液提取多糖的紫外光譜

3.4 蟲草多糖紅外光譜分析

圖3 發(fā)酵蟲草菌粉及發(fā)酵液提取多糖紅外光譜

3.5 總還原力的測定結(jié)果

各組樣品還原能力如圖4a所示，隨著質(zhì)量濃度遞增抗壞血酸還原能力逐漸增強，明顯優(yōu)于4種多糖樣品，當質(zhì)量濃度達到4mg/mL時抗壞血酸吸光度達到1.941，對應(yīng)此質(zhì)量濃度的還原能力達到最高,隨后趨于穩(wěn)定。在0～10mg/mL內(nèi)4種多糖樣品還原能力整體屬于上升趨勢，但胞內(nèi)及發(fā)酵液多糖存在顯著性差異，且胞內(nèi)多糖相較于發(fā)酵液多糖在還原能力上具有明顯優(yōu)勢，而同來源粗多糖和純化多糖相差不大。在10mg/mL下，抗壞血酸組吸光度達到1.919，4種多糖總還原力強弱依此為胞內(nèi)多糖(0.257)>胞內(nèi)純化多糖(0.250)>發(fā)酵液多糖(0.075)>發(fā)酵液純化多糖(0.071)。

3.6 對超氧陰離子清除能力的測定結(jié)果

各組樣品對超氧陰離子的清除能力如圖4b所示，各組樣品與質(zhì)量濃度呈明顯量效關(guān)系，整體上來看抗壞血酸的清除能力較好，在0.2mg/mL下清除率達到100%。4種多糖樣品對超氧陰離子的清除能力相差不大，在10mg/mL下胞內(nèi)多糖、胞內(nèi)純化多糖、發(fā)酵液多糖、發(fā)酵液純化多糖的清除率可達到95.49%、80.74%、69.23%、75.73%。發(fā)酵液提取的2種多糖在1.5～5mg/mL范圍內(nèi)，粗多糖清除能力較強，4mg/mL以后發(fā)酵液純化多糖清除能力無限接近胞內(nèi)純化多糖，且在5mg/mL以后發(fā)酵液純化多糖清除能力優(yōu)于發(fā)酵液多糖。綜合來看，各組樣品間清除能力強弱依次為胞內(nèi)多糖>胞內(nèi)純化多糖>發(fā)酵液純化多糖>發(fā)酵液多糖。

3.7 對羥基自由基清除能力的測定結(jié)果

各組樣品對羥基自由基的清除能力如圖4c所示，抗壞血酸及4種多糖樣品在0～10mg/mL范圍內(nèi)隨著溶液質(zhì)量濃度遞增呈現(xiàn)出較好的清除能力。在2mg/mL下，抗壞血酸清除率達到99.42%；在8mg/mL下胞內(nèi)多糖、胞內(nèi)純化多糖、發(fā)酵液多糖、發(fā)酵液純化多糖清除率可達到65.66%、89.36%、78.94%、48.44%。在4～8mg/mL范圍內(nèi)，蟲草多糖樣品清除能力整體趨勢從大到小依此為胞內(nèi)純化多糖>發(fā)酵液多糖>胞內(nèi)多糖>發(fā)酵液純化多糖。

3.8 對DPPH自由基清除能力的測定結(jié)果

各組樣品對DPPH自由基的清除能力如圖4d所示，以抗壞血酸作為陽性對照，溶液質(zhì)量濃度達到0.1mg/mL時清除率達到96.34%，隨后趨于穩(wěn)定。整組多糖樣品隨質(zhì)量濃度的遞增清除率隨之增大，胞內(nèi)多糖樣品在0～6mg/mL范圍內(nèi)清除率上升至93.86%，隨后呈現(xiàn)下降趨勢。原因可能是，多糖樣品在高濃度下溶解達到飽和，采用超聲攪拌促溶方法導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。胞內(nèi)多糖及胞內(nèi)純化多糖的趨勢相近，在8mg/mL下胞內(nèi)多糖的清除率高于胞內(nèi)純化多糖，具有較高的清除能力。發(fā)酵液純化多糖相較于發(fā)酵液多糖清除活性更強，在4mg/mL下發(fā)酵液純化多糖清除率達到98.25%。在10mg/mL下4種多糖樣品清除能力大小依此為發(fā)酵液純化多糖(102.41%)>胞內(nèi)純化多糖(81.70%)>發(fā)酵液多糖(59.78%)>胞內(nèi)多糖(48.51%)。

整組數(shù)據(jù)存在波動是由于DPPH適用于有機溶劑，當多糖達到一定濃度時，可能造成多糖溶液沉淀從而影響吸光度的測定。

3.9 對ABTS自由基清除能力測定結(jié)果

各組樣品對ABTS自由基的清除能力如圖4e所示，在樣品質(zhì)量濃度為0～10mg/mL范圍內(nèi)，陽性對照及4種多糖樣品均具有較好活性，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，清除能力呈現(xiàn)不同程度的增加。陽性對照組在0.1mg/mL時清除率可達到99.94%，胞內(nèi)純化多糖和胞內(nèi)粗多糖的清除率分別在2mg/mL、4mg/mL達到100%，發(fā)酵液多糖及其純化多糖在8mg/mL達到97.17%、97.73%。從檢測結(jié)果來看，發(fā)酵液與發(fā)酵蟲草菌粉提取的多糖均可達到較高的清除能力，相比之下胞內(nèi)多糖在ABTS自由基清除能力上優(yōu)于發(fā)酵液提取多糖。

圖4 蟲草多糖樣品體外抗氧化活性

3.10 多糖樣品抗氧化能力指標的對比

4種多糖樣品抗氧化能力的EC50(抗氧化指標清除率達到50%的多糖樣品有效質(zhì)量濃度[22])和RP0.5 AU(總還原力測定中反應(yīng)液吸光度達到0.5時多糖樣品的質(zhì)量濃度[23])對比如表3所示。從表3中的EC50來看，綜合比較4種自由基中胞內(nèi)提取多糖抗氧化能力優(yōu)于發(fā)酵液多糖。在ABTS自由基組EC50中，胞內(nèi)多糖、胞內(nèi)純化多糖、發(fā)酵液多糖、發(fā)酵液純化多糖的EC50分別為0.75、0.43、1.67、1.40mg/mL,其對應(yīng)清除率大小順序為胞內(nèi)純化多糖>胞內(nèi)多糖>發(fā)酵液純化多糖>發(fā)酵液多糖；且從本組EC50來看，純化處理后多糖純度增大會明顯提高多糖ABTS自由基清除能力。對DPPH自由基清除能力大小順序為發(fā)酵液純化多糖>胞內(nèi)多糖>胞內(nèi)純化多糖>發(fā)酵液多糖，對超氧陰離子自由基清除能力大小順序為胞內(nèi)多糖>發(fā)酵液純化多糖>胞內(nèi)純化多糖>發(fā)酵液多糖，對羥基自由基清除能力大小順序為胞內(nèi)多糖>發(fā)酵液多糖>胞內(nèi)純化多糖>發(fā)酵液純化多糖。4種多糖樣品在4個指標中以超氧陰離子自由基的EC50最小，清除率最高，差異性最小。發(fā)酵液多糖的DPPH自由基EC50最大，清除能力最弱，其次為發(fā)酵液純化多糖的羥基自由基EC50，其余組EC50也略有差異，但差異不顯著。從各個多糖樣品總還原力的RP0.5AU來看，抗氧化能力大小順序為胞內(nèi)多糖>胞內(nèi)純化多糖>發(fā)酵液純化多糖>發(fā)酵液多糖，可以明顯看出從發(fā)酵蟲草菌粉中提取的多糖在總還原力指標和抗氧化能力上顯著優(yōu)于發(fā)酵液提取的多糖。

表3 不同蟲草多糖樣品抗氧化能力EC50和RP0.5 AU比較

3.11 細胞存活率測定結(jié)果

由圖5a可知，在3.906～500 μg/mL范圍內(nèi)，發(fā)酵蟲草菌粉胞內(nèi)及發(fā)酵液多糖細胞存活率隨多糖質(zhì)量濃度遞增先增大后減小。與空白組細胞相比可知，2種多糖對細胞沒有毒性，并且在31.25～125 μg/mL濃度范圍內(nèi)與空白組有顯著性差異。與LPS組相比，在31.25～125 μg/mL下兩種多糖樣品細胞存活率比LPS組高(P<0.01)，說明這2種多糖會顯著性增大巨噬細胞的存活率，促進巨噬細胞增殖。

3.12 NO產(chǎn)生量測定結(jié)果

由圖5b可知，2種蟲草多糖均隨質(zhì)量濃度的遞增而產(chǎn)生更多的NO，具有明顯的量效關(guān)系。2種蟲草多糖樣品與空白組相對比，都能有效地增強細胞NO產(chǎn)生量。與LPS組進行比較發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)多糖樣品產(chǎn)生NO的活性在3.906～500 μg/mL范圍內(nèi)低于LPS組，但從試驗結(jié)果數(shù)據(jù)趨勢來看，多糖樣品在高于500 μg/mL下可能會達到甚至超過LPS組產(chǎn)NO量；而相比之下，發(fā)酵液多糖的NO產(chǎn)生量更多，并且在大于250 μg/mL時與LPS組沒有顯著性差異，500 μg/mL時NO產(chǎn)生量優(yōu)于LPS組，并且質(zhì)量濃度與NO產(chǎn)生量呈現(xiàn)明顯正相關(guān)趨勢。通過2種蟲草多糖樣品對細胞NO產(chǎn)生量比較發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵蟲草菌粉胞外多糖產(chǎn)生NO的量要大于發(fā)酵蟲草菌粉胞內(nèi)多糖。

注：a圖中*表示與control組之間P<0.05；**表示與control組之間P<0.01。b圖中**表示與LPS組之間P<0.01；***表示與LPS組之間P<0.001。

4 結(jié)論

通過對液體深層發(fā)酵工藝生產(chǎn)的發(fā)酵蟲草菌粉及發(fā)酵液提取的多糖樣品進行紫外和紅外光譜進行分析，并對該菌株發(fā)酵生產(chǎn)不同來源提取的蟲草多糖進行活性比較。紫外光譜掃描結(jié)果表明4種多糖樣品都存在不同程度的核酸及蛋白質(zhì)殘留，簡單的純化處理能大幅度降低多糖樣品中核酸及蛋白質(zhì)含量，且發(fā)酵液提取多糖尤其是發(fā)酵液純化多糖在260 nm和280 nm處無明顯核酸及蛋白質(zhì)吸收峰，相較于發(fā)酵蟲草菌粉提取多糖純度較高。紅外光譜掃描結(jié)果表明4種多糖樣品是以β-糖苷鍵連接且具有吡喃糖環(huán)的酸性雜多糖，純化后多糖有機質(zhì)含量降低。由蟲草多糖樣品抗氧化能力指標EC50和RP0.5 AU可知，發(fā)酵蟲草菌粉及發(fā)酵液提取的多糖均具有較好的抗氧化活性，且胞內(nèi)多糖抗氧化活性整體最高，ABTS自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基清除能力的EC50和總還原力的RP0.5 AU分別為0.75、2.12、0.13、1.77和156.30 mg/mL。在免疫活性測定中發(fā)現(xiàn)這兩種不同來源提取多糖不僅能較好地促細胞增殖，還能增強細胞產(chǎn)NO的能力。