高效液相色譜法檢測(cè)5種市售雞蛋中?；撬岷?/h1>
2022-01-24 11:40:08秦夢(mèng)然張偉吳鳳明劉付蔡鋒隆白敬王桐于曉雪李留安
食品研究與開(kāi)發(fā) 2022年1期
秦夢(mèng)然，張偉，吳鳳明，劉付，蔡鋒隆，白敬，王桐，于曉雪*，李留安*
（1.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300392；2.天津市廣源畜禽養(yǎng)殖有限公司，天津 301806）
?；撬幔址Q(chēng)2-氨基乙磺酸，分子式C2H7NO3S，是機(jī)體組織細(xì)胞中含量豐富的一種小分子含硫氨基酸，有廣泛的生理調(diào)節(jié)作用[1-2]。其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，溶于水，但不溶于乙醇等有機(jī)溶劑[3]。牛磺酸具有良好的降血糖效果[4-5]；對(duì)神經(jīng)具有保護(hù)作用，缺乏?；撬釙?huì)造成視網(wǎng)膜退化，最終導(dǎo)致失明[6]；牛磺酸廣泛存在于心臟、肌肉、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等，且視網(wǎng)膜組織中?；撬岷枯^高，對(duì)維持健全的視網(wǎng)膜功能至關(guān)重要[7-8]；?；撬嶙鳛橐环N補(bǔ)充劑，通過(guò)減少氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)線粒體功能來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)腎臟的保護(hù)[9]；它能增加細(xì)胞抗氧化和抗病毒侵害的能力[10]；研究發(fā)現(xiàn)?；撬釋?duì)各種類(lèi)型的高血壓均有明顯改善作用[11]；能提高學(xué)習(xí)記憶能力，延緩衰老[12]；?；撬釋?duì)防止血管疾病介入治療后再發(fā)生狹窄以及防治心血管疾病亦有重要作用[13]。隨著人們對(duì)?；撬嵘砉δ苷J(rèn)識(shí)的加深，對(duì)?；撬岬男枨笠苍絹?lái)越多。日常膳食中?；撬岷繕O微，不足以滿足人類(lèi)需求，選擇富含?；撬崾称穼?duì)于提高人類(lèi)攝入?；撬峋哂兄匾饬x[14]。
西方發(fā)達(dá)國(guó)家已普遍將其應(yīng)用于醫(yī)藥及食品添加劑中。近年來(lái)國(guó)內(nèi)一些營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)給品中也添加了?；撬醄15]。我國(guó)作為雞蛋生產(chǎn)大國(guó)，雞蛋產(chǎn)量在3 309萬(wàn)噸左右，雞蛋消費(fèi)在人們?nèi)粘Ｉ钍澄锵M(fèi)中占有很大比例[16]。雞的品種、飼料中的營(yíng)養(yǎng)組成、飼養(yǎng)方式、生理因素等多種因素可能造成雞蛋中?；撬岷坎町怺17-18]。檢測(cè)不同品種、來(lái)源雞蛋的?；撬岷?，有利于人們科學(xué)合理選擇?；撬岷扛叩碾u蛋品類(lèi)。目前，在?；撬峒兌葴y(cè)定方面，國(guó)內(nèi)外常用的方法主要有分光光度計(jì)法、滴定法、薄層層析法、氨基酸自動(dòng)分析法和高壓液相色譜法等[19]。其中滴定法、比色法和薄層掃描法易受其他氨基酸的干擾，誤差相對(duì)較大；氨基酸自動(dòng)分析儀價(jià)格昂貴，限制了其使用范圍；高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）精確度、靈敏度較高，樣品處理較簡(jiǎn)單，能夠快速進(jìn)行樣品分析而被廣泛地應(yīng)用。高效液相色譜法有柱前衍生和柱后衍生兩種，后者分離所需鈉離子交換柱價(jià)格昂貴，不適宜作為測(cè)定方法推廣應(yīng)用[20]。有研究顯示，雞蛋中的牛磺酸主要存在于蛋黃中，蛋清中未檢測(cè)出[21]。截至目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)檢測(cè)雞蛋中?；撬岷康姆椒r有報(bào)道。本試驗(yàn)擬采用柱前衍生法，以鄰苯二甲醛（ortho-phthalaldehyde，OPA）為衍生試劑，乙硫醇為保護(hù)劑，建立HPLC測(cè)定雞蛋中?；撬岷康姆椒ǎ瑸殡u蛋中?；撬岷康目茖W(xué)檢測(cè)提供理論參考；同時(shí)，通過(guò)檢測(cè)市售不同種雞蛋中?；撬岷?，為人們進(jìn)行雞蛋消費(fèi)選擇提供實(shí)踐指導(dǎo)。
1 材料與方法
1.1 雞蛋樣品
A、B品牌烏雞蛋，C、D品牌柴雞蛋和普通雞蛋（每種雞蛋隨機(jī)選取15枚）：市售。
1.2 主要儀器與設(shè)備
高效液相色譜儀配熒光檢測(cè)器（Agilent-1260）：安捷倫科技有限公司；超聲波清洗機(jī)（SB-100D）：寧波新芝生物科技股份有限公司；高速離心機(jī)（Sigma3-3OK）：國(guó)藥集團(tuán)（天津）醫(yī)療機(jī)械有限公司；多用途渦旋混合器（VORTEX-6）：海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；超聲波振蕩器（KQ-500B）：昆山市超聲儀器有限公司；0.22 μm濾膜：天津市科億隆實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。
1.3 主要試劑
?；撬針?biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：德國(guó)默克（Merck）公司；硼酸（分析純）：天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純）：博歐特（天津）化工貿(mào)易有限公司；OPA（化學(xué)純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；乙硫醇（化學(xué)純）：上海麥克林生物公司；亞鐵氰化鉀（分析純）、乙酸鋅（分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；純凈水：娃哈哈公司。
1.4 方法
1.4.1 溶液配制
0.4 mol/L硼酸鈉緩沖液：稱(chēng)取2.48g硼酸和1.41 g氫氧化鈉，用水定容至100 mL。
衍生劑：稱(chēng)取0.1gOPA用10mL甲醇溶解，加0.1mL乙硫醇，用0.4 mol/L硼酸鈉緩沖液定容至100 mL。
沉淀劑Ⅰ：稱(chēng)取15 g亞鐵氰化鉀，用水溶解并定容至100 mL。該沉淀劑在室溫25℃下3個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定。
沉淀劑Ⅱ：稱(chēng)取30 g乙酸鋅，用水溶解并定容至100 mL。該沉淀劑在室溫25℃下3個(gè)月內(nèi)保持穩(wěn)定。
標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液：將?；撬針?biāo)準(zhǔn)品100 mg，用5 mL水溶解，加入 100 mL 容量瓶，用甲醇∶乙腈∶水（1∶1∶8，體積比）定容至100 mL，配制成濃度為1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
標(biāo)準(zhǔn)品工作液：將?；撬醿?chǔ)備液稀釋?zhuān)渲瞥蓾舛葹?2、5、10、20、25 μg/mL 的工作液。
1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定
分別取 2、5、10、20、25 μg/mL 的?；撬峁ぷ饕?0 μL，衍生化，液相色譜分析，熒光檢測(cè)器測(cè)定，以?；撬岬纳V峰面積對(duì)應(yīng)其濃度作線性回歸，得到?；撬岬臉?biāo)準(zhǔn)曲線。
1.4.3 樣品的測(cè)定
1.4.3.1 色譜條件
色譜柱：Agilent Eclipse plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇+乙腈∶水（25∶75，體積比），流速0.8 mL/min；柱溫30℃；熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)330 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm；進(jìn)樣量20 μL。
1.4.3.2 樣品前處理
稱(chēng)取雞蛋黃5 g（精確至0.01 g）于錐形瓶中，加入30mL40℃左右溫水，充分混勻，置超聲波振蕩器上超聲輔助提取10min，冷卻到室溫25℃。加1mL沉淀劑Ⅰ，渦旋混合，加1 mL沉淀劑Ⅱ，渦旋混合，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中用水定容至刻度，充分混勻[22]，樣液于5 000 r/min下離心10 min，留上清液，充分混勻，經(jīng)0.22 μm微孔膜過(guò)濾，備用。
1.4.3.3 在線衍生化
利用1260 Vialsampler高效液相色譜自動(dòng)進(jìn)樣器的功能實(shí)現(xiàn)樣品的在線衍生。自動(dòng)化進(jìn)樣器吸取7 μL樣品液與13 μL衍生劑混合，混合10次，等待0.1 min，進(jìn)行液相色譜分析。
1.4.4 回收率測(cè)定和精密度測(cè)定
按照 1.4.3 處理雞蛋樣品，添加 5、10、20 μg/mL 的?；撬針?biāo)準(zhǔn)品溶液，渦旋混合，液相色譜分析，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回收率（n=3）以考察方法的準(zhǔn)確度。同一樣品進(jìn)行重復(fù)測(cè)定（n=6），確定樣品的精密度。
1.4.5 樣品雞蛋?；撬岷繙y(cè)定
按照1.4.3方法對(duì)A、B品牌烏雞蛋，C、D品牌柴雞蛋和普通雞蛋蛋黃進(jìn)行測(cè)定。樣品中的?；撬岷扛鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行計(jì)算。
1.4.6 數(shù)據(jù)處理
采用SPSS 22.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用單因子方差分析進(jìn)行均值間多重比較，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著，試驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
2 結(jié)果與分析
2.1 HPLC條件的優(yōu)化
2.1.1 流動(dòng)相比例和流動(dòng)相流速的優(yōu)化
本研究中，選擇甲醇+乙腈與水作為流動(dòng)相，分別選用體積比 15∶85、20∶80、25∶75、30∶70 進(jìn)行試驗(yàn)。隨著甲醇+乙腈比例的相應(yīng)變化，?；撬崤c相鄰峰的分離度也有所變化，保留時(shí)間不斷縮短，但吸收峰面積有所不同。綜合考慮吸收峰面積及保留時(shí)間，選擇流動(dòng)相甲醇+乙腈和水的體積比為25∶75。流動(dòng)相流速是影響高效液相色譜檢測(cè)的重要因素，流速太慢目標(biāo)物質(zhì)保留時(shí)間延長(zhǎng)，峰型變寬；流速增快可以縮短保留時(shí)間，但過(guò)快則容易導(dǎo)致目標(biāo)物質(zhì)未完全檢測(cè)，峰面積變小。本研究中，通過(guò)比較不同流速（0.5、0.8、1.0 mL/min）對(duì)?；撬釞z測(cè)的影響后發(fā)現(xiàn)，不同流速下?；撬峋辛己玫姆蛛x效果，但保留時(shí)間和峰面積均隨流速的增大而減小。綜合考慮峰面積和保留時(shí)間，選擇0.8mL/min作為最終流動(dòng)相的流速。
2.1.2 衍生劑用量和衍生時(shí)間的優(yōu)化
衍生劑用量是影響?；撬釞z測(cè)的重要因素之一，衍生劑過(guò)少，易出現(xiàn)反應(yīng)不完全，結(jié)果準(zhǔn)確性差；衍生劑過(guò)多則容易影響峰型。本試驗(yàn)選擇不同用量的衍生劑（?；撬針?biāo)樣和衍生劑 OPA 的摩爾比為 2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶5），通過(guò)觀察峰面積和峰型，最終確定底物牛磺酸與衍生劑OPA摩爾比為2∶1。?；撬崤c衍生試劑OPA反應(yīng)迅速，靈敏度高，但衍生產(chǎn)物并不穩(wěn)定，衍生時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，產(chǎn)物分解，峰面積減小。試驗(yàn)比較了不同衍生時(shí)間（0.1、2.0、4.0 min）對(duì)?；撬釞z測(cè)的影響，當(dāng)衍生時(shí)間為0.1 min時(shí)，牛磺酸已經(jīng)衍生完全；繼續(xù)延長(zhǎng)衍生時(shí)間，峰面積逐漸減小。因此，確定衍生時(shí)間為0.1min。
2.1.3 ?；撬針?biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
根據(jù)不同質(zhì)量濃度?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液的出峰面積，以牛磺酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x（μg/mL），峰面積為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。
圖1 ?；撬針?biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of taurine
由圖 1 可知，?；撬岷吭?2 μg/mL～25 μg/mL 范圍內(nèi)，峰面積與濃度的線性回歸方程為y=2.499x，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。表明?；撬嵩诖速|(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.2 專(zhuān)屬性試驗(yàn)
為考察HPLC測(cè)定蛋黃中?；撬岬姆蛛x效能及干擾情況，取空白溶液、標(biāo)準(zhǔn)品?；撬崛芤杭暗包S溶液、蛋清溶液。分別按照1.4.3方法操作，記錄色譜圖，結(jié)果如圖2所示。
圖2 專(zhuān)屬性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Results of exclusive test
由圖2可知，水在?；撬嵫苌锵鄳?yīng)位置無(wú)色譜峰出現(xiàn)，不干擾?；撬岬暮繙y(cè)定（圖2A），牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)品衍生物的保留時(shí)間約為12.116 min（圖2B），用此方法測(cè)定雞蛋蛋黃中的?；撬岷繒r(shí)也不受其他成分干擾（圖2C），蛋清溶液在?；撬嵫苌锵鄳?yīng)位置無(wú)色譜峰出現(xiàn)，說(shuō)明蛋清中無(wú)?；撬幔▓D2D）。結(jié)果表明，此方法可以用于測(cè)定蛋黃中的?；撬帷?/p>
2.3 回收率測(cè)定
同一樣品分別加入不同質(zhì)量濃度的?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，各加標(biāo)量平行測(cè)定3次，求出牛磺酸回收率見(jiàn)表1。
由表1可知，加標(biāo)量為5 μg/mL時(shí)，平均回收率為99.7%；加標(biāo)量為10 μg/mL時(shí)，平均回收率為100.2%；加標(biāo)量為20 μg/mL時(shí)，平均回收率為100.5%，綜上結(jié)果表明，此方法的平均回收率為99.7%～100.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）范圍為0.5%～0.9%。
表1 加標(biāo)回收率試驗(yàn)Table 1 Spread recovery experiments
2.4 精密度測(cè)定
精密度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 精密度測(cè)定Table 2 Precision measurement
由表2可知，同一樣品重復(fù)測(cè)定6次時(shí)，所測(cè)得峰面積范圍為0.93～0.96（平均值為 0.94），RSD值為1.3%。說(shuō)明高效液相色譜柱前衍生化測(cè)定?；撬峋芏雀摺?/p>
2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)
表3列出了質(zhì)量濃度為10 μg/mL的雞蛋蛋黃?；撬針悠啡芤悍胖?、2、3 h后的測(cè)定結(jié)果。
表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 3 Stability experiments
由表3可知，樣品放置1、2、3 h時(shí)測(cè)得?；撬岱迕娣e為0.46、0.46、0.47，平均值為 0.463，其RSD為1.2%，說(shuō)明?；撬釞z測(cè)在3 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，用該方法檢測(cè)?；撬岷靠纱_保其穩(wěn)定性。
2.6 樣品的測(cè)定
按照1.4.3方法處理樣品，對(duì)A、B品牌烏雞蛋，C、D品牌柴雞蛋，普通雞蛋進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3。
圖3 5種市售雞蛋中?；撬岷康谋容^Fig.3 Comparison of taurine content in five commercially available eggs
由圖3可知，普通雞蛋蛋黃中?；撬岷匡@著低于A、B品牌烏雞蛋和C品牌柴雞蛋（P＜0.05），普通雞蛋蛋黃中的?；撬岷柯缘陀贒品牌柴雞蛋，但差異不顯著（P＞0.05）。A、B品牌烏雞蛋蛋黃中的牛磺酸含量顯著高于D品牌柴雞蛋（P＜0.05），B品牌烏雞蛋蛋黃中的牛磺酸含量略低于A品牌烏雞蛋，但差異不顯著（P＞0.05）。C品牌柴雞蛋蛋黃中的牛磺酸含量略高于D品牌柴雞蛋，但差異不顯著（P＞0.05）。
3 結(jié)論
本研究建立了一種利用自動(dòng)進(jìn)樣器設(shè)定，OPA為衍生劑的柱前在線衍生高效液相色譜法測(cè)定雞蛋中牛磺酸含量的方法，并首次對(duì)不同品種市售雞蛋中?；撬岷窟M(jìn)行了檢測(cè)比較。該方法簡(jiǎn)單易行，降低了分析成本，可推廣用于雞蛋中?；撬岷康呐繖z測(cè)，從評(píng)價(jià)?；撬岷康慕嵌忍崾荆瑸蹼u蛋的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高于柴雞蛋和普通雞蛋。
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（1.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300392；2.天津市廣源畜禽養(yǎng)殖有限公司，天津 301806）
?；撬幔址Q(chēng)2-氨基乙磺酸，分子式C2H7NO3S，是機(jī)體組織細(xì)胞中含量豐富的一種小分子含硫氨基酸，有廣泛的生理調(diào)節(jié)作用[1-2]。其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，溶于水，但不溶于乙醇等有機(jī)溶劑[3]。牛磺酸具有良好的降血糖效果[4-5]；對(duì)神經(jīng)具有保護(hù)作用，缺乏?；撬釙?huì)造成視網(wǎng)膜退化，最終導(dǎo)致失明[6]；牛磺酸廣泛存在于心臟、肌肉、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等，且視網(wǎng)膜組織中?；撬岷枯^高，對(duì)維持健全的視網(wǎng)膜功能至關(guān)重要[7-8]；?；撬嶙鳛橐环N補(bǔ)充劑，通過(guò)減少氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)線粒體功能來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)腎臟的保護(hù)[9]；它能增加細(xì)胞抗氧化和抗病毒侵害的能力[10]；研究發(fā)現(xiàn)?；撬釋?duì)各種類(lèi)型的高血壓均有明顯改善作用[11]；能提高學(xué)習(xí)記憶能力，延緩衰老[12]；?；撬釋?duì)防止血管疾病介入治療后再發(fā)生狹窄以及防治心血管疾病亦有重要作用[13]。隨著人們對(duì)?；撬嵘砉δ苷J(rèn)識(shí)的加深，對(duì)?；撬岬男枨笠苍絹?lái)越多。日常膳食中?；撬岷繕O微，不足以滿足人類(lèi)需求，選擇富含?；撬崾称穼?duì)于提高人類(lèi)攝入?；撬峋哂兄匾饬x[14]。
西方發(fā)達(dá)國(guó)家已普遍將其應(yīng)用于醫(yī)藥及食品添加劑中。近年來(lái)國(guó)內(nèi)一些營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)給品中也添加了?；撬醄15]。我國(guó)作為雞蛋生產(chǎn)大國(guó)，雞蛋產(chǎn)量在3 309萬(wàn)噸左右，雞蛋消費(fèi)在人們?nèi)粘Ｉ钍澄锵M(fèi)中占有很大比例[16]。雞的品種、飼料中的營(yíng)養(yǎng)組成、飼養(yǎng)方式、生理因素等多種因素可能造成雞蛋中?；撬岷坎町怺17-18]。檢測(cè)不同品種、來(lái)源雞蛋的?；撬岷?，有利于人們科學(xué)合理選擇?；撬岷扛叩碾u蛋品類(lèi)。目前，在?；撬峒兌葴y(cè)定方面，國(guó)內(nèi)外常用的方法主要有分光光度計(jì)法、滴定法、薄層層析法、氨基酸自動(dòng)分析法和高壓液相色譜法等[19]。其中滴定法、比色法和薄層掃描法易受其他氨基酸的干擾，誤差相對(duì)較大；氨基酸自動(dòng)分析儀價(jià)格昂貴，限制了其使用范圍；高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）精確度、靈敏度較高，樣品處理較簡(jiǎn)單，能夠快速進(jìn)行樣品分析而被廣泛地應(yīng)用。高效液相色譜法有柱前衍生和柱后衍生兩種，后者分離所需鈉離子交換柱價(jià)格昂貴，不適宜作為測(cè)定方法推廣應(yīng)用[20]。有研究顯示，雞蛋中的牛磺酸主要存在于蛋黃中，蛋清中未檢測(cè)出[21]。截至目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)檢測(cè)雞蛋中?；撬岷康姆椒r有報(bào)道。本試驗(yàn)擬采用柱前衍生法，以鄰苯二甲醛（ortho-phthalaldehyde，OPA）為衍生試劑，乙硫醇為保護(hù)劑，建立HPLC測(cè)定雞蛋中?；撬岷康姆椒ǎ瑸殡u蛋中?；撬岷康目茖W(xué)檢測(cè)提供理論參考；同時(shí)，通過(guò)檢測(cè)市售不同種雞蛋中?；撬岷?，為人們進(jìn)行雞蛋消費(fèi)選擇提供實(shí)踐指導(dǎo)。
1 材料與方法
1.1 雞蛋樣品
A、B品牌烏雞蛋，C、D品牌柴雞蛋和普通雞蛋（每種雞蛋隨機(jī)選取15枚）：市售。
1.2 主要儀器與設(shè)備
高效液相色譜儀配熒光檢測(cè)器（Agilent-1260）：安捷倫科技有限公司；超聲波清洗機(jī)（SB-100D）：寧波新芝生物科技股份有限公司；高速離心機(jī)（Sigma3-3OK）：國(guó)藥集團(tuán)（天津）醫(yī)療機(jī)械有限公司；多用途渦旋混合器（VORTEX-6）：海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；超聲波振蕩器（KQ-500B）：昆山市超聲儀器有限公司；0.22 μm濾膜：天津市科億隆實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。
1.3 主要試劑
?；撬針?biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：德國(guó)默克（Merck）公司；硼酸（分析純）：天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純）：博歐特（天津）化工貿(mào)易有限公司；OPA（化學(xué)純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；乙硫醇（化學(xué)純）：上海麥克林生物公司；亞鐵氰化鉀（分析純）、乙酸鋅（分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；純凈水：娃哈哈公司。
1.4 方法
1.4.1 溶液配制
0.4 mol/L硼酸鈉緩沖液：稱(chēng)取2.48g硼酸和1.41 g氫氧化鈉，用水定容至100 mL。
衍生劑：稱(chēng)取0.1gOPA用10mL甲醇溶解，加0.1mL乙硫醇，用0.4 mol/L硼酸鈉緩沖液定容至100 mL。
沉淀劑Ⅰ：稱(chēng)取15 g亞鐵氰化鉀，用水溶解并定容至100 mL。該沉淀劑在室溫25℃下3個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定。
沉淀劑Ⅱ：稱(chēng)取30 g乙酸鋅，用水溶解并定容至100 mL。該沉淀劑在室溫25℃下3個(gè)月內(nèi)保持穩(wěn)定。
標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液：將?；撬針?biāo)準(zhǔn)品100 mg，用5 mL水溶解，加入 100 mL 容量瓶，用甲醇∶乙腈∶水（1∶1∶8，體積比）定容至100 mL，配制成濃度為1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
標(biāo)準(zhǔn)品工作液：將?；撬醿?chǔ)備液稀釋?zhuān)渲瞥蓾舛葹?2、5、10、20、25 μg/mL 的工作液。
1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定
分別取 2、5、10、20、25 μg/mL 的?；撬峁ぷ饕?0 μL，衍生化，液相色譜分析，熒光檢測(cè)器測(cè)定，以?；撬岬纳V峰面積對(duì)應(yīng)其濃度作線性回歸，得到?；撬岬臉?biāo)準(zhǔn)曲線。
1.4.3 樣品的測(cè)定
1.4.3.1 色譜條件
色譜柱：Agilent Eclipse plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇+乙腈∶水（25∶75，體積比），流速0.8 mL/min；柱溫30℃；熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)330 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm；進(jìn)樣量20 μL。
1.4.3.2 樣品前處理
稱(chēng)取雞蛋黃5 g（精確至0.01 g）于錐形瓶中，加入30mL40℃左右溫水，充分混勻，置超聲波振蕩器上超聲輔助提取10min，冷卻到室溫25℃。加1mL沉淀劑Ⅰ，渦旋混合，加1 mL沉淀劑Ⅱ，渦旋混合，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中用水定容至刻度，充分混勻[22]，樣液于5 000 r/min下離心10 min，留上清液，充分混勻，經(jīng)0.22 μm微孔膜過(guò)濾，備用。
1.4.3.3 在線衍生化
利用1260 Vialsampler高效液相色譜自動(dòng)進(jìn)樣器的功能實(shí)現(xiàn)樣品的在線衍生。自動(dòng)化進(jìn)樣器吸取7 μL樣品液與13 μL衍生劑混合，混合10次，等待0.1 min，進(jìn)行液相色譜分析。
1.4.4 回收率測(cè)定和精密度測(cè)定
按照 1.4.3 處理雞蛋樣品，添加 5、10、20 μg/mL 的?；撬針?biāo)準(zhǔn)品溶液，渦旋混合，液相色譜分析，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回收率（n=3）以考察方法的準(zhǔn)確度。同一樣品進(jìn)行重復(fù)測(cè)定（n=6），確定樣品的精密度。
1.4.5 樣品雞蛋?；撬岷繙y(cè)定
按照1.4.3方法對(duì)A、B品牌烏雞蛋，C、D品牌柴雞蛋和普通雞蛋蛋黃進(jìn)行測(cè)定。樣品中的?；撬岷扛鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行計(jì)算。
1.4.6 數(shù)據(jù)處理
采用SPSS 22.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用單因子方差分析進(jìn)行均值間多重比較，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著，試驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
2 結(jié)果與分析
2.1 HPLC條件的優(yōu)化
2.1.1 流動(dòng)相比例和流動(dòng)相流速的優(yōu)化
本研究中，選擇甲醇+乙腈與水作為流動(dòng)相，分別選用體積比 15∶85、20∶80、25∶75、30∶70 進(jìn)行試驗(yàn)。隨著甲醇+乙腈比例的相應(yīng)變化，?；撬崤c相鄰峰的分離度也有所變化，保留時(shí)間不斷縮短，但吸收峰面積有所不同。綜合考慮吸收峰面積及保留時(shí)間，選擇流動(dòng)相甲醇+乙腈和水的體積比為25∶75。流動(dòng)相流速是影響高效液相色譜檢測(cè)的重要因素，流速太慢目標(biāo)物質(zhì)保留時(shí)間延長(zhǎng)，峰型變寬；流速增快可以縮短保留時(shí)間，但過(guò)快則容易導(dǎo)致目標(biāo)物質(zhì)未完全檢測(cè)，峰面積變小。本研究中，通過(guò)比較不同流速（0.5、0.8、1.0 mL/min）對(duì)?；撬釞z測(cè)的影響后發(fā)現(xiàn)，不同流速下?；撬峋辛己玫姆蛛x效果，但保留時(shí)間和峰面積均隨流速的增大而減小。綜合考慮峰面積和保留時(shí)間，選擇0.8mL/min作為最終流動(dòng)相的流速。
2.1.2 衍生劑用量和衍生時(shí)間的優(yōu)化
衍生劑用量是影響?；撬釞z測(cè)的重要因素之一，衍生劑過(guò)少，易出現(xiàn)反應(yīng)不完全，結(jié)果準(zhǔn)確性差；衍生劑過(guò)多則容易影響峰型。本試驗(yàn)選擇不同用量的衍生劑（?；撬針?biāo)樣和衍生劑 OPA 的摩爾比為 2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶5），通過(guò)觀察峰面積和峰型，最終確定底物牛磺酸與衍生劑OPA摩爾比為2∶1。?；撬崤c衍生試劑OPA反應(yīng)迅速，靈敏度高，但衍生產(chǎn)物并不穩(wěn)定，衍生時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，產(chǎn)物分解，峰面積減小。試驗(yàn)比較了不同衍生時(shí)間（0.1、2.0、4.0 min）對(duì)?；撬釞z測(cè)的影響，當(dāng)衍生時(shí)間為0.1 min時(shí)，牛磺酸已經(jīng)衍生完全；繼續(xù)延長(zhǎng)衍生時(shí)間，峰面積逐漸減小。因此，確定衍生時(shí)間為0.1min。
2.1.3 ?；撬針?biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
根據(jù)不同質(zhì)量濃度?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液的出峰面積，以牛磺酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x（μg/mL），峰面積為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。
圖1 ?；撬針?biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of taurine
由圖 1 可知，?；撬岷吭?2 μg/mL～25 μg/mL 范圍內(nèi)，峰面積與濃度的線性回歸方程為y=2.499x，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。表明?；撬嵩诖速|(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.2 專(zhuān)屬性試驗(yàn)
為考察HPLC測(cè)定蛋黃中?；撬岬姆蛛x效能及干擾情況，取空白溶液、標(biāo)準(zhǔn)品?；撬崛芤杭暗包S溶液、蛋清溶液。分別按照1.4.3方法操作，記錄色譜圖，結(jié)果如圖2所示。
圖2 專(zhuān)屬性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Results of exclusive test
由圖2可知，水在?；撬嵫苌锵鄳?yīng)位置無(wú)色譜峰出現(xiàn)，不干擾?；撬岬暮繙y(cè)定（圖2A），牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)品衍生物的保留時(shí)間約為12.116 min（圖2B），用此方法測(cè)定雞蛋蛋黃中的?；撬岷繒r(shí)也不受其他成分干擾（圖2C），蛋清溶液在?；撬嵫苌锵鄳?yīng)位置無(wú)色譜峰出現(xiàn)，說(shuō)明蛋清中無(wú)?；撬幔▓D2D）。結(jié)果表明，此方法可以用于測(cè)定蛋黃中的?；撬帷?/p>
2.3 回收率測(cè)定
同一樣品分別加入不同質(zhì)量濃度的?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，各加標(biāo)量平行測(cè)定3次，求出牛磺酸回收率見(jiàn)表1。
由表1可知，加標(biāo)量為5 μg/mL時(shí)，平均回收率為99.7%；加標(biāo)量為10 μg/mL時(shí)，平均回收率為100.2%；加標(biāo)量為20 μg/mL時(shí)，平均回收率為100.5%，綜上結(jié)果表明，此方法的平均回收率為99.7%～100.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）范圍為0.5%～0.9%。
表1 加標(biāo)回收率試驗(yàn)Table 1 Spread recovery experiments
2.4 精密度測(cè)定
精密度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 精密度測(cè)定Table 2 Precision measurement
由表2可知，同一樣品重復(fù)測(cè)定6次時(shí)，所測(cè)得峰面積范圍為0.93～0.96（平均值為 0.94），RSD值為1.3%。說(shuō)明高效液相色譜柱前衍生化測(cè)定?；撬峋芏雀摺?/p>
2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)
表3列出了質(zhì)量濃度為10 μg/mL的雞蛋蛋黃?；撬針悠啡芤悍胖?、2、3 h后的測(cè)定結(jié)果。
表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 3 Stability experiments
由表3可知，樣品放置1、2、3 h時(shí)測(cè)得?；撬岱迕娣e為0.46、0.46、0.47，平均值為 0.463，其RSD為1.2%，說(shuō)明?；撬釞z測(cè)在3 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，用該方法檢測(cè)?；撬岷靠纱_保其穩(wěn)定性。
2.6 樣品的測(cè)定
按照1.4.3方法處理樣品，對(duì)A、B品牌烏雞蛋，C、D品牌柴雞蛋，普通雞蛋進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3。
圖3 5種市售雞蛋中?；撬岷康谋容^Fig.3 Comparison of taurine content in five commercially available eggs
由圖3可知，普通雞蛋蛋黃中?；撬岷匡@著低于A、B品牌烏雞蛋和C品牌柴雞蛋（P＜0.05），普通雞蛋蛋黃中的?；撬岷柯缘陀贒品牌柴雞蛋，但差異不顯著（P＞0.05）。A、B品牌烏雞蛋蛋黃中的牛磺酸含量顯著高于D品牌柴雞蛋（P＜0.05），B品牌烏雞蛋蛋黃中的牛磺酸含量略低于A品牌烏雞蛋，但差異不顯著（P＞0.05）。C品牌柴雞蛋蛋黃中的牛磺酸含量略高于D品牌柴雞蛋，但差異不顯著（P＞0.05）。
3 結(jié)論
本研究建立了一種利用自動(dòng)進(jìn)樣器設(shè)定，OPA為衍生劑的柱前在線衍生高效液相色譜法測(cè)定雞蛋中牛磺酸含量的方法，并首次對(duì)不同品種市售雞蛋中?；撬岷窟M(jìn)行了檢測(cè)比較。該方法簡(jiǎn)單易行，降低了分析成本，可推廣用于雞蛋中?；撬岷康呐繖z測(cè)，從評(píng)價(jià)?；撬岷康慕嵌忍崾荆瑸蹼u蛋的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高于柴雞蛋和普通雞蛋。
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