艾葉多糖的提取、結構分析與功能的研究進展

何柳，王云鵬，謝衛(wèi)紅，張毅*

（1.湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068；2.發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068）

艾葉為菊科植物艾蒿（Artemisia argyi Levl.et Vant.）的成熟葉子，是中國傳統(tǒng)的天然植物資源，具有清熱止痰、溫經止血、調節(jié)腸道免疫功能等功效[1]。我國艾蒿植物資源位于世界前列，2020年我國新鮮艾蒿產量為19.2萬噸，干艾蒿產量為11.5萬噸，主要有蘄艾、贛艾、北艾、祁艾及海艾[2]。艾蒿功能價值高，生長在不同地理位置的艾蒿所富含的微量元素含量相似，其中鉀、鈣、鎂、鐵含量較高，能為人體提供必要的微量元素[3-4]。目前，我國對艾葉的加工方式主要以艾灸和直接食用等初級加工為主，艾葉深加工食品缺乏，這種現狀可能造成艾葉資源的浪費，因此，艾葉精加工食品意義較大。

艾葉多糖（Artemisia argyi folium polysaccharides，AAFP）是一種存在于艾葉中的雜多糖，屬于天然生物大分子物質，其分子量主要分布在6 000 Da以上，由不同摩爾比的木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖等單糖組成。研究證實AAFP具有抗氧化、免疫調節(jié)和抗腫瘤等功效，能延緩衰老、增強機體免疫力，在開發(fā)新型功能性保健食品方面具有良好的發(fā)展?jié)摿Γ野~多糖功能性產品研究較少。因此，本文對艾葉多糖的提取、結構分析及功能活性的研究現狀進行概述，以期為開發(fā)艾葉多糖的新型功能性食品提供理論依據。

1 艾葉多糖的提取方法

1.1 熱水提取法

熱水提取法為傳統(tǒng)提取方法，因高溫可以加速植物細胞多糖的溶解而被廣泛應用。劉軍海等[5]研究得出AAFP最佳提取工藝為料液比1∶18（g/mL）、提取溫度97℃、提取時間1.25 h、提取3次，多糖的提取率可達1.529%。沈霞等[6]研究得出AAFP最佳提取工藝為料液比1∶20（g/mL）、提取溫度 99 ℃、提取時間 2.3 h，多糖的提取率可達3.017%，與理論預測值3.096%的相對誤差為2.6%?？芍?，料液比、提取溫度、提取時間和提取次數影響AAFP提取率。

1.2 超聲波輔助提取法

超聲波是一種彈性機械振動波，因其空化效應、攪拌作用加速有效成分的溶出，提高提取率[7]，采用超聲波輔助提取多糖時需注意超聲功率對多糖結構的影響，功率過大會破壞多糖的結構。李宏睿等[8]采用超聲輔助法提取AAFP最佳工藝為超聲處理時間20 min、提取溫度 80 ℃、提取時間 2.0 h、料液比 1∶40（g/mL）；此條件下多糖提取率高達11.94%。戴喜末等[9]考察超聲法提取野艾蒿多糖的最佳工藝為超聲處理時間35min、提取溫度 70 ℃、料液比 1∶40（g/mL），在此工藝條件下，多糖提取率為6.44%；與理論預測值6.71%的相對誤差為4.02%。說明優(yōu)化的試驗條件比較可靠。可見，艾蒿種類、超聲處理時間也影響AAFP的提取率。

1.3 微波輔助提取法

微波是一種能滲入物質深處的電磁波，促使物質吸收微波能量，導致溫度升高、壓力增大，當壓力超過細胞壁的承受能力時，細胞壁破裂，從而促進有效成分的溶出[10]。采用微波法提取時應注意微波穿透厚度有限、適應性有限等缺點。趙蔡斌等[11]采用微波輔助熱水浸提法得出AAFP的最佳提取工藝條件為料液比1∶20（g/mL）、提取溫度 85 ℃、提取時間 20 min、微波功率400 W，在優(yōu)化條件下艾葉多糖提取率可達2.74%。與熱水浸提法相比，提取時間縮短了73%。

1.4 加壓溶劑萃取法

加壓溶劑萃取法（pressurized solvent extraction，PSE）是采用常規(guī)溶劑對固體或半固體樣品進行萃取的方法。其原理是在封閉容器內，通過高溫高壓升高提取溶劑的沸點，從而使提取溶劑仍保持液體狀態(tài)，避免提取溶劑的揮發(fā)，提高提取速率[12]。李華生等[13]通過加壓提取AAFP，考察了溶劑濃度、料液比、萃取壓力、萃取時間和萃取溫度5個因素對提取率的影響，得出最佳工藝條件為溶劑濃度50%、料液比1∶30（g/mL）、萃取壓力0.9 MPa、萃取時間40 min、萃取溫度120℃。在此試驗條件下，艾葉多糖提取率達到6.82%。

1.5 超聲波-酶提取法

酶法是利用酶將植物細胞壁降解，使有效成分溶出，從而提高多糖得率的方法[14]。超聲波-酶提取法是一種超聲波與酶聯(lián)用提取植物多糖的方法，具有高度特異性，不會破壞艾葉中其他有效成分，一般選擇纖維素酶。熊曼萍[15]采用超聲波-酶法提取AAFP得出最佳提取工藝條件為纖維素酶處理2 h、料液比1∶40（g/mL）、乙醇濃度80%、超聲處理時間30 min，在此條件下多糖得率可達0.790%；同樣條件下，單純的超聲波輔助提取AAFP得率為0.504%；表明在相同條件下，超聲波酶法提取艾葉多糖得率比超聲法提取提高了56.75%，AAFP得率的影響因素強弱排序為乙醇濃度＞料液比＞超聲處理時間。

艾葉多糖5種提取方法優(yōu)缺點如表1所示。

表1 艾葉多糖提取方法優(yōu)缺點Table 1 Advantages and disadvantages of polysaccharide extraction from Artemisia argyi folium polysaccharides

由表1可知，熱水提取法提取簡單但耗時長，通常考察提取溫度對AAFP的影響。與傳統(tǒng)熱水提取法相比，超聲波提取法或微波提取法均能大大縮短提取時間、提高提取效率，通?？疾旃β?，功率過高會破壞艾葉多糖的結構，且微波穿透厚度有限、適應性有限等因素對AAFP得率也可能產生不同程度的影響。加壓溶劑萃取法自動化程度高、萃取時間短，需考察壓力對AAFP結構的影響。超聲波-酶提取法溫和、環(huán)保、提取率高，不僅考察超聲波功率的大小，還應利用酶的專一性特點來選擇酶。以上5種提取方法各有優(yōu)缺點。因此，應綜合考慮設備條件、提取成本、效率、環(huán)保等因素來提取AAFP。

2 艾葉多糖的相對分子量與單糖組成分析

艾葉多糖相對分子量通常指平均相對分子量，測定AAFP的相對分子質量一般采用高效凝膠滲透色譜法（high performence gel permeation chromatography，HPGPC）；多糖的單糖組成分析是進行多糖質量控制的重要依據，測定AAFP的單糖組成方法有高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法（high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector，HPLC-ELSD）[16]和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[17-18]。AAFP的相對分子量與單糖組成的情況如表2所示。

表2 艾葉多糖相對分子量與單糖組成Table 2 Relative molecular weight and monosaccharide composition of AAFP

續(xù)表2 艾葉多糖相對分子量與單糖組成Continue table 2 Relative molecular weight and monosaccharide composition of AAFP

由表2可知，AAFP的分子量和單糖組成存在差異。Lan等[16]從艾葉中分離得到了4種多糖級分；AY10的分子量最大為9 171 Da，單糖組成為木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和鼠李糖，其摩爾比為18.18∶14.91∶37.83∶25.88∶3.20；AY00 的分子量最小為 6 922 Da，單糖組成為木糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖，其摩爾比為 9.08∶13.38∶24.86∶52.68；可見，AY10 的分子量比AY00大，可能與AY10中含有鼠李糖有關。Bao等[17]從艾葉中得到了一種水溶性多糖FAAP-02，其分子量為5 619 Da，單糖組成為N-d-葡萄糖胺、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖和核糖，摩爾比為11.13∶8.09∶6.86∶3.82∶3.12∶2.74∶1.80∶1.00。Tseng 等[20]將艾葉粗多糖通過Vivaspin 20離心管分離得到AAWAP，其平均分子量為4 255 000 Da，單糖組成為葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖醛酸，摩爾比為2.42∶1.00∶0.79∶0.34∶0.25。相比較而言，AAWAP 分子量比FAAP-02分子量大，FAAP-02是純化分離得到的多糖，表明分離純化可能對多糖分子量產生影響。

綜上所述，AAFP為大分子化合物，其分子量差異較大，單糖組成均含有阿拉伯糖和甘露糖，其摩爾比也存在顯著差異，這可能跟AAFP的結構構象有關，后續(xù)可深入探討阿拉伯糖和甘露糖與功能活性的關系。

3 艾葉多糖的功能活性

艾葉多糖屬于天然植物多糖，具有抗氧化、免疫調節(jié)、降血糖、調節(jié)細胞凋亡和抗腫瘤等功效，因毒副作用低、提取方便、保健價值高等優(yōu)點受到廣泛關注。

3.1 抗氧化作用

過量的自由基會加速人體衰老和引起各種疾病的發(fā)生，而抗氧化能克服過量的自由基對人體造成的損傷[21]。研究證實植物多糖能清除DPPH·、·OH、ABTS+·和O2-·[22-24]。天然植物多糖對機體無毒副作用[25]，具有成為天然抗氧化劑的潛力。Deng等[26]研究表明AAFP清除ABTS+·、DPPH·、·OH的IC50值分別為74.41、268.5、350.2 μg/mL，鐵還原抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP） 值為 163.5 μg/mL，FRAP 值越大，抗氧化能力越強，說明AAFP具有很強的抗氧化活性。Lan等[16]研究表明AAFP分離純化后的亞組分均對氫氧化物以及O2-·顯示出高抗氧化能力，IC50值分別為8 μg/mL～18 μg/mL和10μg/mL～30μg/mL。胡崗等[27]研究發(fā)現AAFP濃度由0.125 mg/mL增大到4 mg/mL，對·OH和O2-·的清除率分別增加了約2.1倍和1.2倍；當AAFP濃度由2 mg/mL增大到256 mg/mL時，對DPPH自由基清除率增加了約12.8倍，表明AAFP抗氧化活性與其濃度呈正相關；此外，還表明AAFP的抗氧化作用機制：D-脫氧核糖-鐵體系法結果表明AAFP在磷酸鹽緩沖液中能競爭性地結合Fe2+-EDTA與H2O2反應引發(fā)生成·OH，羥胺法結果表明AAFP可與O2-·發(fā)生氧化反應，DPPH法結果表明AAFP可直接提供氫離子，從而達到消除自由基的目的[27]。

3.2 免疫調節(jié)作用

大量研究表明，細胞因子在對外源和自身抗原的免疫反應中起關鍵作用[28-32]。白介素-2（nterleukin-2，IL-2）是一種多效性細胞因子[33]，可誘導T細胞分化[34]；I型干擾素不僅作為抗病毒細胞因子，還具有多種針對細菌感染的免疫調節(jié)作用[35]。目前，黃芪多糖[36]、鐵皮石斛多糖[37]、麥冬多糖[38]、艾葉多糖[16]等植物多糖被證實具有免疫調節(jié)作用。其中AAFP調節(jié)宿主免疫反應主要與白介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor，TNF-α）、IL-2、腫瘤壞死因子 β（tumor necrosis factor,TNF-β）等細胞因子的活性以及T淋巴細胞的增殖有關。尹美珍等[39]研究發(fā)現，AAFP濃度與脾細胞IL-2活性呈量效關系，當濃度在100mg/mL～500 mg/mL時，可明顯提高小鼠脾細胞IL-2和TNF細胞因子活性，也可提高腹腔巨噬細胞的酸性磷酸酶活性和吞噬能力，從而發(fā)揮免疫調節(jié)作用。AAFP是否對巨噬細胞的白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、TNF-α的活性產生影響文獻中尚未研究。此外，另有文獻探索AAFP體內給藥對宿主免疫作用的影響，結果表明AAFP濃度在200mg/mL～600mg/mL范圍內，可促進巨噬細胞存在條件下淋巴細胞的增殖，且高于無巨噬細胞存在條件下淋巴細胞的增殖，從而證明了AAFP可顯著上調腹膜巨噬細胞的IL-6和TNF-α水平并促進T細胞免疫，具有免疫調節(jié)作用[40]。進一步分離純化得到的AAFP亞組分也具有較強的免疫調節(jié)作用，Lan等[16]研究發(fā)現，從AAFP分離出的4個亞組分均能增強伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，ConA）誘導的T細胞增殖，但不能增強脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的B細胞增殖；此外，AAFP還以劑量依賴性方式顯著促進ConA誘導的干擾素-γ（interferon γ，IFN-γ）和 IL-2 的分泌。

免疫調節(jié)分為非特異性免疫和特異性免疫，巨噬細胞具有非特異性免疫調節(jié)功能[41]，而免疫球蛋白具有特異性免疫調節(jié)功能[42]。Zhang等[43]研究發(fā)現，AAFP可顯著增強免疫球蛋白M（immunoglobulinM，IgM）的含量，且以劑量依賴性方式促進IL-1β、IL-6和TNF-α的產生，其作用機制可通過上調NO的濃度和特異性促進 IgM、免疫球蛋白 G（immunoglobulinG，IgG）、IL-1β、IL-6和TNF-α抑制劑的分泌進而對體外免疫起重要作用，但AAFP對誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、Toll樣受體 4（toll-like receptor 4 ，TLR4）、髓樣分化因子88和核因子Kappa B（NF-κB）mRNA水平卻無顯著影響。這說明NO不是通過iNOS活性增加而產生，可能與一氧化氮合酶家族（NOS）催化NO產生有關，一氧化氮合酶家族（NOSs）不僅包括iNOS，還包括內皮型 NOS（eNOS）和神經性 NOS（nNOS）[44]。據報道，多糖的分子機制與Toll樣受體介導的信號通路密切相關，其中TLR4已被證明是重要的多糖受體[45]，而AAFP卻不能激活TLR4/NF-κB信號通路。綜上所述，AAFP發(fā)揮免疫調節(jié)的作用機制尚不明確，還需進一步深入探究。

3.3 抗腫瘤作用

早在100多年前多糖就參與腫瘤和癌癥的輔助治療[46]。自從Chihara等[47]研究發(fā)現香菇多糖的抗腫瘤活性后，越來越多的多糖被分離出來，這些多糖結構多樣化，抗腫瘤活性強。與傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物區(qū)別在于，多糖能通過激活宿主的各種免疫反應發(fā)揮其抗腫瘤作用，且對機體無損害，因此，多糖被視為生物反應調節(jié)劑[48]。AAFP的抗腫瘤活性主要表現在直接抑制腫瘤細胞增殖或通過增強機體免疫功能達到抗腫瘤作用。喻昕等[49]研究表明，AAFP與肝癌細胞共孵育能明顯抑制肝癌細胞的增殖，與小鼠脾細胞共孵育能明顯提高TNF對靶細胞的活性，增強自然殺傷細胞對靶細胞的殺傷力。Bao等[17]研究表明，AAFP能明顯抑制S180腫瘤的生長，延長了荷瘤小鼠的存活時間，其主要通過增加胸腺和脾臟指數，提高血清IL-2、IL-6、IL-12和TNF-α水平以及CD4+和CD8+脾T淋巴細胞的表達，從而提高荷瘤小鼠免疫功能來實現，這表明AAFP的抗腫瘤作用機理與免疫刺激作用有關。

癌癥相關的血栓形成是癌癥患者常見的并發(fā)癥，血栓的預防工作非常重要[50]。腫瘤細胞誘導的血小板聚集通過形成血小板“屏蔽層”來保護腫瘤細胞，該“屏蔽層”允許腫瘤細胞耐受免疫細胞的攻擊并促進腫瘤細胞的侵襲和轉移[51-52]。平足蛋白（podoplanin，PDPN）是I型跨膜唾液酸在多種癌細胞類型中表達的蛋白，在促進腫瘤侵襲和轉移中起關鍵作用[53-54]，PDPN的表達與癌癥相關的死亡率高度相關[55]。為尋找PDPN和腫瘤細胞誘導的血小板聚集的拮抗劑，Tseng等[20]研究發(fā)現分離出的AAWAP可通過抑制PDPN活性和腫瘤細胞誘導的血小板聚集來預防腫瘤細胞的轉移，其作用機制是通過蛋白質印跡和α篩選分析確定AAWAP對細胞和血小板無毒，并且以劑量依賴性方式不可逆轉地阻斷PDPN和C型凝集素樣受體2（c-type lectins2，CLEC-2）之間的相互作用，從而抑制PDPN和腫瘤細胞誘導血小板聚集，達到抗腫瘤活性的目的。上述研究表明，AAFP能阻斷保護腫瘤細胞耐受免疫細胞攻擊的“保護層”。AAFP是具有抗腫瘤功效的潛在天然保健品。

3.4 其他作用

目前研究還發(fā)現AAFP還具有抗菌[56]、降血糖[57]以及調節(jié)小鼠胸腺細胞凋亡作用[19]。如Kyung等[19]研究發(fā)現，分離純化的AAFP寡糖級分AVF3可通過抑制Fas基因的表達來調節(jié)胸腺細胞凋亡；Fas及其配體FasL能夠誘導細胞發(fā)生凋亡，FasL為能夠結合到死亡受體TNFRSF6/FAS的細胞因子，是有關細胞凋亡的膜表面分子[58]；其作用機制可能是AVF3通過下調Fas/FasL基因表達活性來促進小鼠胸腺細胞的存活。艾葉多糖的作用機制如圖1所示。

圖1 艾葉多糖的作用機制Fig.1 Mechanism of Artemisia argyi folum polysaccharides

綜上所述，艾葉屬于中國傳統(tǒng)天然植物，AAFP具有以上多種功能活性，且安全無毒，被視為生物反應調節(jié)劑。目前有關AAFP抗氧化、免疫調節(jié)和抗腫瘤的研究較為深入，主要是通過機體信號通路來發(fā)揮作用。但尚不明確AAFP結構構象與功能活性之間的關系，AAFP活性是否與其分子量、單糖組成和微觀結構等因素有關，還需要進行大量研究來證實。明確AAFP功能活性與結構之間的構效關系，對開發(fā)艾葉多糖新型功能性食品至關重要。此外，還可進行化學修飾來提高AAFP的功效，制備艾葉多糖衍生物，從而開發(fā)更多新型功能性產品。

4 總結與展望

我國艾蒿植物資源豐富，艾葉深加工食品缺乏，可能造成艾葉資源的浪費。艾葉多糖是存在于艾葉中的雜多糖，安全無毒、提取方便，具有抗氧化、抗腫瘤以及免疫調節(jié)等功效；因此，艾葉多糖的研究與開發(fā)意義較大。目前，有關艾葉多糖的研究取得了相關進展，但仍存在一些問題：1）艾葉多糖提取率存在差異，提取方法不適用于工業(yè)化提取。2）艾葉多糖結構研究較少，現階段還停留在初級結構研究，有關艾葉多糖分子空間構象、分子間相互作用、糖苷鍵連接方式和微觀結構等方面未深入研究。3）艾葉多糖功能活性與結構之間的關系尚不明確。上述問題限制了艾葉多糖新型功能性食品的開發(fā)，因此，為提高艾葉資源有效利用率，后續(xù)應從提取方法、結構鑒定和功能活性展開深入研究，從而得到最佳提取工藝和明確多糖的構效關系，為開發(fā)艾葉多糖新型功能性食品提供理論依據，使艾葉多糖新型食品滿足人們的需求。