巨峰葡萄籽原花青素的純化與抗氧化活性分析

伍勇，鄒蝶，盧倩，程馳，夏珊，馮媛媛，邱成書，薛飛龍，張曉娟，劉紅玲

（成都師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，特色園藝生物資源開發(fā)與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130）

原花青素是一類具有特殊生物活性的黃酮類化合物[1]，由不同數(shù)量的兒茶素和表兒茶素單體聚合而成，其中低聚原花青素具有較強(qiáng)的清除自由基能力[2]。多種動物實(shí)驗(yàn)和系統(tǒng)研究論證了原花青素的安全性，也發(fā)現(xiàn)原花青素能抑制紅細(xì)胞膜過氧化、預(yù)防心腦血管等疾病[3]，還具有抗衰老、抗癌、保護(hù)肝腎等功能[4]。因此原花青素被廣泛用于食品、藥品以及化妝品等領(lǐng)域。大量的研究表明[5-6]，葡萄加工副產(chǎn)物葡萄籽可作為原花青素的來源，葡萄籽原花青素具有抗氧化、清除自由基的作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。赤霞珠作為最受歡迎的釀酒葡萄品種，巨峰作為新興的廣受歡迎的葡萄品種，在四川擁有90%以上的種植面積，兩種葡萄籽原花青素都具有潛在研究價值。

對原花青素復(fù)雜的生物學(xué)活性深入研究發(fā)現(xiàn)，原花青素的生理活性差異除了受單體組成的差異影響，也因原花青素聚合度高低而改變，因此，原花青素的提取、純化工藝對其功能發(fā)揮和工業(yè)利用顯得尤為重要。李彩霞等[7]在赤霞珠原花青素的研究中確定了最佳提取工藝為料液比1∶40（g/mL），硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，超聲時間50 min。毛建利等[8]優(yōu)化原花青素提取工藝，優(yōu)化工藝為提取溫度 81 ℃、料液比 1∶40（g/mL）、乙醇濃度56%、提取時間20 h，提取率為5.61%。而有關(guān)巨峰葡萄籽原花青素的提取工藝還未見報(bào)道。葡萄籽中原花青素的分離純化方法有溶劑萃取分離法、大孔吸附樹脂法、靜態(tài)膜過濾法等。溶劑萃取法的工藝路線較為復(fù)雜，有機(jī)溶劑回收難，且產(chǎn)品純度不高。靜態(tài)膜過濾法由于過濾技術(shù)的局限，難以有效去除產(chǎn)品中的大分子雜質(zhì)[9]。大孔樹脂吸附洗脫法具有選擇性好、吸附容量大、機(jī)械強(qiáng)度高等優(yōu)點(diǎn)，在天然產(chǎn)物工業(yè)化的提取分離中得到廣泛應(yīng)用[10]。馬小琴等[11]通過大孔樹脂對原花青素的吸附率、解吸附率等的影響研究，發(fā)現(xiàn)HPD-400型大孔樹脂對原花青素的分離純化具有較高效率。范明霞等[12]比較了7種大孔樹脂對原花青素的分離純化效果，表明HPD-400大孔樹脂具有較好效果。有關(guān)葡萄籽原花青素的提取工藝已開展大量研究，但有關(guān)巨峰葡萄籽原花青素提取與純化工藝的研究薄弱，影響其應(yīng)用開發(fā)。根據(jù)早期研究中原花青素的聚合物分子特點(diǎn)與HPD-400樹脂的吸附特征相似，上樣流速、洗脫劑濃度、洗脫劑pH值等[13]都影響最終原花青素純化效果，因此選擇HPD-400樹脂作為純化吸附材料，并探究相關(guān)因素對提取純度的影響。

巨峰葡萄是近年來四川地區(qū)新興種植品種，大量加工副產(chǎn)物葡萄籽有待開發(fā)利用。因此，本研究考察吸附時間、提取液pH值、上樣流速、乙醇濃度、洗脫液pH值對原花青素分離純化效果的影響，采用正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化與驗(yàn)證，優(yōu)化巨峰葡萄籽原花青素純化工藝，并以赤霞珠葡萄籽作為參照，對其抗氧化活性進(jìn)行分析，為其抗氧化產(chǎn)品開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

巨峰葡萄籽：市售；赤霞珠葡萄籽：上海海瑞生物試劑有限公司。

HPD-400大孔吸附樹脂：山東東鴻化工有限公司；果膠酶（＞50 000 U/g）：上海瑞永生物科技有限公司；纖維素酶（＞40 000 U/g）：新疆沃德生物科技有限公司；香蘭素（分析純）：上海笛柏生物科技有限公司；原花青素B1（色譜純）：上海源葉生物科技有限公司；沒食子酸（分析純）、福林酚（分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 主要設(shè)備

標(biāo)口砂芯層析柱（外徑30mm×300mm）、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；HH數(shù)顯三用恒溫水箱：江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；HC-2064離心機(jī)：上海浦東天本離心機(jī)械有限公司；KYNS-100C恒溫培養(yǎng)搖床：上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；UV754紫外可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取工藝

將葡萄籽洗凈后放入恒溫干燥箱50℃烘干至恒重，粉碎機(jī)粉碎后過40目篩備用。稱取100 g巨峰葡萄籽樣品，用500 mL石油醚浸泡12 h，抽濾、干燥制得脫脂葡萄籽。以1∶25（g/mL）的料液比加入80%乙醇，調(diào)節(jié)溶液的pH 5.0，加入0.8 mg/g的復(fù)合酶[果膠酶∶纖維素酶=1∶3（質(zhì)量比）]，酶解溫度 40℃條件下酶解 30min，再在35℃下超聲35min，取出后放入離心機(jī)3500r/min離心10 min，取其上清液，即為原花青素的提取液，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

HPD-400大孔樹脂用95%乙醇浸泡24 h充分溶脹，純水沖洗至無白色渾濁液，再用5%HCl溶液浸泡3 h后用蒸餾水洗至pH值為中性，5%NaOH溶液浸泡3 h后用蒸餾水洗至中性后備用[12]。

影響最終原花青素純度的因素共5個，包括影響HPD-400大孔樹脂對提取液中原花青素吸附因素：吸附時間、提取液pH值、上樣流速；影響原花青素洗脫的因素：乙醇濃度、洗脫液pH值。具體操作如下。

1）準(zhǔn)確稱取5份預(yù)處理大孔樹脂各2.000 g，放入5個100 mL錐形瓶中，分別加入20 mL原花青素提取液，并用保鮮膜封住瓶口，pH 7.0下，在25℃，100 r/min轉(zhuǎn)速條件下振蕩 10 h，在吸附時間 2、4、6、8、10 h 條件下，參照原花青素檢測方法在500 nm波長下檢測吸附后溶液吸光值，計(jì)算原花青素濃度和吸附率。

2）按照1）中步驟和條件，一定吸附時間下，改變提取液 pH 值分別為 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 進(jìn)行樹脂吸附，檢測吸附后溶液吸光值，計(jì)算原花青素濃度和吸附率。

3）按照2）中最優(yōu)的提取液pH值，上樣總量為20 mL，并以 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL/min 的流速上樣，按照一定的吸附時間收集溶液，計(jì)算原花青素濃度和吸附率。

4）按照上述最優(yōu)吸附時間、提取液pH值、上樣流速，分別稱取2.000 g葡萄籽于5個100 mL錐形瓶中，加入20 mL濃度分別為20%、30%、40%、50%、60%乙醇洗脫液，于25℃，100 r/min轉(zhuǎn)速振蕩8 h后，參照原花青素檢測方法在500 nm波長下檢測洗脫后溶液吸光值，計(jì)算原花青素濃度和洗脫率。

5）按照4）步驟和條件，選擇最適乙醇濃度，調(diào)節(jié)其 pH 值分別為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 進(jìn)行原花青素洗脫，計(jì)算原花青素濃度和洗脫率。

1.2.3 正交試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)中選擇了吸附時間、提取液pH值、上樣流速、乙醇濃度、洗脫液pH值5個因素，綜合試驗(yàn)結(jié)果與純化的時間效率，確定L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平，并利用軟件DX-8設(shè)計(jì)，開展正交試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果的數(shù)學(xué)模型預(yù)測，確定最優(yōu)純化工藝條件。正交因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal factor horizontal design

1.2.4 指標(biāo)測定

1.2.4.1 原花青素濃度及含量的測定

參考草醛法進(jìn)行測定[14]，將1%的香草醛溶液和8%的鹽酸溶液按照1∶1（體積比）配為顯色劑，制備0.1、0.3、0.5 、0.7、0.9 mg/mL 的原花青素標(biāo)準(zhǔn)液，分別取標(biāo)準(zhǔn)液2 mL，加入10 mL的顯色劑，搖勻，30℃下避光保溫30 min，在500 nm波長下檢測吸光值并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1 原花青素測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of the original anthocyanins

取2 mL待測溶液，按照上述方法進(jìn)行檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品原花青素濃度，樣品的原花青素含量計(jì)算公式如下。

式中：W1為原花青素含量，%；C1為原花青素濃度，mg/mL；V1為提取液體積，mL；m1為粗提物凍干后質(zhì)量，mg。

1.2.4.2 多酚濃度及含量的測定

參照文獻(xiàn)[15]的方法，配制0.1 mg/mL沒食子酸溶液，稀釋成 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL 不同梯度，從中分別取0.5 mL沒食子酸依次加入0.2 mg/mL福林酚試劑1 mL、20%Na2CO3溶液1.5 mL，40℃水浴30 min，在波長760 nm下測定吸光值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得線性回歸方程為 Y=7.74X-0.004 3（0＜X＜0.10），R2=0.9965。

取0.5 mL待測樣，按照上述測定方法檢測計(jì)算多酚濃度，多酚含量計(jì)算公式如下。

式中：W2為多酚含量，%；C2為多酚濃度，mg/mL；V2為提取液體積，mL；m1為粗提物凍干后質(zhì)量，mg。

1.2.4.3 DPPH自由基清除率測定

配制 DPPH 標(biāo)準(zhǔn)液濃度為 2、4、6、8、10、12 mg/L，各稱取樣液0.1 mL，加入上述DPPH標(biāo)準(zhǔn)液3.9 mL，立即搖勻，在波長517 nm處測定吸光值，記為Ai，空白對照組以甲醇代替樣品測定吸光值，記為A0，并以抗壞血酸（VC）作為對照組。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下。

DPPH自由基清除率/%=[（A0-Ai）/A0]×100

1.2.4.4 還原力測定

稱量純化后的提取物，以水作為溶劑配制成濃度為 20、40、60、80、100、150 mg/L 的溶液，取 1 mL 依次加入1%鐵氰化鉀溶液2.5mL和pH6.6、濃度為0.2mol/L磷酸鹽緩沖溶液2.5mL，立即混勻，置于50℃恒溫水浴保溫20 min后，加入10%三氯乙酸2.5 mL，混勻后3 000 r/min下離心10 min，吸取2.5 mL上清液，依次加入0.1%三氯化鐵0.5 mL，蒸餾水2.5 mL，在700 nm下檢測吸光值，并以抗壞血酸作為對照組。

1.2.4.5 超氧陰離子自由基清除率測定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[16]的方法稍作改變，提前配制濃度 10、20、30、40、50、60 mg/L 待測液，取 50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.2）4.5 mL，加入 2 mL 蒸餾水，混勻后置于37℃水浴20 min，加入0.5 mL待測溶液，隨后立即加入0.5 mL已預(yù)熱至37℃的25 mmol/L鄰苯三酚溶液，37℃水浴反應(yīng)6 min，最后加入1.0 mL 10 mmol/L的HCl緩沖溶液終止反應(yīng)。取反應(yīng)液用蒸餾水稀釋后在波長325 nm處測定吸光值，超氧陰離子自由基清除率計(jì)算公式如下。

超氧陰離子自由基清除率/%=[1-（Ai-Ai0）/A0]×100

式中：Ai為待測樣吸光值；A0為蒸餾水空白對照的吸光值；Ai0為蒸餾水替代鄰苯三酚參與反應(yīng)體系的吸光值。

1.2.4.6 原花青素純度測定

將HPD-400大孔樹脂吸附純化后的提取物，濃縮、冷凍干燥至恒重，用分析天平稱量樣品質(zhì)量，并根據(jù)下面公式計(jì)算所得原花青素的純度[17-19]。

原花青素純度/%=C1×V1/M

式中：C1為原花青素提取液濃度，mg/mL；V1為所配制待測液體積，mL，M為純化后產(chǎn)物質(zhì)量，mg。

1.2.5 吸附率與洗脫率計(jì)算

吸附率與洗脫率計(jì)算公式如下。

吸附率/%=[（C1-C2）/C1]×100

式中：C1為吸附前溶液中原花青素濃度，mg/mL；C2為吸附后溶液中原花青素濃度，mg/mL。

洗脫率/%=[Cd×Vd/（C0-Cr）×VA]×100

式中：C0為原花青素提取液的初始濃度，mg/mL；Cr為吸附后錐形瓶中原花青素的濃度，mg/mL；Cd為解吸液中的原花青素的濃度，mg/mL；Vd為解吸時所用的溶劑體積，mL；VA為初始加入的樣液體積，mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用軟件DX-8對正交試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)和結(jié)果分析，利用EXCEL進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，利用SPSS 20進(jìn)行多酚、原花青素含量One-way單因素方差顯著性分析，利用GraphPad Prism 8進(jìn)行圖形制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 吸附時間對原花青素濃度和吸附率的影響

吸附時間對原花青素濃度和吸附率的影響見圖2。

圖2 吸附時間對原花青素濃度和吸附率的影響Fig.2 Influence of adsorption time on the concentration and adsorption rate of procyanidins

由圖2可知，隨著吸附時間的延長，原花青素吸附率逐漸上升，8 h以后趨于平緩。而吸附后溶液的原花青素濃度隨時間延長而下降，同樣在8 h趨于平緩，原花青素的吸附率和吸附后溶液濃度變化表現(xiàn)出相關(guān)性。在吸附時間為8 h時，原花青素的吸附率較大，考慮時間成本，選取最佳吸附時間為8 h。

2.1.2 提取液pH值對原花青素濃度和吸附率的影響

提取液pH值對原花青素濃度和吸附率的影響見圖3。

圖3 提取液pH值對原花青素濃度和吸附率的影響Fig.3 Influence of pH value of extraction solution on concentration and adsorption rate of procyanidins

由圖3可知，提取液pH值在4.0～5.5時，原花青素濃度呈現(xiàn)下降趨勢，pH值為5.5～6.0時，其濃度呈現(xiàn)穩(wěn)定的趨勢；結(jié)合原花青素吸附率，在提取液pH值為5.5時，其吸附率最高為84.26%。因此，最佳提取液pH值為5.5。

HPD-400大孔樹脂具有中極性，對離子態(tài)的物質(zhì)幾乎不吸附，只對分子態(tài)物質(zhì)吸附[20]，溶液中pH值往往影響化合物的溶液形態(tài)，進(jìn)而影響樹脂的吸附率。在試驗(yàn)中，在選取的pH值范圍內(nèi)，吸附率的變動范圍為30.26%～84.26%，其波動之大，表明原花青素的吸附受提取液pH值影響較大；在原花青素提取液pH值為5.5時，吸附率最高達(dá)到84.26%。分析其可能原因?yàn)樵趐H 5.5的弱酸性條件下，原花青素溶解度低，并以分子的形式存在，滿足形成氫鍵的條件而易被大孔樹脂吸附。

2.1.3 上樣流速對原花青素濃度和吸附率的影響

上樣流速對原花青素濃度和吸附率的影響見圖4。

圖4 上樣流速對原花青素濃度和吸附率的影響Fig.4 Effect of loading flow rate on procyanidins concentration and adsorption rate

由圖4可知，隨著上樣流速的增加，原花青素濃度出現(xiàn)先上升然后下降的波動趨勢，樹脂對原花青素的吸附率隨流速增加而呈現(xiàn)總體下降的趨勢，僅在流速大于3.0 mL/min后略有回升。上樣流速1.0 mL/min時，吸附率最高。因此選擇最佳的上樣流速為1.0 mL/min。

2.1.4 乙醇濃度對原花青素濃度和洗脫率的影響

乙醇濃度對原花青素濃度和洗脫率的影響見圖5。

圖5 乙醇濃度對原花青素濃度和洗脫率的影響Fig.5 Effects of ethanol concentration on concentration and elution rate of procyanidins

由圖5可知，乙醇濃度在20%～40%時，原花青素濃度呈現(xiàn)上升趨勢，而乙醇濃度在40%～60%時，原花青素的濃度呈現(xiàn)下降趨勢。洗脫率的趨勢與原花青素濃度的變化趨勢一致。綜合分析，乙醇濃度為40%時，原花青素濃度最大，洗脫率最高為81.41%。因此選擇乙醇濃度為40%。

2.1.5 洗脫液pH值對原花青素濃度和洗脫率的影響

洗脫液pH值對原花青素濃度和洗脫率的影響見圖6。

圖6 洗脫液pH值對原花青素濃度和洗脫率的影響Fig.6 Influence of pH value of eluent on concentration and elution rate of procyanidins

由圖6可知，在洗脫液pH值為5.0～7.0時，原花青素濃度呈現(xiàn)快速上升的趨勢；pH值為7.0～9.0時，原花青素的濃度呈現(xiàn)緩慢的下降趨勢。即pH 7.0時，原花青素的濃度達(dá)到最高，結(jié)合洗脫率的結(jié)果，選擇洗脫液pH值為7.0。

2.2 正交試驗(yàn)與驗(yàn)證

單因素試驗(yàn)中選擇了吸附時間、提取液pH值、上樣流速、乙醇濃度、洗脫液pH值5個因素，綜合試驗(yàn)結(jié)果，確定選擇A上樣流速、B乙醇濃度、C提取液pH值、D洗脫液pH值進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental design and results

各因素對原花青素純度的影響主次順序?yàn)锳＞D＞C＞B，其最佳純化工藝為A2B3C1D3，即上樣流速1.0mL/min，乙醇濃度50%，提取液pH5.0，洗脫液pH7.5，在此條件下進(jìn)行3次平行測試驗(yàn)證，原花青素平均純度94.17%，因?yàn)槟Ｐ皖A(yù)測的方案和正交列表的中最優(yōu)組94.5%非常接近，但上樣流速較小，可導(dǎo)致最終原花青素濃度下降，綜合考慮原花青素的提取濃度與純度，所以選擇上樣流速1.0 mL/min。

2.3 抗氧化活性分析

2.3.1 兩種葡萄籽中生物活性物質(zhì)分析

兩種葡萄籽中生物活性物質(zhì)分析結(jié)果見表3。

表3 兩種葡萄籽中生物活性物質(zhì)分析Table 3 Analysis of bioactive substances in two grape seeds

赤霞珠葡萄籽中多酚含量22.72%顯著高于巨峰（P＜0.05），但其中原花青素含量差異不顯著。經(jīng)過純化后，巨峰的純度略高于赤霞珠，但兩者差異未達(dá)到顯著水平。

2.3.2 不同樣品抗氧化活性分析

以VC作為對照，兩種葡萄籽原花青素純化物的抗氧化活性分析結(jié)果見圖7。

圖7 樣品濃度與DPPH自由基清除率、還原性、超氧陰離子自由基清除率的關(guān)系Fig.7 Relationship between DPPH radical，superoxide anion scavenging and reducibility of sample concentration

由圖7可知，在樣品濃度為2 mg/L～12 mg/L內(nèi)，DPPH自由基清除率隨樣品濃度升高逐漸增強(qiáng)。在樣品濃度在20 mg/L～150 mg/L內(nèi)，樣品濃度與樣品還原性呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，隨著濃度增高還原性增強(qiáng)，兩種葡萄籽產(chǎn)物的還原性高于VC對照。樣品濃度在10 mg/L～50 mg/L，3種樣品對超氧陰離子自由基的清除率也隨濃度增加而上升，在50 mg/L～60 mg/L時趨于平緩。本試驗(yàn)中兩種葡萄籽原花青素均具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

3種樣品自由基半數(shù)清除濃度（IC50）與半數(shù)還原性效應(yīng)濃度（EC50）見表 4。

表4 樣品對自由基半數(shù)清除濃度（IC50）與半數(shù)還原性效應(yīng)濃度（EC50）Table 4 Sample 50% scavenging concentration of free radical（IC50）and 50% reducing effect concentration（EC50）

由表4可知，DPPH自由基清除能力依次為赤霞珠＞巨峰＞VC，VC的半數(shù)還原性效應(yīng)濃度最高。還原性大小順序?yàn)槌嘞贾椋揪薹澹綱C。超氧陰離子自由基清除能力的大小關(guān)系為VC＞赤霞珠＞巨峰。

相較于VC的結(jié)構(gòu)，原花青素具有較多的酚羥基，因此能更好地阻止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，達(dá)到清除自由基目的[21]，本試驗(yàn)中兩種葡萄籽原花青素的DPPH自由基的清除能力優(yōu)于VC，這與毛雪等[22]對原花青素抗氧化活性的研究結(jié)果一致。影響還原作用的因素有相對分子質(zhì)量和空間阻位[23]，赤霞珠的還原性高于巨峰，可推測巨峰與赤霞珠所分離的原花青素分子量存在差異，赤霞珠相較巨峰分子空間相對阻位小，表現(xiàn)更高還原性。兩種原花青素純化樣品的半數(shù)效應(yīng)濃度均低于VC的84.734 mg/L，表現(xiàn)較強(qiáng)的生物活性。綜合來看，兩種葡萄籽原花青素具有較強(qiáng)的清除自由基能力，因此具有開發(fā)應(yīng)用的潛力。

3 結(jié)論

通過對影響大孔樹脂HPD-400吸附、洗脫的因素進(jìn)行正交優(yōu)化與驗(yàn)證，優(yōu)化巨峰葡萄籽原花青素純化工藝，并以赤霞珠葡萄籽作為參照，對其原花青素純化與抗氧化活性分析。結(jié)果表明，最優(yōu)工藝為提取液pH 5.0，上樣流速1.0 mL/min，乙醇濃度50%，洗脫液pH 7.5，獲得原花青素純度為94.17%。純化后的原花青素具有較強(qiáng)的清除自由基的能力，表現(xiàn)出良好的抗氧化性，具有開發(fā)應(yīng)用的潛力。