NEK7在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌患者中表達(dá)及其臨床意義

宋燕州，康志龍，蘇一男，張毅明，趙新，李志偉，李偉

近年來，隨著診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌患者的早期發(fā)現(xiàn)率得到了明顯的提高，且針對肝癌發(fā)生及發(fā)展過程中分子機(jī)制的研究為肝癌的治療提供了不同的靶位點，使得肝癌患者預(yù)后較前有了顯著提高。然而，受困于其較高的惡性程度及治療措施的限制性，導(dǎo)致因肝癌所致死亡人數(shù)仍高居于所有腫瘤性死亡患者的第四位［1，2］。NEK7（NIMA-related kinase 7）是一種與細(xì)胞周期調(diào)控及微管形成有著密切關(guān)系的蛋白激酶，研究表明其家族成員在肝癌、膽管癌、乳腺癌及卵巢癌等多種腫瘤細(xì)胞中均具有不同程度的異常表達(dá)［3-5］，而其本身也與膽囊癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系［6］。本研究擬探究NEK7在肝癌組織中的表達(dá)情況，并探究其與肝癌患者生存時間的關(guān)系，以期為肝癌的分子靶向治療提供新的基因位點。

1 資料與方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)庫中mRNA預(yù)后分子與NEK7之間相關(guān)性研究

從TCGA資料庫（http：//gdac.broadinstitute.org/）下載371例具有完整mRNA數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)的患者，采用Illumina HiSeq mRNA Seq和Illumina HiSeq miRNA Seq 3級數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的整合，Cox回歸分析和LASSO計算重要預(yù)后變量，Spearman相關(guān)性分析進(jìn)行與肝癌預(yù)后密切相關(guān)的各個mRNA分子與目的基因NEK7表達(dá)的相關(guān)性分析。

1.2 肝癌患者臨床資料統(tǒng)計與歸納、分析

本研究收集了醫(yī)院2011年1月~2013年6月行手術(shù)治療且經(jīng)病理結(jié)果證實的85例原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌患者的相關(guān)病例資料進(jìn)行統(tǒng)計、歸納、分析。針對所有患者進(jìn)行術(shù)后隨訪，術(shù)后失訪患者13例，有效隨訪72例。所有患者及健康體檢者均得到本人或家屬的知情同意，并報我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 主要試劑

NEK7引物由北京三博遠(yuǎn)志生物公司合成，NEK7單克隆抗體購自美國Proteintech公司，F(xiàn)ast200總RNA提取試劑盒購自飛捷生物公司，SP-9000通用型試劑盒購自日本TAKARA公司，DAB顯色劑購自中國中杉生物公司，Leica2126石蠟切片機(jī)購自萊卡儀器有限公司，顯微鏡及圖像掃描儀購自奧林巴斯公司，PCR儀購自Roche公司。

1.4 免疫組化探究不同組織NEK7表達(dá)情況

于生物標(biāo)本庫中調(diào)取以上所述85例肝癌患者手術(shù)切除肝癌標(biāo)本，隨機(jī)選取20例標(biāo)本，距腫瘤邊緣1~2 cm處切取相同大小癌旁組織，對照組采用20例正常肝臟組織（以上標(biāo)本均經(jīng)病理結(jié)果確認(rèn)），所有組織均固定于10%甲醛溶液中，24 h時后取出，固定組織后進(jìn)行包埋，制作蠟塊、切片后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。石蠟切片60℃烘烤2 h，二甲苯溶液及乙醇進(jìn)行脫蠟水化，抗原修復(fù)后于BSA封閉液中孵育，分別添加1∶200稀釋后NEK7單克隆抗體、SV試劑盒中聚合HRP標(biāo)記抗羊IgG，DAB顯色、蘇木素復(fù)染后予以脫水、透明化，封片后予以烤干。NEK7表達(dá)結(jié)果的判定流程：隨機(jī)觀察5個400倍視野，計算陽性表達(dá)NEK7細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)，按以下數(shù)據(jù)對組織進(jìn)行分類：陰性表達(dá)：0~30%；弱陽性表達(dá)：30%（含30%）~60%，強(qiáng)陽性表達(dá)：60%（含60%）以上。

1.5 隨訪信息

針對所有肝癌患者，自其手術(shù)后進(jìn)行電話隨訪，以患者死亡時間為隨訪終止時間，85例肝癌患者中，失訪患者13例，有效隨訪72例。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間差異的比較采用卡方檢驗及t檢驗，檢驗不同NEK7表達(dá)情況與肝癌患者生物學(xué)特征之間的關(guān)系，分析影響肝癌患者的預(yù)后因素，Kaplan-Meier繪制NEK7陽性與陰性患者的生存曲線。以上比較均以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mRNA預(yù)后分子與NEK7之間相關(guān)性研究

371例具有完整mRNA數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)的患者，經(jīng)過Cox回歸分析和LASSO計算后CCDC21、GTF3C2和DBF4為與患者預(yù)后密切相關(guān)的mRNA分子，Spearman相關(guān)性分析表明CCDC21及GTF3C2與NEK7之間的表達(dá)具有顯著的相關(guān)性（表1），提示NEK7與肝癌的關(guān)系密切。

表1 mRNA數(shù)據(jù)與NEK7之間的相關(guān)性

2.2 免疫組化探究不同組織NEK7表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果表明，相較于癌旁組織及肝臟組織，肝癌組織中NEK7呈陽性表達(dá)（圖1），不同分化肝癌組織中，低分化肝癌組織NEK7呈強(qiáng)陽性表達(dá)，高分化肝癌組織中呈弱陽性表達(dá)（圖2），肝癌組織中NEK7陽性表達(dá)率高于癌旁組織及肝臟組織，其在三種組織中陽性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）（表2）。

圖1 不同組織NEK7表達(dá)情況A：肝癌組織；B：癌旁組織；C：肝臟組織；400×

圖2 不同分化肝癌組織NEK7表達(dá)情況A：低分化肝癌組織NEK7呈強(qiáng)陽性表達(dá)；B：高分化肝癌組織NEK7呈弱陽性表達(dá)，400×

表2 NEK7在肝癌、癌旁及肝臟組織中的表達(dá)情況［n（%）］

2.3 NEK7表達(dá)情況與患者病理生理指標(biāo)之間關(guān)系

單因素分析比較表明，在肝癌組織中NEK7陽性表達(dá)及陰性表達(dá)與臨床病理特征如性別、年齡、是否合并肝炎、Child分級、肝癌分期、分化程度及腫瘤大小等差異情況均無相關(guān)性，與是否合并癌栓及生存時間之間則顯著相關(guān)，進(jìn)一步分析則表明，組織中NEK7是否呈強(qiáng)陽性表達(dá)與臨床病理特征如性別、年齡、是否合并肝炎、肝癌分期、腫瘤大小等均無顯著相關(guān)性，與腫瘤的分化程度、Child分級、是否合并癌栓及生存時間之間具有相關(guān)性（表3）。

表3 NEK7表達(dá)情況與肝癌臨床病理特征關(guān)系

2.4 患者生存時間與病理生理指標(biāo)之間的關(guān)系

針對可能影響患者生存時間的臨床病理特征進(jìn)行單因素分析，結(jié)果表明：患者生存時間與臨床病理特征如性別、年齡、是否合并肝炎、Child分級、肝癌分期及腫瘤大小等無顯著相關(guān)性，與分化程度、是否合并癌栓及NEK7表達(dá)情況之間則具有相關(guān)性（表4）。

表4 患者生存時間與臨床病理特征之間關(guān)系

2.5 NEK7表達(dá)情況與患者生存時間之間的關(guān)系

根據(jù)肝癌組織中NEK7陽性及陰性表達(dá)情況，將患者分為兩組，Kaplan-Meier繪制患者生存時間曲線，相比較于NEK7陰性表達(dá)患者，NEK7陽性表達(dá)組患者的總生存率顯著降低（圖3）。

圖3 不同NEK7表達(dá)肝癌患者Kaplan-Meier相較于NEK7陰性表達(dá)患者，NEK7陽性表達(dá)患者生存時間顯著縮短

3 討論

1975年，Morris等［7］在對曲霉菌有絲分裂突變體的研究中，將鑒定出來的細(xì)胞周期突變體命名為nim（never in mitoshs），進(jìn)一步的研究在nim中發(fā)現(xiàn)了4個等位基因nimA［8］，功能學(xué)研究表明nimA可以編碼一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，進(jìn)而通過調(diào)節(jié)紡錘體極而影響有絲分裂。隨后Letwin等［9］從小鼠中分離出了與nimA相關(guān)的基因，即NEK1基因，隨后相繼分離出了與NEK1相似的基因家族，即NEK基因家族［10］。

NEK家族異常表達(dá)的結(jié)果常會導(dǎo)致細(xì)胞周期的調(diào)控異常，使得細(xì)胞的分化、增殖出現(xiàn)異常，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生。Hayward等［11］研究表明乳腺癌中NEK2具有異常高表達(dá)的現(xiàn)象；Kokuryo等［12］的研究則顯示膽管癌中NEK2呈高表達(dá)狀態(tài)；Cao等［13］在肝癌細(xì)胞的研究結(jié)果則表明NEK6與肝癌的發(fā)生發(fā)展之間具有一定的關(guān)聯(lián)性。

作為NEK家族中的重要一員，NEK7在多種實體腫瘤中呈不同程度的高表達(dá)狀態(tài)，既往研究表明在膽囊癌組織中NEK7同樣呈高表達(dá)狀態(tài)，且與患者生存時間之間呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性［6］；Yan等［14］研究顯示NEK7促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲、粘附、增殖和肝轉(zhuǎn)移能力，NEK7的高表達(dá)患者伴隨著較差的預(yù)后生存結(jié)果。本研究結(jié)果表明相較于肝癌癌旁組織及正常肝臟組織，NEK7在肝癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，研究結(jié)論與Wang等［6］膽囊癌中研究結(jié)果相一致。進(jìn)一步分析表明NEK7表達(dá)水平及強(qiáng)度與是否合并有癌栓及肝癌組織分化程度相關(guān)，提示NEK7可能促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的分化能力及侵襲轉(zhuǎn)移能力，然而針對肝癌分期及腫瘤大小等病理學(xué)特征比較之后，NEK7陽性表達(dá)情況并無顯著差別，提示本研究樣本數(shù)據(jù)可能不夠充分，另一方面則表明NEK7可能參與了肝癌整個發(fā)生、發(fā)展過程，且影響力未隨著時間的推移而減弱。生存分析表明高表達(dá)NEK7的肝癌患者，其生存時間較低表達(dá)者顯著縮短，預(yù)后因素分析則表明NEK7為影響肝癌患者生存時間的危險因素，表明NEK7作為肝癌患者預(yù)后預(yù)測的靶標(biāo)分子的可行性，針對NEK7高表達(dá)患者，術(shù)后早期即可采取有效的干預(yù)措施，節(jié)省醫(yī)療資源的同時，可有效延長術(shù)后高危肝癌患者的生存時間。

總之，鑒于NEK在各種類型腫瘤細(xì)胞系中高度表達(dá)，其可能與多種腫瘤的快速復(fù)發(fā)和不良結(jié)果相關(guān)，抑制NEK可在體外和體內(nèi)對多種類型的腫瘤產(chǎn)生抗癌作用［15］。后續(xù)體外實驗及動物實驗研究中進(jìn)一步探究NEK7與肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為之間的相關(guān)性，及其產(chǎn)生影響的具體分子機(jī)制，將有可能使NEK7成為肝癌診斷及治療的靶向分子。