桂千金子提取物對(duì)金黃色葡萄球菌體外抗菌作用及機(jī)制的初步研究*

王鶴齡，譚珍媛，馮鐘文，龐麗君，黃瑀莘，陳思韻，韋錦斌△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021）

桂千金子（Polygonum runcinatumBuch.Ham.）為草本植物藥蓼科植物赤脛散的根莖。瑤醫(yī)以其入藥，有清熱解毒，活血止痛，解毒消腫之功效，用于治療急性胃腸炎，月經(jīng)不調(diào)，乳腺炎，癰癤腫毒等[1-3]。癤、癰為急性化膿性感染，病原菌幾乎為金黃色葡萄球菌[4]，金黃色葡萄球菌感染往往會(huì)局部擴(kuò)散，引起膿腫和癰腫，若不及時(shí)治療，可能導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥[5]，而多重耐藥菌的出現(xiàn)又會(huì)降低用于治療皮膚感染的抗生素的有效性[6]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，在10 種常見致病菌中，桂千金子對(duì)金黃色葡萄球菌有較好的抑菌作用。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)桂千金子的民間用法及文獻(xiàn)參考[7-11]，以水提取物、乙醇提取物及其乙酸乙酯、正丁醇萃取物作為供試藥物對(duì)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（SA）及臨床分離的金黃色葡萄球菌菌株（MSSA）和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）進(jìn)行體外抗菌實(shí)驗(yàn)[12-13]，初步探究臨床分離MRSA菌株抗菌作用機(jī)制，進(jìn)一步明確桂千金子的有效抗菌活性。

1 材料與方法

1.1 藥材

瑤藥桂千金子于2019 年3 月收采于廣西壯族自治區(qū)北流市六麻鎮(zhèn)，經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥學(xué)教研室李瓊老師鑒定，確定為蓼科植物赤脛散（Polygonum runcinatum）的干燥根莖。藥材自然晾干后粉碎為粗粉，備用。

1.2 待測(cè)菌株

SA（CMCC26003）由廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物教研室提供。MSSA4431 和MRSA4290 由廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科分離鑒定（全自動(dòng)微生物鑒定分析系統(tǒng)VIREK 2Compact 60）并提供。

1.3 藥品和主要試劑

青霉素藥敏紙片（含量：10 μg，批號(hào)：20190823）、萬(wàn)古霉素藥敏紙片（含量：30 μg，批號(hào)：20190823）購(gòu)自常德比克曼生物科技有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：20190920）購(gòu)自常德比克曼生物科技有限公司、MH（B）培養(yǎng)基（批號(hào)：705G031）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 菌懸液的制備

按無(wú)菌操作法[14-15]，將待測(cè)菌接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，于35 ℃條件下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)種活化；取活化后少量待測(cè)菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，挑取適量以0.9%氯化鈉注射液調(diào)整菌懸液濃度至0.5 麥?zhǔn)蠞岫葐挝?，此時(shí)濃度約為1.5×108CFU/mL，備用；另取適量稀釋至1.5×106CFU/mL，備用。

1.5 桂千金子提取物的制備

1.5.1 水提物的制備 取桂千金子粗粉20 g，加入10 倍量純水充分浸泡2 h 后，煎煮2 次，每次1 h，合并2 次濾液，水浴蒸干，得水提物7.44 g。取適量水提物以0.9%氯化鈉注射液溶解，制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL 的藥液，備用。試驗(yàn)前所有藥液均用0.22 μm濾膜過濾除菌。

1.5.2 有機(jī)提取物的制備 取桂千金子粗粉20 g，以10 倍量乙醇浸泡過夜，回流提取至無(wú)色，抽濾后合并濾液，旋蒸減壓，蒸干得乙醇提取物3.78 g，備用；取適量乙醇提取物用純水溶解后，用乙酸乙酯萃取，旋蒸減壓，干燥后得到萃取物0.09 g，剩余水溶液用正丁醇萃取得到萃取物0.19 g，分別用含10%DMSO的0.9%氯化鈉注射液溶解，制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL 的藥液，備用。試驗(yàn)前所有藥液均用0.22 μm濾膜過濾除菌。

1.6 體外抗菌作用考察

1.6.1 管碟法測(cè)定抑菌圈 按無(wú)菌操作法，用無(wú)菌棉簽蘸取待測(cè)菌懸液至營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，涂布均勻，將牛津杯等距分散放置，靜置10 min 使其固定，精確移取各提取物藥液100 μL 至牛津杯中，室溫下放置0.5 h 使藥液擴(kuò)散。每個(gè)培養(yǎng)基均設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組（青霉素藥敏紙片、萬(wàn)古霉素藥敏紙片）和空白對(duì)照組（含10%DMSO 的0.9%氯化鈉注射液）。各培養(yǎng)基置于35 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，取出觀察并測(cè)量抑菌圈直徑。抑菌指標(biāo)判定：抑菌圈直徑（IZD）≥15 mm為高度敏感，10≤IZD＜15 mm為中度敏感，5≤IZD＜10 mm 為輕度敏感，IZD＜5 mm為不敏感。IZD越大，表明待測(cè)提取物抗菌作用越強(qiáng)[16]。

1.6.2 二倍稀釋法測(cè)定最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）按無(wú)菌操作法，取一次性96 孔板，精確吸取各提取液分別加入200 mL 第1 孔，混勻后吸取100 mL至第2孔，如此連續(xù)倍比稀釋至第9孔，作為實(shí)驗(yàn)組；第10孔作為藥液對(duì)照組加入菌液和藥液；第11 孔作為陽(yáng)性對(duì)照組加入培養(yǎng)基和菌液；第12 孔作為陰性對(duì)照組加入培養(yǎng)基；含10%DMSO 的0.9%氯化鈉注射液作為空白對(duì)照組。將各組置于35 ℃生化培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h 后，取出觀察菌株生長(zhǎng)情況。在黑色背景光源下觀察，顯示清亮則判定無(wú)菌生長(zhǎng)，顯示渾濁則判定有菌生長(zhǎng)，以無(wú)菌生長(zhǎng)孔所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為該組的MIC。

分別從上述各組無(wú)菌生長(zhǎng)孔中吸取培養(yǎng)液100 μL，接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿中，均勻涂布，培養(yǎng)24 h 后計(jì)算平板上的菌落，以活菌計(jì)數(shù)法表示平均菌落數(shù)＜5個(gè)對(duì)應(yīng)的最小稀釋度的提取物質(zhì)量濃度為MBC[16]。

1.7 抗菌作用機(jī)制考察

1.7.1 堿性磷酸酶（AKP）活性的測(cè)定 加入MRSA4290 菌懸液使桂千金子乙醇提取液最終濃度達(dá)到4 MIC、1 MIC 和0.5 MIC，以不加桂千金子乙醇提取液的作為空白對(duì)照組。將以上培養(yǎng)基置于35 ℃的搖床中培養(yǎng)，每2 h取樣，5 000 r/min離心10 min，取上清，酶標(biāo)儀測(cè)定AKP 活性。OD 值越大，表示AKP活性越大，則細(xì)胞壁通透性增大。

1.7.2 DNA/RNA 大分子含量測(cè)定 方法同“1.7.1項(xiàng)”，以空白對(duì)照組作為調(diào)零組，用紫外分光光度計(jì)在260 nm 處測(cè)定吸光度。OD 值越大，表示外流DNA/RNA大分子含量越高，則細(xì)胞膜通透性增大。

1.7.3 胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量測(cè)定 方法同“1.7.1項(xiàng)”，將以上培養(yǎng)基置于35 ℃的搖床中培養(yǎng)，每2 h取樣，以肉湯培養(yǎng)基調(diào)節(jié)待測(cè)組樣品的OD600值一致。取4 mL 菌懸液，離心，以滅菌生理鹽水洗滌菌體沉淀3 次后，加入300 μL PBS 緩沖液，100 W 超聲1 h，離心，取上清液，酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白含量。OD 值越大，表示胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量越高，則胞內(nèi)蛋白合成未受抑制。

1.7.4 殺菌曲線的測(cè)定 以MRSA4290 菌懸液調(diào)節(jié)桂千金子乙醇提取液的濃度達(dá)到4 MIC、1 MIC和0.5 MIC，以不加乙醇提取液的作為陽(yáng)性對(duì)照組。各培養(yǎng)基置于35 ℃的搖床中培養(yǎng)，在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、16 h、20 h、24 h、30 h取樣，使用酶標(biāo)儀測(cè)定菌液OD600值，繪制殺菌曲線。OD 值越大，表示菌懸液濃度越高，則MRSA 正常生長(zhǎng)未受限制。

1.7.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 以MRSA4290 菌懸液調(diào)節(jié)桂千金子乙醇提取液的濃度達(dá)到4 MIC、1 MIC和0.5 MIC，以不加乙醇提取液的作為空白對(duì)照組。各培養(yǎng)基置于35 ℃的搖床中培養(yǎng)，在2 h和6 h取樣，5 000 r/min 離心5 min，棄上清液。沉淀經(jīng)固定、洗脫、噴鍍后，在FEI Quattro鎢絲燈掃描電鏡下掃描觀察MRSA4290細(xì)胞形態(tài)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。組間比較采用方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 桂千金子提取物的抑菌活性大小

桂千金子水提物無(wú)抑菌圈；乙醇提取物及其乙酸乙酯、正丁醇萃取物的抑菌圈均≥15 mm，為高度敏感，見表1、圖1。

圖1 桂千金子提取物抑菌圈直徑的測(cè)定結(jié)果

表1 桂千金子提取物抑菌圈直徑的測(cè)定結(jié)果 mm，，n=3

表1 桂千金子提取物抑菌圈直徑的測(cè)定結(jié)果 mm，，n=3

“—”為未進(jìn)行試驗(yàn)；“N”為無(wú)抑菌圈。

2.2 桂千金子提取物對(duì)SA26003、MSSA4431、MRSA4290的MIC和MBC

桂千金子乙醇提取物及其乙酸乙酯萃取物對(duì)SA26003、MSSA4431、MRSA4290 的MIC 和MBC分別為1.56 mg/mL和3.13 mg/mL，其正丁醇萃取物的MIC 和MBC 分別為6.25～12.50 mg/mL 和12.50～25.00 mg/mL。MIC 測(cè)定結(jié)果見表2～表4，MBC 測(cè)定結(jié)果見表5。

表2 桂千金子提取物對(duì)SA26003的MIC測(cè)定結(jié)果 n＝3

表3 桂千金子提取物對(duì)MSSA4431的MIC測(cè)定結(jié)果 n＝3

表4 桂千金子提取物對(duì)MRSA4290的MIC測(cè)定結(jié)果 n＝3

表5 桂千金子提取物的MBC測(cè)定結(jié)果 n＝3

2.3 桂千金子乙醇提取物對(duì)MRSA4290 的抗菌作用機(jī)制

與空白對(duì)照組和0.5 MIC實(shí)驗(yàn)組比較，4 MIC和1 MIC 實(shí)驗(yàn)組的AKP 活性隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，MIC實(shí)驗(yàn)組胞外的AKP 活性低于4 MIC 實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）；培養(yǎng)基中未檢測(cè)出DNA/RNA 大分子物質(zhì)，各實(shí)驗(yàn)組OD值與空白對(duì)照組比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)到胞內(nèi)蛋白含量減少，各實(shí)驗(yàn)組OD 值與空白對(duì)照組比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）。由陽(yáng)性對(duì)照組繪制的生長(zhǎng)曲線可知，MRSA菌在4 h內(nèi)處于生長(zhǎng)適應(yīng)期，4～14 h 處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，14～30 h處于穩(wěn)定期，與陽(yáng)性對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組OD值增加緩慢，4 MIC實(shí)驗(yàn)組沒有明顯的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，其抑制作用較1 MIC和0.5 MIC實(shí)驗(yàn)組更明顯（P＜0.05），見圖2。

圖2 桂千金子乙醇提取物對(duì)MRSA4290的作用機(jī)制

2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

空白對(duì)照組MRSA 菌體在2 h 和6 h 均保有完好的外部形態(tài)，光滑呈葡萄串狀；0.5 MIC 和1 MIC實(shí)驗(yàn)組在6 h 菌體形態(tài)發(fā)生改變；4 MIC 實(shí)驗(yàn)組在2 h菌體形態(tài)改變，表面粗糙有少量白點(diǎn)，在6 h菌體粗糙情況更明顯，表面出現(xiàn)大量顆粒物附著，細(xì)胞體積增大，見圖3。

圖3 桂千金子乙醇提取物對(duì)MRSA4290細(xì)胞形態(tài)的影響

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以桂千金子提取物進(jìn)行體外抗菌實(shí)驗(yàn)，除水提物外，各提取物均具有不同程度的抗菌活性，抗菌強(qiáng)度排序?yàn)橐掖继崛∥铩忠宜嵋阴ポ腿∥铮菊〈驾腿∥?。在前期藥材提取過程中發(fā)現(xiàn)，相較于乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物，乙醇提取物得率較高，出于經(jīng)濟(jì)性和時(shí)間成本考慮，以桂千金子桂乙醇提取物作為最優(yōu)實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，從中進(jìn)一步分離提純，尋找桂千金子的有效抗菌活性成分。

桂千金子乙醇提取物及其乙酸乙酯萃取物的抗菌效果相一致，可能與桂千金子的主要成分黃酮類化合物相關(guān)[17]，黃酮類化合物在抗菌方面占有顯著優(yōu)勢(shì)[18]。桂千金子有機(jī)提取物均呈酸性，乙酸乙酯萃取物則顯示較強(qiáng)的酸性，考慮其可能與桂千金子含有酚酸類化學(xué)成分等有關(guān)[19-20]，其中沒食子酸為一種有機(jī)酸，在體外對(duì)金黃色葡萄球菌等有抑制作用，該發(fā)現(xiàn)為后續(xù)深入開展抗菌實(shí)驗(yàn)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

細(xì)菌性疾病危及人類健康及公共衛(wèi)生安全。目前，細(xì)菌耐藥問題日益凸顯，臨床上仍以抗生素治療感染性疾病為主。王夢(mèng)瑜等[21]在分析近1 300種中藥后認(rèn)為，具備抗菌活性的中藥通過有效成分的篩選，可為耐藥菌的逆轉(zhuǎn)研究提供參考，在中藥中需求新的抗菌藥物是解決耐藥問題的有效途徑之一。本實(shí)驗(yàn)研究桂千金子提取物對(duì)SA26003、MSSA4431、MRSA4290的抗菌作用，明確了桂千金子對(duì)金黃色葡萄球菌切實(shí)有效的抗菌活性，且對(duì)臨床分離MRSA菌株也有具有較好的抗菌效果，進(jìn)一步對(duì)臨床分離MRSA菌株進(jìn)行抗菌作用機(jī)制初探，外流AKP活性升高及掃描電鏡結(jié)果一致表明，桂千金子乙醇提取物可能造成細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破損，或?qū)е履撤N物質(zhì)外流，影響細(xì)菌生長(zhǎng)代謝，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果既驗(yàn)證了桂千金子在民間治療癰癤之功效，也為臨床尋求對(duì)抗MRSA有效藥物提供了新思路。

本研究為桂千金子在民族瑤藥中的開發(fā)利用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，而具有抗菌作用的具體有效活性成分及其抗菌機(jī)制有待進(jìn)一步研究。