植物比葉面積量化：ImageJ軟件法與打孔稱重法的比較*

林權(quán)虹，陳 朧，鄭禹軒，馬素輝，田 地

（1.首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048；2.北京大學(xué)城市與環(huán)境學(xué)院，北京大學(xué)生態(tài)研究中心，北京 100871；3.北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，北京 100083）

0 引 言

葉片是植物進(jìn)行光合作用、呼吸作用和蒸騰作用的重要器官，也是與環(huán)境接觸面積最大的器官之一［1］.葉片功能性狀可以反映植物的生理生態(tài)過程以及植物對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)［2］.作為重要的葉片功能性狀之一，比葉面積（specific leaf area，SLA）是指葉片面積和葉片干質(zhì)量的比值.在個(gè)體水平上，SLA與葉片氮含量、葉片壽命、凈光合速率和植株相對(duì)生長(zhǎng)速率等密切相關(guān)［3-5］，通常SLA較高的植物，其單位質(zhì)量葉片氮含量高、葉片壽命短、凈光合速率較高和植株生長(zhǎng)速率較快［6-9］.在群落水平上，SLA是群落演替的重要特征之一，如Lu等［10］和胡耀升等［11］的研究表明SLA隨森林演替的進(jìn)程而發(fā)生不同變化.在生態(tài)系統(tǒng)水平上，通過SLA、葉片干物質(zhì)含量和根莖性狀等的變化可以預(yù)測(cè)草地生態(tài)系統(tǒng)對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)［12］.此外，SLA還可以通過影響冠層密度來間接調(diào)節(jié)生態(tài)系統(tǒng)的溫度［13］.因此，在不同的研究尺度上，精確測(cè)定SLA是非常必要的.

不同方法測(cè)量SLA的差異主要源于葉面積測(cè)定數(shù)據(jù)的差異性.傳統(tǒng)的葉面積測(cè)量方法主要有方格計(jì)數(shù)法、長(zhǎng)寬校正法和打孔稱重法等，其中，方格計(jì)數(shù)法費(fèi)時(shí)且復(fù)雜，不適宜在野外進(jìn)行測(cè)定［14-15］；長(zhǎng)寬校正法需根據(jù)植物類型、品種、葉形和生育期等調(diào)整校正系數(shù)，不具有通用性［16-17］；打孔稱重法基于相近葉位葉片的SLA相對(duì)恒定的原理，通過測(cè)量選定區(qū)域葉片的面積與干質(zhì)量，從而計(jì)算得到SLA，能人為避開部分植物葉脈對(duì)SLA客觀準(zhǔn)確性的影響［18-19］，在傳統(tǒng)測(cè)量葉面積中的應(yīng)用較為廣泛.隨著技術(shù)的發(fā)展，電子測(cè)定技術(shù)和圖像處理法成為目前常用的SLA測(cè)量法.電子測(cè)定技術(shù)包括葉面積儀法和求積儀法等，前者操作簡(jiǎn)單、精確度高，但對(duì)葉片的形狀有一定的限制，如卷曲葉片難以測(cè)定［20］，而且儀器價(jià)格昂貴、維修困難，葉片掃描速度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響也較大［21］，導(dǎo)致該方法難以推廣；后者易受儀器自身狀況、測(cè)算方法、葉形等因素的影響［22］.圖像處理法是建立在計(jì)算機(jī)圖像處理基礎(chǔ)上的新方法，可以快速測(cè)量大量葉片的葉面積［23］.目前最常用的圖像處理軟件有Photoshop、Matlab和ImageJ等.Photoshop軟件可以任意選擇區(qū)域，為病蟲害葉片或形狀不規(guī)則葉片葉面積的分析提供了可能［24］，但是在測(cè)量如胡麻（Linum usitatissimumL.）等小葉、多葉片植物時(shí)，其工作量大、人為誤差較大［25］；Matlab軟件具有完善的圖像處理技術(shù)和高效的數(shù)據(jù)計(jì)算能力，可以批量處理圖片，但是需要一定的編程水平［26］；ImageJ軟件通過簡(jiǎn)單的人為設(shè)置，能大批量處理樣品，還可儲(chǔ)存輸出結(jié)果便于進(jìn)一步分析［27］，在應(yīng)用上更為快捷.

不同葉面積測(cè)量方法在實(shí)驗(yàn)成本和操作便捷度上存在較大差異.那么，其測(cè)得的SLA數(shù)值是否存在顯著差異？野外植物的物種多樣性極高，哪一種方法能更加精確地測(cè)量不同植物的SLA？或者對(duì)于特定的植物而言，不同方法是否各自具有測(cè)量?jī)?yōu)勢(shì)？這些問題關(guān)系到植物SLA測(cè)定的精確性，目前尚待解決.基于此，本文以ImageJ軟件法和打孔稱重法為例，分別測(cè)定不同物種不同葉形的SLA，比較2種方法測(cè)定結(jié)果的差異性和精確性，闡明其對(duì)不同物種和不同葉形植物SLA測(cè)定結(jié)果的影響，并分析引起SLA差異的潛在原因，以期為野外快速精確測(cè)定SLA提供方法選擇上的建議，同時(shí)為其他相關(guān)研究數(shù)據(jù)分析以及模型模擬提供參考.

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于浙江省舟山市（121°30′～123°25′E，29°32′～31°04′N）與北京市海淀區(qū)（116°03′～116°23′E，39°53′～40°09′N）.浙江省舟山市屬北亞熱帶季風(fēng)氣候，該地區(qū)植物物種豐富度高，植被受人類活動(dòng)干擾少.北京市海淀區(qū)地處華北平原的北部邊緣地帶，屬暖溫帶半濕潤(rùn)半干旱大陸性季風(fēng)氣候，四季分明.

1.2 葉片采集

于2019年7—8月前往浙江省舟山市的東海大峽谷（最高海拔478 m）和舟山長(zhǎng)崗森林公園（最高海拔303 m）采集亞熱帶地區(qū)植物葉片；于2019年9月在北京市海淀區(qū)采集溫帶地區(qū)植物葉片.具體采樣時(shí)，選取枝葉繁茂并能接受到全光照的植株為目標(biāo)，在每棵植株向陽(yáng)面的上、中、下位置分別采集若干片完整成熟的葉片［28］，2個(gè)地區(qū)各物種的葉片均采集12片以上.葉片去除葉柄后，放于-4℃冰箱中低溫保存.

1.3 種屬鑒別與葉片信息收集

首先，根據(jù)葉形、雌雄蕊類型和果實(shí)類型等形態(tài)特征，對(duì)植物進(jìn)行初步辨認(rèn)；其次，針對(duì)較難確認(rèn)的植物，提取植物葉片DNA，將其與美國(guó)國(guó)家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）已有序列信息比對(duì)實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確鑒定.將鑒定植物物種名錄在中國(guó)植物志數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.iplant.cn/frps）中進(jìn)行檢索，獲取葉片形狀信息.經(jīng)鑒定，共獲取39個(gè)物種的分類信息以及1 468片葉片的葉形概況（表1）.各物種的葉片形狀包括：三角卵形、寬卵形、卵狀披針形、倒披針形和長(zhǎng)圓形等，大致可歸類為卵形、披針形和橢圓形這3種基本形狀，各形狀葉片的物種數(shù)分別為18、12和9種.

表1 39個(gè)物種的物種分類信息及葉形概況

1.4 Image軟件法測(cè)定葉面積

以8片葉片為1組進(jìn)行編號(hào)（若葉片過大或過小，則視情況改變分組的葉片數(shù)量），展平后鋪于掃描板上（佳能（中國(guó)）有限公司，型號(hào)為Canon Scan LIDE400），以300 DPI的分辨率依次對(duì)葉片進(jìn)行灰度掃描，圖片保存為jpeg格式.使用ImageJ軟件分別計(jì)算掃描圖片中的葉片總面積（S1），單位為cm2.

1.5 打孔稱重法測(cè)定葉面積

使用打孔器（直徑6 mm）對(duì)掃描后的葉片均勻打孔（避開主脈），統(tǒng)計(jì)打孔數(shù)量（n）.常規(guī)情況下，每片葉片打孔10個(gè)，因三峽槭（Acer wilsonii）和臭椿（Ailanthus altissima）的葉面積較小，分別打孔5和6個(gè)，記錄打孔所得的圓形葉片總面積（S2），單位為cm2.

1.6 葉片質(zhì)量

將葉片按物種歸類，分別封裝于信封中，在65℃烘箱中烘干48 h至恒質(zhì)量后，使用分析天平（精度1 mg）分別稱量打孔后葉片和打孔所得圓形葉片的質(zhì)量，記為m1和m2，單位為g.

1.7 數(shù)據(jù)處理

式中：ASL1為ImageJ軟件法測(cè)得的SLA，ASL2為打孔稱重法測(cè)得的SLA，單位均為cm2/g.

所有統(tǒng)計(jì)分析均采用R（R Core Team，2020）完成.首先，對(duì)2種方法獲得的SLA數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)；其次，分別進(jìn)行四分位統(tǒng)計(jì)與配對(duì)樣本t檢驗(yàn)（對(duì)不滿足正態(tài)分布或方差齊性的數(shù)據(jù)進(jìn)行開方轉(zhuǎn)換）；再次，采用多元線性回歸，分析葉形、物種和測(cè)量方法及其交互作用對(duì)SLA的影響；最后，為了剔除物種信息對(duì)SLA測(cè)定值的影響，對(duì)每個(gè)物種的所有SLA樣本數(shù)據(jù)取平均值，再用每個(gè)樣本的SLA值減去該平均值，由此得到該樣本校正后的SLA，即去除物種信息影響后的殘差，然后對(duì)該殘差與測(cè)量方法進(jìn)行一元線性回歸分析［29］.當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為采用不同測(cè)量方法計(jì)算得到的SLA差異顯著.

使用變異系數(shù)（coefficient of variance，CV）分析數(shù)據(jù)的離散程度，基于此評(píng)估SLA測(cè)定方法的精確度，其計(jì)算公式為：

式中：為平均值，SD為標(biāo)準(zhǔn)偏差，CV1為 ImageJ軟件法的變異系數(shù)，CV2為打孔稱重法的變異系數(shù)，ΔCV為2種變異系數(shù)的差值.當(dāng)ΔCV＞0時(shí)，認(rèn)為采用打孔稱重法測(cè)定SLA更適合；當(dāng)ΔCV＜0時(shí)，認(rèn)為采用ImageJ軟件法測(cè)定SLA更適合；當(dāng)ΔCV=0時(shí)，在對(duì)精確度要求不高的情況下，2種方法均可采用［30］.

2 結(jié) 果

2.1 測(cè)量差異性

多元線性回歸結(jié)果表明，物種和測(cè)量方法存在顯著的交互作用（F=201.890，P＜0.05），在個(gè)體水平上，物種解釋了72.6%的SLA變化.不同方法計(jì)算39個(gè)物種SLA的差異性與精確性的結(jié)果如表2所示，采用ImageJ軟件法和打孔稱重法測(cè)得的所有物種的SLA變化范圍分別為（63.925±0.925）～（392.489±29.296）和（73.779±1.153）～（387.060±12.386）cm2/g.配對(duì)樣本t檢驗(yàn)的結(jié)果表明，與打孔稱重法相比，有30個(gè)物種采用ImageJ軟件法測(cè)量得出的SLA顯著偏低（t=-26.242～4.314，P＜0.05）.

表2 不同方法計(jì)算39個(gè)物種比葉面積（SLA）的差異性與精確性

繪制不同葉形SLA的四分位數(shù)對(duì)比圖（圖1），可知，除7號(hào)伏牛山箭竹（Fargesia funiushanensis）和32號(hào)桑（Morus alba）以外，采用ImageJ軟件法計(jì)算得出的SLA普遍要比打孔稱重法低.此外，采用這2種方法測(cè)得的SLA的上下限差值、25%和75%中位數(shù)的分布范圍也呈現(xiàn)出類似特點(diǎn).

圖1 不同方法計(jì)算SLA的四分位數(shù)對(duì)比

2.2 測(cè)量精確性

進(jìn)一步對(duì)比SLA差異顯著的30個(gè)物種的ΔCV，其中有22個(gè)物種的ΔCV＜0，說明這22個(gè)物種采用ImageJ軟件法測(cè)得的SLA的離散程度更小，測(cè)得的SLA精確度更高；其余8個(gè)物種計(jì)算得到的ΔCV＞0，即這8個(gè)物種采用打孔稱重法得到的SLA更精確.

2.3 不同葉形與物種的影響

對(duì)39個(gè)物種分葉形進(jìn)行比較，經(jīng)配對(duì)樣本t檢驗(yàn)得到的SLA差異不顯著的9個(gè)物種中，有6種具卵形葉片，3種具披針形葉片；在SLA差異顯著的30個(gè)物種中，其葉形為卵形、披針形和橢圓形的物種數(shù)分別為12、9和9種.22個(gè)物種采用ImageJ軟件法測(cè)量更精確，其葉形包括披針形（8種）、卵形（8種）和橢圓形（6種）；8個(gè)物種采用打孔稱重法測(cè)量更精確，其葉形包括披針形（1種）、卵形（4種）和橢圓形（3種）.對(duì)不同葉形和物種的SLA進(jìn)行多元線性回歸分析，結(jié)果表明2種方法對(duì)不同物種SLA的測(cè)定結(jié)果有顯著差異（F=2.276，P＜0.05），但對(duì)不同葉形植物的SLA測(cè)定無(wú)顯著影響（P=0.54）.剔除物種的影響后，僅考慮測(cè)量方法對(duì)SLA影響的分析表明，大多數(shù)物種采用ImageJ軟件法測(cè)得的SLA仍然比打孔稱重法低（F=36.895，P＜0.05）.

3 討 論

3.1 測(cè)量方法引起差異的潛在原因

前人針對(duì)采用不同方法測(cè)定葉面積展開了大量研究.如：柯嫻氡等［31］利用方格紙法、紙樣稱重法、葉面積儀法和掃描法測(cè)定木荷（Schima superba）和白蘭（Michelia alba）的葉面積，結(jié)果表明采用不同方法測(cè)得的葉面積均無(wú)顯著差異；高建昌等［27］采用ImageJ軟件法與傳統(tǒng)剪紙法在測(cè)定番茄（Lycopersicon esculentum）葉面積時(shí)，測(cè)量結(jié)果差異不顯著，且采用ImageJ軟件法測(cè)定葉面積數(shù)值的穩(wěn)定性更高；李治中等［32］和劉小銳等［33］也得出上述類似結(jié)論.這些研究表明采用多種方法測(cè)定單一物種或較少物種的葉面積無(wú)顯著差異，但與此不同的是，本研究證實(shí)39個(gè)物種采用ImageJ軟件法計(jì)算得出的SLA較打孔稱重法普遍偏低，這與王家保等［34］采用不同方法測(cè)得小葉型果樹的葉面積存在顯著差異的結(jié)論具有一致性.

2種常用的SLA測(cè)定方法對(duì)不同物種測(cè)量結(jié)果存在顯著差異，而葉形則無(wú)顯著影響.剔除物種信息對(duì)SLA的影響后，即僅考慮測(cè)量方法的SLA的一元線性回歸分析，表明不同測(cè)量方法對(duì)校正后的SLA仍有顯著影響，這說明ImageJ軟件法測(cè)得的SLA確實(shí)要低于打孔稱重法.分析此結(jié)果產(chǎn)生的原因，可能包括：（1）打孔誤差.打孔稱重法易受葉片含水量、葉齡、葉形、葉脈、葉片質(zhì)地、葉片厚度以及葉片大小等因素的影響［20，35］.如以葉片質(zhì)地為例，杜仲（Eucommia ulmoides）的杜仲膠容易造成打孔邊緣不齊，導(dǎo)致打孔稱重法獲得的葉片實(shí)際面積與理論面積存在偏差.從葉形和葉脈的影響來看，植物葉形一般分為卵形、倒卵形、橢圓形和披針形等［36］，葉脈分為叉狀脈、網(wǎng)狀脈和平行脈等［37］，而葉形和葉脈往往會(huì)影響打孔的位置［38］，導(dǎo)致SLA測(cè)量不精確.如部分植物的葉脈密度大于葉肉密度，且越靠近葉脈的位置葉片越厚，密度也越大，導(dǎo)致打孔所得的小圓片密度小于平均葉密度［14］.（2）質(zhì)量誤差.打孔的葉片烘干后，存在葉屑掉落的現(xiàn)象，導(dǎo)致打孔稱重法出現(xiàn)更大的測(cè)量誤差.（3）方法局限性.以葉片局部的數(shù)據(jù)來反映整體的性質(zhì)，這導(dǎo)致打孔稱重法具有一定局限性.

3.2 測(cè)量方法的選擇

基于植物功能性狀預(yù)測(cè)未來氣候變化，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的影響是動(dòng)態(tài)全球植被模型中的重要內(nèi)容［39］，但是利用傳統(tǒng)方法測(cè)量SLA費(fèi)時(shí)費(fèi)力.隨著掃描儀的廣泛使用，基于圖像處理的葉面積測(cè)量越來越受到關(guān)注［40-42］.圖像處理法中的ImageJ軟件功能豐富，可廣泛應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)的研究中［43-45］.本研究表明，對(duì)特定的植物而言，ImageJ軟件法和打孔稱重法具有各自的測(cè)量?jī)?yōu)勢(shì)，有22個(gè)物種采用ImageJ軟件法計(jì)算的精確度更高，有8個(gè)物種采用打孔稱重法計(jì)算的精確度更高.ImageJ軟件法不但可以避免破壞植物組織，而且也可以用于計(jì)算有缺損葉片或形狀不規(guī)則葉片的葉面積［46］，消除了打孔誤差和質(zhì)量誤差.在傳統(tǒng)測(cè)量法的基礎(chǔ)上，ImageJ軟件法極大地?cái)U(kuò)大了應(yīng)用范圍、縮短了測(cè)量時(shí)間和提高了測(cè)量精度.因此，在樣本量大或重復(fù)數(shù)多的情況下，可優(yōu)先選用ImageJ軟件法計(jì)算SLA.

SLA主要由物種信息控制，并排除葉形對(duì)測(cè)量方法選擇的影響.本研究采用卵形、披針形和橢圓形這3種形狀劃分葉形，但由于同一物種的葉形存在表型可塑性，如甘肅桃（Amygdalus kansuensis）的葉片不僅存在披針形，也存在卵狀披針形這類過渡形態(tài)［47］，在野外采樣中，較難準(zhǔn)確判斷葉形歸屬以選擇合適的SLA測(cè)量方法.因此，在實(shí)際應(yīng)用中，僅靠葉形來選擇葉面積測(cè)量方法過于粗放，應(yīng)綜合考慮物種信息及其相應(yīng)的葉形.

4 結(jié)束語(yǔ)

本研究采用ImageJ軟件法和打孔稱重法測(cè)量了39個(gè)植物物種的SLA，從測(cè)量結(jié)果的差異性來看，有30個(gè)物種采用ImageJ軟件法測(cè)量得出的SLA顯著低于打孔稱重法.從測(cè)量結(jié)果的精確性來看，在SLA差異顯著的30個(gè)物種中，有22個(gè)物種采用ImageJ軟件法計(jì)算的精確度更高，其余8個(gè)物種采用打孔稱重法得到的更精確.綜合葉形與物種來看，2種測(cè)量方法對(duì)不同物種SLA的測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生顯著影響，但對(duì)不同葉形SLA測(cè)定結(jié)果的影響不顯著，可見主要由物種信息控制并排除以葉形作為SLA測(cè)定方法的判斷依據(jù).因此，在樣本量大或重復(fù)數(shù)多的情況下，可優(yōu)先選用ImageJ軟件法計(jì)算SLA，對(duì)未來野外采樣具有一定的指導(dǎo)意義.本研究著重探討葉形對(duì)SLA測(cè)量的影響，尚未針對(duì)葉脈、葉片質(zhì)地等性狀展開分析不同測(cè)量方法的差異性和精確性；同時(shí)實(shí)驗(yàn)物種的數(shù)量仍較少，以葉形為指標(biāo)進(jìn)行劃分得到的部分葉形的物種數(shù)量＜10個(gè)，重復(fù)度較低.因此，在下一步的研究中可加大物種的數(shù)量，并在植物其他葉片性狀與不同測(cè)量方法的適用性上進(jìn)行探究.

致謝：感謝首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張愛兵教授課題組、本科生趙佳月、溫婕、程可欣和王天漢等在實(shí)驗(yàn)開展過程中提供的幫助.