棗樹(shù)根際解磷菌P7的溶磷特性

魏喜喜，楊智鵬，馬路婷，張 梅b，c，3，祿彩麗b，c，3，宋 健，劉偉鋒，李建貴b，c

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) a.草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院；b.林業(yè)研究所；c.新疆紅棗工程控制中心，新疆 烏魯木齊 830052； 2.新疆佳木果樹(shù)學(xué)國(guó)家長(zhǎng)期科研基地，新疆 阿克蘇 843000；3.新疆大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830046）

磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不可或缺的重要礦質(zhì)元素，在植物呼吸、細(xì)胞分裂、能量轉(zhuǎn)化和生物合成等生理生化過(guò)程中起著重要作用[1]。植物吸收的磷素主要來(lái)源于土壤，然而大多數(shù)土壤有效磷含量較低，土壤中95%以上的磷為難溶形態(tài)[2]。 在30%～40%的耕地上，磷缺乏是土壤生產(chǎn)力低下的主要原因[3]。在土壤中，可用的磷酸鹽陰離子要么被黏土表面吸附[4]，要么與陽(yáng)離子形成不溶性絡(luò)合物，如堿性土壤中的磷酸鈣和磷酸鎂，酸性土壤中的磷酸鐵和磷酸鋁[5]，不可被植物直接吸收利用。為了滿(mǎn)足高產(chǎn)作物的磷需求，通常需要定期向農(nóng)田中施用不同外源肥料來(lái)進(jìn)行補(bǔ)充磷元素[6]。長(zhǎng)此以往，越來(lái)越多的難溶性磷酸鹽被固定在土壤中，農(nóng)田會(huì)受到不同程度的污染，出現(xiàn)肥力下降和土壤板結(jié)等問(wèn)題。根據(jù)Khan 等[7]的估計(jì)，如果耕地中的儲(chǔ)備磷具有生物可利用性，那么在將近100年的時(shí)間里不需要額外補(bǔ)充磷。

土壤中存在某些解磷微生物能夠活化土壤理化性質(zhì)[8]，能將水不溶性磷轉(zhuǎn)化成水可溶性磷[9]。鄧小軍等[10]從廣西不同紅壤區(qū)林木根際土壤中篩選分離得到6 株高效解磷菌株，這些菌株均有較強(qiáng)的溶磷能力。郭藝鵬等[11-13]通過(guò)對(duì)新疆棗樹(shù)根際土壤微生物進(jìn)行分離篩選及其解磷能力測(cè)定，發(fā)現(xiàn)P7 和P13 解磷能力最強(qiáng)，其中P7 適用于堿性環(huán)境，P13 適用于酸性環(huán)境。解磷微生物的主要溶磷機(jī)制是有機(jī)酸酸解作用、酶解作用和釋放H+等，且由于碳源、氮源和磷源的種類(lèi)不同，不同菌株表現(xiàn)出不同的溶磷特點(diǎn)[14-17]。微生物菌劑的施用對(duì)土壤中微生物數(shù)量有著不同程度的影 響[18-19]。植物根際微生物具有一定的生境選擇性和種屬專(zhuān)一性，根據(jù)地域氣候和生境的不同，研制適宜當(dāng)?shù)刂参锷L(zhǎng)的微生物菌肥是很有必要的，也符合我國(guó)“減肥減藥”的國(guó)家戰(zhàn)略。因此，研究解磷微生物在不同碳氮磷源環(huán)境下的解磷效果對(duì)利用解磷微生物有重要意義，也可為施用解磷微生物菌肥提供理論依據(jù)。

南疆紅棗園土壤中普遍缺磷，土壤中全磷含量在1 g/kg 左右，但是速效磷含量?jī)H為10 ～ 30 mg/kg[20-21]。本研究中以高效解磷菌株P(guān)7 為研究對(duì)象，在不同營(yíng)養(yǎng)因子（碳源、氮源、磷源、碳氮質(zhì)量比）條件下，觀察水溶性磷含量和pH 的動(dòng)態(tài)變化來(lái)確定其最適宜的營(yíng)養(yǎng)條件，在此基礎(chǔ)上測(cè)定發(fā)酵液中堿性磷酸酶活性，并對(duì)發(fā)酵液中有機(jī)酸進(jìn)行定性定量分析，探究高效解磷菌株P(guān)7在不同營(yíng)養(yǎng)因子條件下的解磷特性，旨在為研制適用于南疆紅棗園的專(zhuān)用微生物菌肥提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

以新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林業(yè)研究所從新疆棗園棗樹(shù)根際土壤中分離出的高效解磷菌株P(guān)7（Bacillus，KF719307.1）為研究對(duì)象。

1.2 供試培養(yǎng)基

解無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO40.3 g，F(xiàn)eSO40.03 g，MnSO41.0 g，Ca3(PO4)25.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0 ～7.2，用于微生物發(fā)酵。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0 ～7.2，（加瓊脂18.0 g 即為固體培養(yǎng)基），用作微生物擴(kuò)繁營(yíng)養(yǎng)液和種子液。上述培養(yǎng)基均在121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌20 min 后取出備用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 解磷菌株P(guān)7 種子液的制備

將實(shí)驗(yàn)室保存的解磷菌株P(guān)7 以劃線方式接種至牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，放置于恒溫培養(yǎng)箱中，在37 ℃環(huán)境下培養(yǎng)48 h。挑取單菌株接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，放置于恒溫?fù)u床上，設(shè)定溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為170 r/min，培養(yǎng)48 h。 在4 ℃、10 000 r/min 條件下，將發(fā)酵液離心10 min， 菌體沉淀經(jīng)無(wú)菌水洗滌2 次，再用無(wú)菌水重懸，在600 nm 波長(zhǎng)下調(diào)節(jié)吸光度為1，即種子液。

1.3.2 解磷菌株P(guān)7 溶磷能力的測(cè)定

在解無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將培養(yǎng)基的碳源、氮源和磷源進(jìn)行等量替換和按比例替換。碳源包括葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖、蔗糖、D-半乳糖、纖維素、甘露醇，氮源包括硫酸銨、硝酸鉀、尿素、碳酸銨，磷源包括磷酸鈣、磷酸鎂、磷酸鐵、磷酸鋁，碳氮（可溶性淀粉和硫酸銨）質(zhì)量比設(shè)置為5∶1、10∶1、15∶1、 20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1。在種子液接種量1 mL、初始pH 7.10、溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速170 r/min 條件下，每隔24 h，使用酸度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液pH，采用鉬藍(lán)比色法測(cè)定發(fā)酵液中水溶性磷含量。

1.3.3 解磷菌株P(guān)7 發(fā)酵液有機(jī)酸種類(lèi)及含量的 測(cè)定

使用高效液相色譜儀（島津CTO-15C）測(cè)定發(fā)酵 液中有機(jī)酸含量。檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；色譜柱為Shim-pack GIST C18-AQ 柱，4.6 mm×250 mm， 5 μm；流 動(dòng) 相 為0.1%磷酸溶液- 甲醇（體積比為97.5∶2.5），pH 2.6，波長(zhǎng)210 nm，流速 0.8 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。

將發(fā)酵液培養(yǎng)96 h 后，從各處理發(fā)酵液中抽取10 mL 至離心管中，超聲提取10 min 后放入離心機(jī)中，在4 ℃、10 000 r/min 條件下離心 10 min，取其上清液2 mL，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜至進(jìn)樣小瓶中，待測(cè)。

首先用單標(biāo)確定各種有機(jī)酸的出峰時(shí)間，然后分別稱(chēng)取有機(jī)酸標(biāo)品檸檬酸0.5 g、酒石酸0.25 g、蘋(píng)果酸0.5 g、丁二酸1.25 g、富馬酸2.5 mg、草酸 2.5 mg、馬來(lái)酸2.5 mg 至50 mL 小燒杯中，溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，定容至刻度，混勻，即得到5 000 mg/L 檸檬酸、2 500 mg/L 酒石酸、5 000 mg/L 蘋(píng)果酸、12 500 mg/L 丁二酸、25 mg/L 富馬酸、25 mg/L 草酸、25 mg/L 馬來(lái)酸的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃條件下保存。分別吸取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL 于25 mL容量瓶中，定容至刻度，混勻，于4 ℃條件下 保存[22]。

1.3.4 解磷菌株P(guān)7 發(fā)酵液堿性磷酸酶含量的測(cè)定

將發(fā)酵液培養(yǎng)96 h 后，在4 ℃、6 000 r/min條件下離心10 ～15 min，取0.2 ～1.0 mL 上清液于10 mL 離心管中。加4.00 mL MUB 緩沖液（pH 11）和1.00 mL 用相同緩沖液配制的對(duì)-硝基酚磷酸鈉溶液，蓋上蓋子混勻，在37 ℃條件下培養(yǎng)1 h。然后加1.00 mL 氯化鈣溶液和4.00 mL 氫氧化鈉溶液，充分混勻后過(guò)濾，在400 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。同時(shí)做空白對(duì)照，加對(duì)-硝基酚磷酸鈉溶液之前加入氯化鈣溶液和氫氧化鈉溶液，并迅速過(guò)濾。每樣品重復(fù)3 次。

取1 mL 對(duì)-硝基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 g/L）于100 mL 容量瓶中，用去離子水定容至刻度，再分別取該稀釋液0、1、2、3、4、5 mL 于10 mL 離心管中，加去離子水稀釋至5 mL，然后加1 mL 氯化鈣溶液和4 mL 氫氧化鈉溶液，充分混勻后過(guò)濾，在400 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

堿性磷酸酶活性以24 h 后釋出的酚量表示。酚量為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的酚量乘以換算成1 mL發(fā)酵液的系數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，使用R Studio 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行LSD 多重分析，使用SPSS 17.0 軟件對(duì)有機(jī)酸數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，使用Sigmaplot 12.5 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同磷源對(duì)解磷菌株P(guān)7 解磷效果的影響

2.1.1 不同磷源條件下發(fā)酵液中水溶性磷含量的動(dòng)態(tài)變化

不同磷源條件下發(fā)酵液中水溶性磷含量的動(dòng)態(tài)變化如圖1 所示。由圖1 可見(jiàn)，在發(fā)酵液的整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，各種難溶性磷酸鹽的溶解量均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但是不同難溶性磷酸鹽的溶解量存在差異。當(dāng)磷源為磷酸鎂時(shí)，發(fā)酵液中水溶性磷含量整體較低且無(wú)顯著變化；當(dāng)磷源為磷酸鐵時(shí)，整體變化呈先上升、后下降的趨勢(shì)，在培養(yǎng)48 ～72 h 階段，變化較顯著，且在培養(yǎng)96 h 時(shí)發(fā)酵液中水溶性磷含量降至最低；當(dāng)磷源為磷酸鋁時(shí)，發(fā)酵液中水溶性磷含量先降低、后升高，在培養(yǎng)72 h 時(shí)降至最低，總體含量較低；當(dāng)磷源為磷酸鈣時(shí)，發(fā)酵液中水溶性磷含量整體處于增長(zhǎng)趨勢(shì)，且在各培養(yǎng)時(shí)段含量均為最高，在培養(yǎng)96 h 前增加速度較為緩慢，在培養(yǎng)96 ～120 h 時(shí)急劇增加，并在培養(yǎng)120 h 時(shí)達(dá)到362.4 mg/L。因此，可知解磷菌株P(guān)7 對(duì)磷酸鈣的溶解效果最好，后續(xù)試驗(yàn)均采用磷酸鈣為唯一磷源。

圖1 不同磷源條件下解磷菌株P(guān)7 發(fā)酵液中水溶性磷含量 的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of water-soluble phosphorus content of phosphorus-solubilizing bacteria P7 in fermentation liquid under different phosphorus sources

2.1.2 不同磷源條件下發(fā)酵液pH 的動(dòng)態(tài)變化

不同磷源條件下發(fā)酵液pH 的動(dòng)態(tài)變化如圖2所示。

圖2 不同磷源條件下解磷菌株P(guān)7 發(fā)酵液pH 的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of pH of fermentation liquid of phosphorus-solubilizing bacteria P7 under different phosphorus sources

由圖2 可見(jiàn)，在發(fā)酵液的培養(yǎng)過(guò)程中，各處理發(fā)酵液的pH 波動(dòng)較大。當(dāng)以磷酸鈣為唯一磷源時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)的加長(zhǎng)，發(fā)酵液的pH 持續(xù)降低，由初始的7.20 降至5.11，在培養(yǎng)96 h 時(shí)降至最低值4.82；當(dāng)以磷酸鎂為唯一磷源時(shí)，發(fā)酵液的pH 呈現(xiàn)先降低、后升高、再降低的趨勢(shì)，變化波動(dòng)較大，在培養(yǎng)24 h 內(nèi)波動(dòng)幅度最大，從初始值7.20 降低至4.26，降低幅度高達(dá)40.83%；當(dāng)以磷酸鐵為唯一磷源時(shí)，發(fā)酵液的pH 呈現(xiàn)先降低、后上升的趨勢(shì)，從初始值7.20 持續(xù)降低至培養(yǎng) 48 h 時(shí)的4.21，之后發(fā)酵液的pH 緩慢回升；當(dāng)以磷酸鋁為唯一磷源時(shí)，發(fā)酵液的pH 呈現(xiàn)先降低、后上升的趨勢(shì)，從初始值7.20 持續(xù)降低至培養(yǎng) 72 h 時(shí)的4.96。

2.2 不同碳源對(duì)解磷菌株P(guān)7 溶解磷酸鈣的影響

2.2.1 不同碳源條件下發(fā)酵液中水溶性磷含量的動(dòng)態(tài)變化

不同碳源條件下發(fā)酵液中水溶性磷含量的動(dòng)態(tài)變化如圖3 所示。

圖3 不同碳源條件下解磷菌株P(guān)7 發(fā)酵液中水溶性磷含量 的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of water-soluble phosphorus content of phosphorus-solubilizing bacteria P7 in fermentation liquid under different carbon sources

由圖3 可見(jiàn)，在發(fā)酵液的整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，水溶性磷含量呈現(xiàn)先升高、后下降的趨勢(shì)，整體變化顯著。在分別以乳糖、麥芽糖和蔗糖為唯一碳源的情況下，均為培養(yǎng)72 h 時(shí)出現(xiàn)峰值，之后呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。在以麥芽糖和蔗糖為唯一碳源的情況下，發(fā)酵液中水溶性磷含量相對(duì)較低；在以乳糖為唯一碳源的情況下，在培養(yǎng)72 h 時(shí)，發(fā)酵液中水溶性磷含量達(dá)到342.1 mg/L，相對(duì)較高。在分別以葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、D-半乳糖和甘露醇為唯一碳源的情況下，發(fā)酵液中水溶性磷含量均呈持續(xù)上升趨勢(shì)，且在培養(yǎng)96 h 時(shí)，增至最高，之后出現(xiàn)降低趨勢(shì)，特別是在以可溶性淀粉為唯一碳源的情況下，水溶性磷含量增長(zhǎng)幅度最大，在培養(yǎng)24 ～48 h 時(shí)，增長(zhǎng)幅度達(dá)到239.73%，在培養(yǎng)96 h 時(shí)，水溶性磷含量最高，達(dá)到388.5 mg/L。因此，可知在以可溶性淀粉作為唯一碳源時(shí)，解磷菌株P(guān)7 的溶磷效果最好。

2.2.2 不同碳源條件下發(fā)酵液pH 的動(dòng)態(tài)變化

不同碳源條件下發(fā)酵液pH 的動(dòng)態(tài)變化如圖4所示。由圖4 可見(jiàn)，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，各處理發(fā)酵液的pH 波動(dòng)較大，差異顯著。當(dāng)以葡萄糖為唯一碳源時(shí)，發(fā)酵液的pH 整體呈現(xiàn)先下降、后上升、再下降的趨勢(shì)，在培養(yǎng)0 ～24 h 時(shí)，從初始值7.20 降至6.03，在培養(yǎng)120 h 時(shí)降至最低值5.07；當(dāng)以果糖為唯一碳源時(shí)，發(fā)酵液的pH 呈現(xiàn)緩慢降低的趨勢(shì)；當(dāng)以可溶性淀粉為唯一碳源時(shí)，發(fā)酵液的pH 呈現(xiàn)先持續(xù)下降、后較為穩(wěn)定的狀態(tài)，穩(wěn)定在5.33 ～5.34；當(dāng)以乳糖為唯一碳源時(shí)，發(fā)酵液的pH 呈現(xiàn)波動(dòng)下降的趨勢(shì)，在培養(yǎng)120 h 時(shí)降至5.26；當(dāng)以麥芽糖為唯一碳源時(shí)，發(fā)酵液的pH整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但變化不顯著；當(dāng)以蔗糖為唯一碳源時(shí)，發(fā)酵液的pH 整體較穩(wěn)定，差異不顯著；當(dāng)以D-半乳糖為唯一碳源時(shí)，發(fā)酵液的pH整體呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)，從初始值7.20 降至培養(yǎng)120 h 時(shí)的4.62，降低幅度達(dá)35.83%；當(dāng)以甘露醇為唯一碳源時(shí)，發(fā)酵液的pH 在培養(yǎng)24 h 內(nèi)降低至5.81，然后基本保持穩(wěn)定，有輕微上升。

圖4 不同碳源條件下解磷菌株P(guān)7 發(fā)酵液pH 的動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of pH of fermentation liquid of phosphorus-solubilizing bacteria P7 under different carbon sources

2.3 不同氮源對(duì)解磷菌株P(guān)7 溶解磷酸鈣的影響

2.3.1 不同氮源條件下發(fā)酵液中水溶性磷含量的動(dòng)態(tài)變化

不同氮源條件下發(fā)酵液中水溶性磷含量的動(dòng)態(tài)變化如圖5 所示。由圖5 可見(jiàn)，在不同氮源環(huán)境下，發(fā)酵液中可溶性磷含量整體呈現(xiàn)先上升、后下降的趨勢(shì)。在分別以碳酸銨、硫酸銨和硝酸鉀為唯一氮源時(shí)，發(fā)酵液中水溶性磷含量均呈現(xiàn)先升高、后降低的趨勢(shì)，在培養(yǎng)96 h 時(shí)，水溶性磷含量均達(dá)到最高，其中以硫酸銨為唯一氮源時(shí)，溶磷效果最佳，水溶性磷含量達(dá)到442.5 mg/L。以尿素為唯一氮源時(shí)，發(fā)酵液中水溶性磷含量無(wú)顯著變化。在以硫酸銨為唯一氮源條件下，在培養(yǎng)48 ～72 h 時(shí)間段，發(fā)酵液中水溶性磷含量增加幅度最為顯著，增加了42.68 倍。因此，以硫酸銨為唯一氮源時(shí)，解磷菌株P(guān)7 的溶磷效果最好。

圖5 不同氮源條件下解磷菌株P(guān)7 發(fā)酵液中水溶性磷含量 的動(dòng)態(tài)變化Fig.5 Dynamic changes of water-soluble phosphorus content of phosphorus-solubilizing bacteria P7 in fermentation liquid under different nitrogen sources

2.3.2 不同氮源條件下發(fā)酵液pH 的動(dòng)態(tài)變化

不同氮源條件下發(fā)酵液pH 的動(dòng)態(tài)變化如圖6所示。

圖6 不同氮源條件下解磷菌株P(guān)7 發(fā)酵液pH 的動(dòng)態(tài)變化Fig.6 Dynamic changes of pH of fermentation liquid of phosphorus-solubilizing bacteria P7 under different nitrogen sources

由圖6 可見(jiàn)，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，各處理發(fā)酵液的pH 有較大波動(dòng)，差異顯著。當(dāng)分別以尿素、碳酸銨、硫酸銨、硝酸鉀為唯一氮源時(shí)，發(fā)酵液的pH 均呈現(xiàn)先下降、后升高的趨勢(shì)。其中，以尿素為唯一氮源時(shí)整體差異不顯著；分別以碳酸銨、硫酸銨、硝酸鉀為唯一氮源的情況下，均為培養(yǎng)96 h 時(shí)發(fā)酵液的pH 降至最低，其中以硫酸銨為唯一碳源時(shí)，在培養(yǎng)96 h 時(shí)降至最低值4.60。

2.4 不同碳氮比對(duì)解磷菌株P(guān)7 溶解磷酸鈣的影響

2.4.1 不同碳氮比條件下發(fā)酵液中水溶性磷含量的動(dòng)態(tài)變化

不同碳氮比條件下發(fā)酵液中水溶性磷含量的動(dòng)態(tài)變化如圖7所示。由圖7可見(jiàn)，在碳氮比為5∶1、 10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、 40∶1 條件下，發(fā)酵液中水溶性磷含量均呈現(xiàn)先增加、后減少的趨勢(shì)，且變化較顯著，整體上，在培養(yǎng)24 ～48 h 時(shí)間段，各處理水溶性磷含量增加幅度最為顯著。各處理均為培養(yǎng)96 h 時(shí)發(fā)酵液中水溶性磷含量達(dá)到最大值，且在碳氮比為35∶1 時(shí)，發(fā)酵液中水溶性磷含量達(dá)到最高值446.9 mg/L。因此，當(dāng)發(fā)酵液中碳氮比為35∶1 時(shí)，解磷菌株P(guān)7的解磷效果最好。

圖7 不同碳氮比條件下解磷菌株P(guān)7 發(fā)酵液中水溶性磷 含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.7 Dynamic changes of water-soluble phosphorus content in fermentation liquid of phosphorus-solubilizing bacteria P7 under different ratios of C mass to N mass

2.4.2 不同碳氮比條件下發(fā)酵液pH 的動(dòng)態(tài)變化

不同碳氮比條件下發(fā)酵液pH 的動(dòng)態(tài)變化如圖8 所示。由圖8 可見(jiàn)，在碳氮比為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 條件下，發(fā)酵液的pH 變化趨勢(shì)較為一致，均隨著培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)的延長(zhǎng)，先降低、后升高，在培養(yǎng)96 h 時(shí)發(fā)酵液的pH 降至最低。從不同碳氮比條件來(lái)看，隨著碳氮比的增大，發(fā)酵液的pH 呈現(xiàn)先降低、后升高的趨勢(shì)，在碳氮比為35∶1、培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)為96 h 時(shí)，發(fā)酵液的pH 最低，為4.60。

圖8 不同碳氮比條件下解磷菌株P(guān)7 發(fā)酵液pH 的動(dòng)態(tài)變化Fig.8 Dynamic changes of pH of fermentation liquid of phosphorus-solubilizing bacteria P7 under different ratios of C mass to N mass

2.5 不同營(yíng)養(yǎng)因子條件下解磷菌株P(guān)7 發(fā)酵液有機(jī)酸的含量及因子分析

2.5.1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)液的液相分析結(jié)果

對(duì)7種有機(jī)酸進(jìn)行分離，得到較好的分離效果，7 種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)譜圖如圖9 所示。

圖9 7 種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.9 Chromatograms of seven organic acid standard solutions

7 種有機(jī)酸的保留時(shí)間、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的測(cè)定和計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。由表1 可知，采用高效液相色譜法，在15 min 內(nèi)即可完成發(fā)酵液中草酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、馬來(lái)酸、檸檬酸、丁二酸和富馬酸的測(cè)定。

表1 7 種有機(jī)酸的保留時(shí)間、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差Table 1 Retention time, regression equation, correlation coefficient, linear range and relative standard deviation of seven organic acids

2.5.2 解磷菌株P(guān)7 發(fā)酵液中7 種有機(jī)酸的含量

不同營(yíng)養(yǎng)因子條件下發(fā)酵液中7 種有機(jī)酸的含量見(jiàn)表2。由表2 可知，在不同的營(yíng)養(yǎng)因子條件下，發(fā)酵液中各種有機(jī)酸含量不同，且差異顯著。當(dāng)以葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、麥芽糖或D-半乳糖為唯一碳源時(shí)，發(fā)酵液中蘋(píng)果酸的含量最高；當(dāng)以乳糖、蔗糖或甘露醇為唯一碳源時(shí)，發(fā)酵液中丁二酸含量最高。當(dāng)以硫酸銨或碳酸銨為唯一氮源時(shí)，發(fā)酵液中蘋(píng)果酸含量最高，其中，當(dāng)唯一氮源為碳酸銨時(shí)，蘋(píng)果酸、丁二酸和富馬酸含量均最高，分別達(dá)到3 434.88、783.43、4.03 mg/L； 當(dāng)以硝酸鉀為唯一氮源時(shí)，發(fā)酵液中草酸含量最高，達(dá)到1 379.93 mg/L；當(dāng)以尿素為唯一氮源時(shí)，發(fā)酵液中酒石酸和檸檬酸含量均最高，分別達(dá)到60.79、64.62 mg/L。當(dāng)以磷酸鈣、磷酸鎂或磷酸鋁為唯一磷源時(shí)，發(fā)酵液中蘋(píng)果酸含量最高；當(dāng)以磷酸鐵為唯一磷源時(shí)，發(fā)酵液中丁二酸含量最高。當(dāng)碳氮比為35∶1 時(shí)，發(fā)酵液中丁二酸和馬來(lái)酸含量均最高。

表2 不同營(yíng)養(yǎng)因子條件下解磷菌株P(guān)7 發(fā)酵液中7 種有機(jī)酸的含量?Table 2 Contents of seven organic acids in phosphorus-solubilizing bacteria P7 fermentation broth under different nutritional factors mg/L

續(xù)表2Continuation of table 2

2.5.3 解磷菌株P(guān)7 發(fā)酵液中7 種有機(jī)酸含量的因子分析

不同營(yíng)養(yǎng)因子條件下發(fā)酵液中7 種有機(jī)酸含量經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化后得到3 個(gè)主成分因子，特征值均大于1。前3 個(gè)主成分因子的特征值、貢獻(xiàn)率及累計(jì)貢獻(xiàn)率見(jiàn)表3。由表3 可知，第1 主成分的方差貢獻(xiàn)率為60.701%，第2 主成分的方差貢獻(xiàn)率為27.438%，第3 主成分的方差貢獻(xiàn)率為7.129%，第1 主成分、第2 主成分和第3 主成分的累積貢獻(xiàn)率為95.268%。

表3 不同營(yíng)養(yǎng)因子條件下解磷菌株P(guān)7 發(fā)酵液中7 種有機(jī)酸含量的主成分分析結(jié)果Table 3 The results of principal component analysis of contents of seven organic acids in phosphorus-solubilizing bacteria P7 fermentation broth under different nutritional factors

主成分載荷矩陣見(jiàn)表4。由表4 可知，第1 主成分主要由可溶性淀粉、麥芽糖和磷酸鎂3 個(gè)因子組成，載荷分別為0.993、0.980 和0.960；第2主成分主要由碳氮比35∶1、乳糖和磷酸鐵3 個(gè)因子組成，載荷分別為0.885、0.830 和0.765；第3主成分主要由硝酸鉀、乳糖和甘露醇3個(gè)因子組成，載荷分別為0.804、0.341 和0.319。

表4 不同營(yíng)養(yǎng)因子條件下解磷菌株P(guān)7 發(fā)酵液中7 種有機(jī)酸含量的主成分載荷矩陣Table 4 Rotated matrix of principal components of contents of seven organic acids in phosphorus-solubilizing bacteria P7 fermentation broth under different nutritional factors

不同營(yíng)養(yǎng)因子條件下解磷菌株P(guān)7 發(fā)酵液中7種有機(jī)酸含量的綜合評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表5，根據(jù)不同處理下各有機(jī)酸含量的綜合貢獻(xiàn)度進(jìn)行排序。由表5可知：根據(jù)第1 主成分得分排序，蘋(píng)果酸的貢獻(xiàn)度排第1 位，主要表現(xiàn)在可溶性淀粉、麥芽糖和磷酸鎂3 個(gè)處理中發(fā)酵液蘋(píng)果酸的含量較高，其他有機(jī)酸排名由前到后依次為丁二酸、富馬酸、馬來(lái)酸、草酸、酒石酸、檸檬酸；根據(jù)第2 主成分得分排序，丁二酸的貢獻(xiàn)度排第1 位，主要表現(xiàn)在碳氮比35∶1、乳糖和磷酸鐵3 個(gè)處理中發(fā)酵液丁二酸的含量較高，其他有機(jī)酸排名由前到后依次為檸檬酸、草酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、馬來(lái)酸、富馬酸；根據(jù)第3 主成分得分排序，酒石酸的貢獻(xiàn)度排第1 位，主要表現(xiàn)在硝酸鉀、乳糖和甘露醇3 個(gè)處理中發(fā)酵液酒石酸的含量較高，其他有機(jī)酸排名由前到后依次為檸檬酸、蘋(píng)果酸、丁二酸、馬來(lái)酸、富馬酸、草酸；綜合得分顯示，蘋(píng)果酸的貢獻(xiàn)度最高，丁二酸次之，其余有機(jī)酸排名由前到后依次為檸檬酸、酒石酸、草酸、馬來(lái)酸、富馬酸。

表5 不同營(yíng)養(yǎng)因子條件下解磷菌株P(guān)7 發(fā)酵液中7 種有機(jī)酸含量的綜合評(píng)價(jià)結(jié)果Table 5 Comprehensive evaluation results of different organic acids in phosphorus-solubilizing bacteria P7 fermentation broth under different nutritional factors

2.6 不同營(yíng)養(yǎng)因子條件下解磷菌株P(guān)7 發(fā)酵液中堿性磷酸酶的活性

不同營(yíng)養(yǎng)因子條件下解磷菌株P(guān)7 發(fā)酵液中堿性磷酸酶的活性如圖10 所示。由圖10 可見(jiàn)，當(dāng)發(fā)酵液中D-半乳糖為唯一碳源時(shí)，堿性磷酸酶活性最高，為26.8 mg/kg；當(dāng)硝酸鉀為唯一氮源時(shí)，發(fā)酵液中堿性磷酸酶活性最高，為27.8 mg/kg；當(dāng)磷酸鎂為唯一磷源時(shí)，發(fā)酵液中堿性磷酸酶活性最高，為28.7 mg/kg；當(dāng)碳氮比為35∶1 時(shí)，發(fā)酵液中堿性磷酸酶活性最高，為28.7 mg/kg。

圖10 不同營(yíng)養(yǎng)因子條件下解磷菌株P(guān)7 發(fā)酵液中堿性磷酸酶的活性Fig.10 Difference of phosphatase activity in phosphorus-solubilizing bacteria P7 fermentation broth under different nutrient factors

3 結(jié)論與討論

棗樹(shù)根際解磷菌株P(guān)7 的溶磷特性研究結(jié)果表明，不同營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)解磷菌株P(guān)7 的溶磷效果存在不同程度的影響。在碳源為可溶性淀粉、氮源為硫酸銨、磷源為磷酸鈣、碳氮比35∶1 的營(yíng)養(yǎng)條件下，解磷菌株P(guān)7 的溶磷效果均較好；發(fā)酵液中水溶性磷含量與pH 呈顯著負(fù)相關(guān)，pH 的變化與有機(jī)酸分泌密切相關(guān)；解磷菌株P(guān)7 在不同營(yíng)養(yǎng)因子環(huán)境下主要分泌蘋(píng)果酸和丁二酸；堿性磷酸酶活性與解磷菌株P(guān)7 溶解磷酸鈣無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系。

研究結(jié)果表明，不同的營(yíng)養(yǎng)條件下解磷菌株P(guān)7 的溶磷效果存在顯著差異。磷酸鈣、磷酸鎂、磷酸鋁和磷酸鐵4 種磷源中，以磷酸鈣為唯一磷源時(shí)，發(fā)酵液中水溶性磷含量顯著增高，解磷菌株P(guān)7 的溶磷活性最強(qiáng)，其次分別為以磷酸鐵、磷酸鋁和磷酸鎂為唯一磷源。鈣磷酸鹽在有機(jī)酸和質(zhì)子的雙重作用下有較強(qiáng)的溶解作用[23]。鐵磷酸鹽和鋁磷酸鹽僅受有機(jī)酸絡(luò)合作用的影響，加上鋁離子和鐵離子在酸性溶液中黏度較大，對(duì)水分流動(dòng)和養(yǎng)分交換產(chǎn)生一定的影響，磷酸鎂易溶于無(wú)機(jī)酸。此外，解磷微生物的溶磷能力與磷源自身的供磷特點(diǎn)也有關(guān)。在生長(zhǎng)過(guò)程中，微生物通過(guò)自身產(chǎn)生的次生代謝物對(duì)難溶性磷進(jìn)行溶解，自身也會(huì)固持一部分微生物量磷，供自身使用。通常在外界缺磷的情況下，解磷微生物才會(huì)增加自身次生代謝物的分泌，從而產(chǎn)生解磷作用。

以可溶性淀粉為碳源時(shí)，發(fā)酵液中水溶性磷含量較高；以D-半乳糖和果糖為碳源時(shí)，兩者的菌體生長(zhǎng)量相當(dāng)，但是溶磷量相差較多。已有研究結(jié)果表明，節(jié)桿菌1TCRi7 菌株在以葡萄糖為唯一碳源時(shí)，溶磷能力較強(qiáng)，分別以蔗糖、淀粉和糖蜜為唯一碳源時(shí)，解磷菌株的生長(zhǎng)狀況均比以葡萄糖為唯一碳源時(shí)的生長(zhǎng)情況好，但是未發(fā)現(xiàn)其有溶磷能力[14]。表明解磷菌株的生長(zhǎng)狀況與解磷菌株的溶磷能力并非始終呈正相關(guān)關(guān)系。劉曉芳等[15]在研究不同碳源對(duì)曲霉溶磷效果的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在碳源是糖蜜時(shí)，溶磷效果最好。

以硫酸銨為唯一氮源時(shí)，發(fā)酵液中水溶性磷含量較高；以尿素為唯一氮源時(shí)，發(fā)酵液幾乎無(wú)解磷活性，說(shuō)明酰胺態(tài)的氮源對(duì)解磷菌株P(guān)7 的解磷能力無(wú)顯著影響。已有研究結(jié)果表明，解磷微生物所需氮源主要為銨態(tài)氮和硝態(tài)氮。Asea 等[16]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以NH4+-N 為唯一氮源時(shí)，培養(yǎng)介質(zhì)pH 顯著降低，溶磷菌的溶磷量顯著增加，這與虞偉斌等[17]、Wenzel 等[24]的研究結(jié)果一致。但Reyes 等[25]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，青霉菌IR94-MF 1 以硝態(tài)氮為氮源的解磷效果顯著好于以銨態(tài)氮為氮源。Relwani 等[26]和趙小蓉等[14]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，曲霉在氮源為硝酸根的條件下表現(xiàn)出較好的解磷能力。

在較高的碳氮比條件下，解磷菌株P(guān)7 的溶磷能力較好，但趙小蓉等[14]在對(duì)2 株青霉的研究中發(fā)現(xiàn)，碳氮比越小，溶磷能力越強(qiáng)，說(shuō)明不同菌株有不同的適宜碳氮比，所以判斷解磷菌解磷能力時(shí)應(yīng)考慮培養(yǎng)基中碳氮比是否合適。

不同營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)解磷菌株P(guān)7 分泌有機(jī)酸的影響是較為顯著的。解磷菌株P(guān)7 主要分泌蘋(píng)果酸和丁二酸，其次是檸檬酸、酒石酸、草酸、馬來(lái)酸和富馬酸，且分別以葡萄糖、可溶性淀粉、果糖、麥芽糖、D-半乳糖為唯一碳源時(shí)，主要分泌蘋(píng)果酸，分別以乳糖、蔗糖、麥芽糖為唯一碳源時(shí)，主要分泌丁二酸。研究結(jié)果表明，在發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)條件不同的情況下，解磷菌株分泌有機(jī)酸的種類(lèi)和含量均會(huì)發(fā)生不同程度的變化。已有研究結(jié)果表明，以蔗糖和果糖為唯一碳源時(shí)，檸檬酸桿菌以分泌乙酸為主，當(dāng)唯一碳源轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟呛望溠刻菚r(shí)，檸檬酸桿菌以分泌葡萄糖酸為主[27]。以葡萄糖為碳源、以NH4+-N 為氮源、碳氮比為8∶1 時(shí)，假單胞菌株主要分泌蘋(píng)果酸[17]，這與Marra 等[28]的研究結(jié)果相同，而劉輝等[29]的研究結(jié)果顯示熒光假單胞菌株主要分泌草酸。

以D-半乳糖為唯一碳源、以硝酸鉀為唯一氮源、以磷酸鎂為唯一磷源時(shí)，發(fā)酵液中堿性磷酸酶活性均較高，而以可溶性淀粉為唯一碳源、以硫酸銨為唯一氮源、以磷酸鈣為唯一磷源時(shí)，發(fā)酵液中水溶性磷含量均較高，與堿性磷酸酶活性呈現(xiàn)的結(jié)果相反。這說(shuō)明在磷酸鈣的溶解過(guò)程中堿性磷酸酶無(wú)顯著作用。已有研究結(jié)果表明，堿性磷酸酶主要在有機(jī)磷的降解過(guò)程中起到較大的作用[30]。

本研究中對(duì)不同碳氮磷源條件下解磷菌株P(guān)7的溶磷效果及發(fā)酵液中有機(jī)酸含量和堿性磷酸酶活性進(jìn)行了研究，但是解磷菌株的生長(zhǎng)不僅受到營(yíng)養(yǎng)因子的影響，還受到溫度、初始pH、環(huán)境脅迫等因素的影響。為研制適用于南疆紅棗園的專(zhuān)用微生物菌肥，下一步將通過(guò)大田試驗(yàn)來(lái)研究解磷菌株P(guān)7 對(duì)南疆棗園棗樹(shù)根際土壤養(yǎng)分以及棗果實(shí)品質(zhì)的影響。