油茶花芽分化后期內(nèi)源激素與代謝組學(xué)差異分析

黃潤生，張 暉，廖柏勇，王龍遠(yuǎn)，代文魁，薛彬娥，王 溢，李永泉

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 園藝園林學(xué)院，廣東 廣州 510225）

油茶Camellia oleifera，山茶科Theaceae 山茶屬Camellia，為我國特有的木本油料樹種，是世界四大木本食用油料物種之一。油茶籽油含有豐富的營養(yǎng)成分，富含不飽和脂肪酸，長期食用有益于人體健康[1]。茶油具有降血壓、血脂、膽固醇等保健功能[2-3]，對高血壓、心腦血管疾病、肥胖癥等有明顯的治療效果，因其具有重要的保健功能，被譽(yù)為“東方橄欖油”。隨著人們生活水平的提高，對優(yōu)質(zhì)食用油的需求越來越多，但低產(chǎn)量極大影響了油茶產(chǎn)業(yè)的高效發(fā)展。

油茶產(chǎn)量低的主要原因是花多果少、落花落果嚴(yán)重、坐果率低。油茶花期在10月下旬—12月初，其中花芽分化大多在6—7月，少數(shù)花芽于9—10月分化，晚分化的花芽發(fā)育不健全，易落芽落花[4]?；ㄑ糠只怯筒枭L發(fā)育的重要過程，普通油茶花芽分化分為6 個(gè)時(shí)期：前分化期、萼片形成期、花瓣形成期、雌雄蕊形成期、子房和花藥形成期及雌雄蕊成熟期[5]。目前，較多研究報(bào)道中從生理和轉(zhuǎn)錄水平探討了油茶生長發(fā)育調(diào)控機(jī)制。代謝物及其內(nèi)源激素成分和含量的變化則與花芽分化時(shí)期、落花落果等有較大的關(guān)系。在高州油茶花芽不同分化時(shí)期，花芽中不同元素的含量變化趨勢不同[6]。內(nèi)源激素吲哚-3-乙酸（indoleacietic acid，IAA）、玉米素核苷（ribosylzeatin，ZR）、脫落酸（abscisic acid，ABA）和赤霉素（gibberellic，GA）含量的變化與營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變有關(guān)[7]?！t羽1 號(hào)’油茶果實(shí)成熟過程中，其葉片、果皮、果殼和種仁間總酚、黃酮及還原糖含量有較大差異，各時(shí)期間差異極顯著[8]。油茶春梢的成花過程與熱激蛋白基因HSP[9]有關(guān)；FT基因是油茶成花的關(guān)鍵基因，其編碼的“成花素”積累到一定量后樹體才會(huì)由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向生殖生長[10]。卿卓等[11]利用Illumina Hiseq 測序技術(shù)對油茶花蕾期蜜腺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)在2 147 個(gè)差異表達(dá)基因中有941 個(gè)差異表達(dá)基因富集于糖代謝、氨基酸代謝等代謝途徑中；江南等[12]利用RNA-seq 技術(shù)對處于果實(shí)膨大期的油茶種子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序并構(gòu)建其表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)LOX、AOS、ACOX等多種關(guān)鍵基因與α-亞麻酸合成代謝途徑有關(guān)。在油茶果實(shí)發(fā)育過程中，其總糖含量與含油率呈顯著負(fù)相關(guān)[13]。另外，油茶為花果同期植物，供給花、果（庫）光合產(chǎn)物的主要器官是葉片（源）[14]， 而樹形、枝條覆蓋等因素引起的高遮光率不僅對苗期生長造成影響，還對庫的生長有影響，但適當(dāng)遮光處理能顯著促進(jìn)油茶苗木生長[15]。然而，對于油茶花芽發(fā)育的分子機(jī)制尚未明晰。

林木代謝組學(xué)是代謝組學(xué)的重要分支，主要研究的是林木中各種代謝路徑的底物和產(chǎn)物（相對分子質(zhì)量小于1 000 Da）。我國油茶種類繁多，油茶花芽中的代謝產(chǎn)物可以全面反映花芽的生長狀態(tài)，且代謝物的種類和含量直接調(diào)控花芽的分化和發(fā)育[16]。長期以來油茶種植過程中一直存在花多果少、坐果率低、產(chǎn)量低的問題，這些問題成為長期制約我國油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸[17]?；ㄑ糠只瘜χ参镩_花、結(jié)果均有直接影響，花芽發(fā)育不良是導(dǎo)致油茶低產(chǎn)的重要原因之一。本試驗(yàn)中，采用LC-MS 和GC-MS 方法分別對不同時(shí)期的油茶花芽的內(nèi)源激素和代謝物進(jìn)行比較，分析油茶花芽不同發(fā)育階段的激素變化趨勢和代謝物差異，探究關(guān)鍵內(nèi)源激素和代謝物對油茶花芽分化和發(fā)育的調(diào)控作用，解析油茶花芽分化的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

分別于2019年11月下旬、12月上旬和12月中旬，在廣東省東源縣大地農(nóng)林發(fā)展有限公司油茶基地采集雌雄蕊形成期、子房和花藥形成期、雌雄蕊成熟期的普通油茶花芽作為試驗(yàn)材料（圖1），3 個(gè)時(shí)期分別標(biāo)記為PT Ⅰ、PT Ⅱ和PT Ⅲ。每個(gè)分化時(shí)期設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，一共9 個(gè)樣品。經(jīng)液氮速凍后，置于-80 ℃的超低溫冰箱中進(jìn)行冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 所選取3 個(gè)時(shí)期的普通油茶花芽Fig.1 Flower buds of C.oleifera selected at three stages

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)源激素的測定和分析

取出超低溫條件下保存的3 個(gè)分化時(shí)期的油茶花芽樣品各3 個(gè)重復(fù)，用研磨儀（MM 400，Retsch）研磨（30 Hz，1 min）至粉末狀，稱取50 mg 研磨后的樣品，加入適量內(nèi)標(biāo)，用1 mL 甲醇、水、甲酸混合液（體積比15∶4∶1）進(jìn)行提??；濃縮提取液后，再用100 μL 80%的甲醇水溶液復(fù)溶，過0.22 μm 濾膜，置于進(jìn)樣瓶中，用于LC-MS 分析。

液相條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 柱（1.8 μm，100 mm×2.1 mm）；流動(dòng)相A 相為超純水（加入0.04%的乙酸），B 相為乙腈（加入0.04%的乙酸）；梯度洗脫程序?yàn)锳 和B 體積比95∶5 的流動(dòng)相1.0 min，A 和B 體積比5∶95 的流動(dòng)相8.0 min，A 和B 體積比5∶95的流動(dòng)相9.0 min，A 和B 體積比95∶5 的流動(dòng)相 9.1 min，A 和B 體積比95∶5 的流動(dòng)相12.0 min；流速0.35 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（electrospray ionization， ESI）溫度550 ℃，正離子模式下質(zhì)譜電壓5 500 V，負(fù)離子模式下質(zhì)譜電壓-4 500 V，氣簾氣（curtain gas，CUR）241 325 Pa。在Q-Trap 6500+ 中，根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓（declustering potential，DP）和碰撞能（collision energy，CE）掃描檢測每個(gè)離子對。

1.2.2 代謝組的測定和分析

3 個(gè)生長階段的油茶花芽樣品均平行取3 個(gè)重復(fù)，分別準(zhǔn)確稱取10 g 樣品，放置于Scientz-100F凍干機(jī)中真空冷凍干燥，轉(zhuǎn)入研磨儀（MM 400，Retsch）中，在30 Hz 下研磨15 min 至粉末狀，稱取100 mg 粉末溶于0.6 mL 70%的甲醇提取液中，并將溶解后的溶液置于4 ℃冰箱中過夜，其間渦旋混勻6 次，以提高提取率。10 000g離心10 min，吸取上清液，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，將濾液保存于進(jìn)樣瓶中，用于氣相色譜-質(zhì)譜分析（GC-MS）。

MS 條件：使用電噴霧離子源，樣品質(zhì)譜信號(hào)采集分別采用正、負(fù)離子掃描模式[18]，條件見表1。

表1 油茶花芽組分的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for component analysis of C.oleifera flower buds

1.2.3 差異代謝物的篩選及生物信息學(xué)分析

將經(jīng)GC-MS 分析后的代謝物數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，基于標(biāo)準(zhǔn)品（用甲醇分別配置0.3 g/L L-2-氯苯丙氨酸和0.01 g/L 十七烷烴）的標(biāo)準(zhǔn)線對代謝物進(jìn)行峰面積積分，并對同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進(jìn)行校正，對代謝物進(jìn)行定量分析。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）和單維分析（Student’sT檢驗(yàn)）相結(jié)合的方法，利用OPLS-DA 模型（正交偏最小二乘判別分析，orthogonal partial least squares discrimination analysis）生成的VIP 值（variable importance in the projection）來篩選組間差異代謝物（differential expressed metabolites），VIP 值越大，說明該差異代謝物對樣品組間分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力越強(qiáng)，F(xiàn)C（fold change）值越大，說明該差異代謝物在2 個(gè)時(shí)期的差異倍數(shù)越大，判定標(biāo)準(zhǔn)為VIP值大于1 且P小于0.05[19]。

參照章智鈞等[20]和王莎等[21]的方法，對3個(gè)時(shí)期篩選到的差異代謝物進(jìn)行聚類分析，分析差異代謝物在油茶花芽3 個(gè)時(shí)期中的表達(dá)模式。同時(shí)使用KEGG 通路數(shù)據(jù)庫（http://www.genome.jp/KEGG/pathway.html）對差異代謝物參與的代謝通路進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分化時(shí)期油茶花芽的激素含量

花芽中各激素在油茶花芽分化3 個(gè)時(shí)期的動(dòng)態(tài)變化如圖2所示。由圖2可見，從PTⅠ到PTⅢ時(shí)期，GA1（赤霉素1，Gibberellins 1）、GA9、GA15、GA19、GA20、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate， MEJA）、吲哚-3-乙酸甲酯（methyl indole-3-acetate， ME-IAA）、茉莉酸-異亮氨酸偶聯(lián)物（jasmonoyl-L-isoleucine，JA-ILE）和茉莉酸（Jasmonic acid，JA）的含量呈先增后減的變化趨勢，說明在PT Ⅱ時(shí)期這些激素對油茶子房和花藥的發(fā)育影響較大。

圖2 在油茶花芽分化3 個(gè)時(shí)期花芽中各激素含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamic change of the phytohormones in three stages in C.oleifera flower buds

在PT Ⅱ時(shí)期花芽中GA9的含量比在PT Ⅰ時(shí)期顯著增加了150%，GA1、GA15、GA19和GA20的含量在3 個(gè)時(shí)期間無顯著差異。JA 含量在PT Ⅱ時(shí)期最高，分別比前后2 個(gè)時(shí)期顯著增加了145%和222%。JA-ILE 含量在PT Ⅱ時(shí)期較高，分別比前后2 個(gè)時(shí)期顯著增加了176%和189%。在PT Ⅱ時(shí)期ME-IAA 的含量分別比在PT Ⅰ、PT Ⅲ時(shí)期顯著增加了145%和222%。在這3 個(gè)時(shí)期中，異戊烯腺嘌呤（N6-Isopentenyladenine，IP）含量持續(xù)上升，各時(shí)期間無顯著差異。在3 個(gè)時(shí)期中，IAA、 吲哚-3- 甲醛（indole-3-carboxaldehyde，ICAld）、水楊酸（salicylic acid，SA）和反式玉米素（trans-zeatin，tZ）的含量呈逐漸下降的趨勢，其中ICAld 含量在PT Ⅲ時(shí)期與在PT Ⅰ和PT Ⅱ時(shí)期有顯著差異，tZ 含量在3 個(gè)時(shí)期間均有顯著差異。ABA 的含量呈現(xiàn)先減后增的變化趨勢，在PT Ⅲ時(shí)期含量最高，在PT Ⅱ時(shí)期含量最低，兩者有顯著差異，前者比后者增多了171%。IAA 含量在PT Ⅰ時(shí)期最高，在PT Ⅲ時(shí)期最低，在PT Ⅰ時(shí)期與在PT Ⅱ、PT Ⅲ時(shí)期的含量差異顯著，在PT Ⅰ時(shí)期含量比在PT Ⅱ、PT Ⅲ時(shí)期分別增加了77%和198%。IAA 與ABA 含量比值在這3 個(gè)時(shí)期呈現(xiàn)先稍上升后下降的趨勢（圖3），在PT Ⅲ時(shí)期其比值降至0.02。結(jié)果表明，較低的IAA 與ABA 含量比值與PT Ⅲ時(shí)期的發(fā)生有關(guān)，IP 含量的增加與花芽分化時(shí)期的推進(jìn)有關(guān)。

圖3 在油茶花芽分化3 個(gè)時(shí)期花芽中IAA 與ABA 含量 比值的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic change of IAA to ABA ratio of three stages in C.oleifera flower buds

2.2 不同分化時(shí)期油茶花芽的差異代謝物

2.2.1 差異代謝物的PCA 及OPLS-DA 模型分析

首先采用PCA 分析方法得到3 個(gè)時(shí)期油茶花芽代謝物的PCA 得分（圖4）。由圖4 可見，普通油茶雌雄蕊形成期與子房和花藥形成期、雌雄蕊成熟期2 個(gè)時(shí)期的數(shù)據(jù)點(diǎn)在得分圖上區(qū)分較明顯。分子組成和含量區(qū)別較大，說明在花芽分化時(shí)期，其內(nèi)部代謝物組成成分和含量有著較大的變化。

圖4 在油茶花芽分化3 個(gè)時(shí)期花芽中差異代謝物的PCA 分析結(jié)果Fig.4 Results of PCA analysis for the different metabolities from flower buds of C.oleifera in 3 differentiation stages

同時(shí)，為更準(zhǔn)確地找到這3 個(gè)時(shí)期油茶花芽代謝物的差異，采用有監(jiān)督的OPLS-DA 模型來進(jìn)一步分析。通過OPLS-DA 模型分析可以過濾掉代謝物中與分類變量不相關(guān)的正交變量，并對非正交變量和正交變量分別分析，從而能準(zhǔn)確獲取更加可靠的代謝物在油茶花芽不同分化時(shí)期的差異情況，分析結(jié)果如圖5 所示。由圖5 可見，PT Ⅰ與PT Ⅱ時(shí)期、PT Ⅰ與PT Ⅲ時(shí)期皆能明顯區(qū)分，3 個(gè)時(shí)期的樣品區(qū)分效果較好。通過OPLS-DA 分析，得到2個(gè)主成分，R2X=0.657，R2Y=1.000，Q2=0.952，R2和Q2均大于0.5，說明本次OPLSDA 模型擬合效果較好，R2與Q2的差值小于0.3，同時(shí)由OPLS-DA 驗(yàn)證結(jié)果（圖6）可以得知R2和Q2的P值均小于0.005，說明在此置換檢驗(yàn)中僅1個(gè)隨機(jī)分組模型結(jié)果優(yōu)于本OPLS-DA 模型。

圖5 在油茶花芽分化3 個(gè)時(shí)期花芽中差異代謝物的OPLS-DA 分析結(jié)果Fig.5 Results of OPLS-DA analysis for the different metabolities from flower buds of C.oleifera in 3 differentiation stages

圖6 在油茶花芽分化3 個(gè)時(shí)期花芽中差異代謝物的OPLS-DA 模擬驗(yàn)證Fig.6 Permutation test of OPLS-DA analysis for the different metabolities from flower buds of C.oleifera in 3 differentiation stages

2.2.2 差異代謝物的篩選

采用多維分析與單維分析相結(jié)合的方法，對雌雄蕊形成期與子房和花藥形成期、雌雄蕊成熟期分別進(jìn)行組間分析比較。在PT Ⅱ與PT Ⅰ時(shí)期花芽中共檢測出519 種代謝物，二者相比較VIP 值大于1 的差異代謝物有95 種（表2），F(xiàn)C 值不小于2.00的差異代謝物表示上調(diào)，共72 種，F(xiàn)C 值不大于0.50的表示下調(diào)，共23 種。在篩選出的差異代謝物中，黃酮類占25%，酚酸類占14.6%；上調(diào)的黃酮類占總差異黃酮類的75%，上調(diào)的酚酸類占總差異酚酸類的93%。PT Ⅲ與PT Ⅰ時(shí)期花芽中共檢測出520種代謝物，二者相比VIP 值大于1 的差異代謝物有135 種，F(xiàn)C 值不小于2.00 的差異代謝物共80 種，F(xiàn)C 值不大于0.50 的差異代謝物共55 種。

表2 在油茶花芽分化3 個(gè)時(shí)期花芽中的差異代謝物?Table 2 Differential metabolities in three stages of differentiation in C.oleifera buds

3 個(gè)時(shí)期共有的差異代謝物為59 種，主要包括黃酮類（25.4%）、酚酸類及脂質(zhì)（22%）、氨基酸（10%）、核苷酸（10%），還有少量生物堿、有機(jī)酸、維生素和糖類。VIP 值越大，證明該差異代謝物在組間差異中的影響強(qiáng)度和解釋能力越強(qiáng)，越有可能是誘導(dǎo)該過程的重要代謝物分子。

2.2.3 差異代謝物的表達(dá)模式

對篩選到的3 個(gè)時(shí)期油茶花芽中171 種差異代謝物進(jìn)行聚類分析，將差異表達(dá)顯著（P＜0.05）的代謝物在不同樣品中相對表達(dá)量的對數(shù)值以不同顏色在熱圖中展現(xiàn)，結(jié)果如圖7 所示。聚類分析結(jié)果顯示，組內(nèi)樣本重復(fù)性較好，相對于雌雄蕊形成期，72 種差異代謝物在子房和花藥形成期高表達(dá)，包括黃酮類、酚酸類、生物堿、有機(jī)酸、氨基酸、核苷酸和脂質(zhì)，在此時(shí)期高表達(dá)的黃酮類以鼠李素-3-O-葡萄糖苷、沒食子兒茶素-沒食子兒茶素、圣草酚等為主，高表達(dá)的酚酸類以3-丙酸、對香豆酸、3,4-二羥基-3-甲氧基苯戊酸等為主；80 種差異代謝物在雌雄蕊成熟期高表達(dá)，包含酚酸類、黃酮類、氨基酸、核苷酸和脂質(zhì)，其中該時(shí)期高表達(dá)的酚酸類以新綠原酸、對香豆酸、對香豆酸甲酯為主，黃酮類以矢車菊素-3-O-(6-O-(E)-對香豆酰-葡萄糖苷)-5-O-葡萄糖苷、鼠李素-3-O-葡萄糖苷、沒食子兒茶素-沒食子兒茶素等為主。在PT Ⅲ時(shí)期花芽中黃酮類、酚酸類等表達(dá)上調(diào)，較多的脂質(zhì)、氨基酸及其衍生物、單寧和萜類表達(dá)下調(diào)，少量游離脂肪酸高表達(dá)。另外，氨基酸含量在這3 個(gè)時(shí)期變動(dòng)較大，單寧、萜類化合物在PT Ⅲ時(shí)期表達(dá)下調(diào)。

圖7 在油茶花芽分化3 個(gè)時(shí)期花芽中差異代謝物含量的聚類Fig.7 Cluster analysis for the different metabolities from flower buds of C.oleifera in 3 differentiation stages

2.2.4 差異代謝通路

在PT Ⅰ和PT Ⅱ時(shí)期油茶花芽中類黃酮生物合成通路如圖8 所示。由圖8 可見，與PT Ⅰ時(shí)期相比，PT Ⅱ時(shí)期油茶花芽中，黃酮類圣草酚（eriodictyol）在類黃酮生物合成通路（flavonoid biosynthesis，ko00941）中表達(dá)上調(diào)，而新橙皮苷（neohesperidin）、沒食子兒茶素（gallocatechin）和二氫楊梅素（dihydromyricetin）合成下調(diào)。

圖8 PT Ⅱ時(shí)期油茶花芽的類黃酮生物合成通路（以PT Ⅰ時(shí)期為對照）Fig.8 Flavonoid biosynthesis pathway in C.oleifera flower buds at PTⅡ stage (PTI stage as CK)

在PT Ⅱ和PT Ⅲ時(shí)期油茶花芽中類黃酮生物合成通路如圖9 所示。由圖9 可見，與PT Ⅱ時(shí)期相比，PT Ⅲ時(shí)期油茶花芽中，圣草酚在類黃酮生物合成通路（ko00941）中仍上調(diào)，柚皮苷（naringin）和新橙皮苷（neohesperidin）在該途徑中合成下調(diào)。

圖9 PT Ⅲ時(shí)期油茶花芽的類黃酮生物合成通路（以PT Ⅱ時(shí)期為對照）Fig.9 Flavonoid biosynthesis pathway in C.oleifera flower buds at PTⅢ stage (PTⅡ stage as CK)

另外，從PT Ⅰ到PT Ⅲ時(shí)期，對香豆酸（4-Coumarate）在酪氨酸代謝途徑（tyrosine metabolism，ko00350）、泛醌及其他萜醌類生物合成途徑（ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis，ko00130）、苯丙氨酸生物合成途

徑（phenylpropanoid biosynthesis，ko00940）、異喹啉生物堿生物合成途徑（isoquinoline alkaloid biosynthesis，ko00950）和辣椒素生物合成途徑（capsaicin biosynthesis，ko00999）中合成量上升。3 個(gè)時(shí)期中，對香豆酸、咖啡酸（caffeic acid）、對香豆醇（p-coumaryl alcohol）、松柏苷（coniferin）、芥子醇（sinapyl alcohol）和苯丙氨酸（L-phenylalanine）在苯丙氨酸生物合成途徑中的含量均上升，而氨基酸含量在上述途徑（ko00350、ko00130、ko00940、ko00950、ko00999）中呈下降的趨勢。

續(xù)表2Continuation of table 2

續(xù)表2Continuation of table 2

續(xù)表2Continuation of table 2

由此可知，在這3 個(gè)時(shí)期中，黃酮類圣草酚的含量在類黃酮生物合成途徑中均在上升，新橙皮苷含量則均下調(diào)，柚皮苷含量呈緩慢下降后急劇下降的趨勢，二氫楊梅素和沒食子兒茶素含量呈先下降后平緩的趨勢，其余黃酮類化合物含量的變化不顯著；對香豆酸等酚酸類化合物在這3個(gè)時(shí)期上升，同時(shí)，在一些有酚酸參與的代謝途徑中氨基酸含量下降。

3 結(jié)論與討論

3.1 不同分化時(shí)期花芽中激素含量的變化及其作用

植物花芽分化是植物由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向生殖生長的開端，決定了植物的開花和結(jié)果過程，因此花芽分化是植物成花過程的關(guān)鍵時(shí)期[22]。同時(shí)，花芽分化還對植物的開花數(shù)目、質(zhì)量及坐果率等有直接的影響[23]?；ㄑ恐械闹参锛に?、代謝物種類繁多，不同種類和濃度的激素、代謝物均會(huì)影響到花芽的分化[24]。GA 是一種在果樹生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用的植物生長調(diào)節(jié)劑，具有打破種子休眠、促進(jìn)生長、提高坐果率、改善果實(shí)品質(zhì)的功能[25]；ABA 具有促進(jìn)脫落、促進(jìn)開花、疏花疏果、促進(jìn)休眠、抑制生長及調(diào)節(jié)果實(shí)成熟和衰老的作用[26-28]， IAA 對植物具有促進(jìn)生長、抑制器官脫落等作用，與ABA 是拮抗關(guān)系[29]，IAA 和ABA 含量的差異與花芽形態(tài)分化相關(guān)性較大。本研究中采用GC 技術(shù)，分析了雌雄蕊形成期、子房和花藥形成期、雌雄蕊成熟期3 個(gè)階段油茶花芽中GA1、GA9、GA15、GA19、GA20、MEJA、ME-IAA、ME-ILE、JA-ILE、JA、SA、ICAld、tZ、IP、IAA 和ABA這16 種植物內(nèi)源激素含量的變化，發(fā)現(xiàn)3 個(gè)時(shí)期中，在子房和花藥形成期，油茶花芽中GA1、GA9、GA15、GA19、GA20、MEJA、ME-IAA、JAILE 和JA 含量高于另外2 個(gè)時(shí)期，表明植物內(nèi)源激素對油茶花芽分化發(fā)揮重要調(diào)控作用。在油茶花芽的前分化期，ABA 含量的增加可以促進(jìn)花芽分化，IAA、GA3含量與花芽分化的相關(guān)性不顯 著[30]。在本研究中，IAA 和ABA 含量在雌雄蕊成熟期前持續(xù)降低，IAA 和ABA 含量的比值緩慢增大，在雌雄蕊成熟期后其比值逐漸降低并低于前2個(gè)時(shí)期，這與李秉真等[31]的研究結(jié)果相似。JA 在植物抗逆性、抗蟲性方面起到促進(jìn)作用，高濃度的JA 還與油茶從營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)到生殖生長有關(guān)[32]。本研究中，油茶花芽JA 含量在子房和花藥形成期顯著增加。有研究結(jié)果表明，在開花前期高濃度的JA 對‘鐵城一號(hào)’油茶花芽開花有誘導(dǎo)作用[32]，這與本研究結(jié)果相近。在雌雄蕊成熟期，油茶花芽IAA 和ABA 含量的比值降低，因此推測其比值降低有助于油茶花芽雌雄蕊發(fā)育成熟，進(jìn)入雌雄蕊成熟期后，油茶花芽GA 含量下降，說明GA 屬于油茶抑花激素，這與喻雄等[32]的研究結(jié)果一致，因此雌雄蕊成熟期ABA 和GA 含量比值的增加可能對促進(jìn)雌雄蕊發(fā)育成熟有促進(jìn)作用。

3.2 不同分化時(shí)期花芽中代謝物含量的變化及其作用

黃酮類化合物是植物新陳代謝過程中產(chǎn)生的一類重要天然有機(jī)化合物，其在植物生長旺盛、成年、衰老的器官中合成、轉(zhuǎn)換和消耗[25,33]。有研究結(jié)果表明，在菊花Chrysanthemum morifolium花芽不同分化時(shí)期出現(xiàn)澇脅迫時(shí)，其頭狀花序中黃酮醇、黃酮和碳苷黃酮上調(diào)明顯，以保護(hù)自身不被更嚴(yán)重的澇脅迫所傷害，與類黃酮生物合成途徑中酶相關(guān)的CHI、F3H、DFR和ANS基因的表達(dá)上調(diào)會(huì)促進(jìn)黃酮醇、黃酮和碳苷黃酮含量的提高[34]；同時(shí)，DFR基因表達(dá)量隨著花序開放程

度增大表現(xiàn)出下降的趨勢[35]。隨著分化時(shí)期的推移，類黃酮和酚酸等含量明顯升高，類黃酮在花芽分化期可能從植物葉片、莖等部位轉(zhuǎn)移并消耗于花芽中[36]。植物激素IP 是細(xì)胞分裂素（cytokinin）的一種，其含量隨著分化時(shí)期的推移而上升。

有研究結(jié)果表明，外施細(xì)胞分裂素能促進(jìn)銀杏Ginkgo biloba葉片黃酮類化合物的積累[37]。因此，內(nèi)源IP 的含量可能與黃酮類化合物含量上升有關(guān)。但也有研究結(jié)果表明，內(nèi)源細(xì)胞分裂素含量隨著枝芽的成熟而降低[38]，這與本研究結(jié)果相反。在一些與酚酸相關(guān)的代謝通路中，隨著酚酸含量的增加，通路中氨基酸含量下降，同時(shí)酚酸含量的增加會(huì)促進(jìn)氨基酸的消耗，并增加可溶性蛋白含量，這與李賀敏等[39]的研究結(jié)果一致。另外，在雌雄蕊成熟期，油茶花芽中GA1、GA9、GA15、GA19、GA20含量下降的同時(shí)，氨基酸含量亦下降，說明GA 含量下降與可溶性蛋白含量的提高有關(guān)，這與李興軍[40]的研究結(jié)果相似。從3 個(gè)時(shí)期差異代謝物的變化趨勢可以看出，核苷酸及其衍生物表達(dá)量在雌雄蕊形成期上升，在子房和花藥形成期下調(diào)，說明子房與花藥形成期是花粉母細(xì)胞、胚珠染色體復(fù)制的時(shí)期，需消耗較多的核苷酸；脂質(zhì)的種類和含量在雌雄蕊形成期與子房和花藥形成期均增加，在雌雄蕊成熟期下降，原因可能是雌雄蕊成熟期為子房胚珠、花粉母細(xì)胞、小孢子等發(fā)育旺盛的階段，需要消耗大量的能量，合成大量蛋白質(zhì)，因此前2 個(gè)時(shí)期積累的糖類、脂質(zhì)和氨基酸等代謝物可能在雌雄蕊成熟階段被消耗掉[41]。研究結(jié)果表明，黃酮類化合物和酚酸類的含量與油茶花芽分化相關(guān)。

本研究的不足之處在于未能確定氨基酸含量下降與可溶性蛋白含量上升的關(guān)系，應(yīng)結(jié)合蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，證實(shí)相關(guān)蛋白在該階段存在上調(diào)，并結(jié)合其合成通路證明該階段氨基酸含量與可溶性蛋白含量的關(guān)系。后續(xù)將對花芽分化后期的基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究，深入了解其花芽分化后期基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄本差異以及蛋白質(zhì)種類含量對花芽生長發(fā)育的作用機(jī)制。