杜仲根際與非根際土壤微生物的差異研究

李德文，季倩如，劉 英，周文玲，吳嘉儀，唐中華，趙雨森

（東北林業(yè)大學 a.森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室；b.化學化工與資源利用學院； c.林學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

植物的生長會導致其根際土壤發(fā)生變化[1]。研究植物生長中根際與非根際間的土壤性質(zhì)差異性，對指導植物林建設(shè)有重要的理論和實踐意義。土壤理化指標是土壤相關(guān)研究的基礎(chǔ)，通過對土壤pH、碳氮磷等含量的測定，可以直觀的得出土壤養(yǎng)分含量的變化。土壤微生物是土壤內(nèi)部物質(zhì)循環(huán)的主要生物因子，是物質(zhì)循環(huán)的關(guān)鍵驅(qū)動者[2]。 林地土壤微生物在維持和提高土壤肥力、促進森林物質(zhì)、能量循環(huán)中起著重要作用。目前，土壤養(yǎng)分循環(huán)涉及的功能基因類別廣泛，例如，在土壤氮循環(huán)方面，有可以研究土壤中固氮菌類群多樣性的nifH基因、在土壤中起硝化和反硝化作用的amoA、nirS、narG和nirS基因，在磷循環(huán)方面，也有起礦化作用的phoD基因等等。這些基因表達量的變化均與其理化性質(zhì)改變密切相關(guān)，通過研究土壤養(yǎng)分循環(huán)基因的變化來探討植物根際與非根際環(huán)境的差異是農(nóng)林土壤研究的重點。

杜仲（Eucommia ulmoidesOliv.）是杜仲屬僅存的孑遺植物,是退耕還林系統(tǒng)中具有廣泛市場前景的綠色樹種之一,樹皮和樹葉均可用藥，具有很高的藥用價值和經(jīng)濟價值[3]。對于不同地區(qū)同種植物根際土壤微生物群落的分析已有很多，以杜仲為例，不同種植地的杜仲根際微生物皆存在不同程度差異，而這些差異性會導致杜仲主要有效成分發(fā)生改變[4-5]，在相同生境下，距離杜仲不同距離的土壤微生物成分的研究還較少，而根際與非根際土壤養(yǎng)分含量及微生物的差異的研究對于杜仲培育具有重要意義?；诖?，本文通過研究杜仲根際與非根際土壤理化性質(zhì)及微生物群落結(jié)構(gòu)等的差異，探討杜仲種植對于其土壤營養(yǎng)元素含量的微生物影響機制，以期為今后人工林生態(tài)系統(tǒng)的科學管理提供一定的理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料采集

土壤樣品于2020年10月8日在東北林業(yè)大學校園內(nèi)采集，選取栽種的杜仲植株采集其根際土壤與非根際土壤，根際土采用抖落法，非根際土采用“S”型采樣法，各取5 個取樣點并分別均勻混合，一部分風干用于土壤理化性質(zhì)的測定，一部分直接帶入實驗室進行土壤微生物群落分析，一部分液氮運輸，立即進行DNA 提取以用于后續(xù)功能基因分析。

1.2 研究方法

1.2.1 土壤理化指標測定

參照土壤農(nóng)化分析方法[6]分別測定土壤pH、電導率、含水量等土壤基本理化指標。

采用重鉻酸鉀外加熱法測定土壤有機碳含量；采用半微量凱氏定氮法測定土壤全氮含量；采用NaOH 熔融——鉬銻抗比色法測定土壤全磷含量；采用堿解擴散法測定土壤堿解氮含量；采用靛酚藍比色法測定土壤銨態(tài)氮含量；采用紫外分光光度法測定土壤硝態(tài)氮含量；采用碳酸氫鈉提取——鉬銻抗比色法測定土壤速效磷含量[7]。

1.2.2 Biolog-Eco 測定

采用Biolog-Eco 法[8-9]測定土壤微生物功能多樣性，稱取10 g 新鮮土壤樣品，置于滅菌后的內(nèi)含90 mL 0.85% NaCl 溶液的三角燒杯中， 200 r/min 下振蕩30 min 后，繼續(xù)用NaCl 溶液稀釋至10-3g/mL，把稀釋液加入到Biolog-ECO 板的96 個孔中（每孔各150 μL），25 ℃下暗環(huán)境培養(yǎng)10 d，每隔24 h 在酶標儀上測定590 nm 下吸光值。

1.2.3 土壤微生物功能基因表達量測定

使用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit 試劑盒（Omega公司）提取土壤DNA。根據(jù)試劑盒步驟進行提取，獲得的DNA 于-80 ℃下保存，再用紫外分光光度計進行DNA 濃度及純度的測定，同時進行凝膠電泳檢測，得到優(yōu)質(zhì)DNA。隨后，采用qPCR 法測定根際及非根際土壤功能基因表達量，表1 為擴增引物序列。

表1 土壤養(yǎng)分循環(huán)微生物功能基因PCR 擴增引物序列Table 1 PCR amplification primer sequence of soil nutrient cycling microbial functional genes

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計分析軟件進行樣本T 檢 驗；采用Canoco 5.0 軟件進行冗余分析；采用Excel 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際與非根際土壤理化指標差異分析

由表2 可知，杜仲根際與非根際土壤理化指標均存在差異。其中根際土壤（GJ）電導率低于非根際土壤（FG），GJ 全氮含量達到2.42± 0.08 g/kg，比FG 全氮含量高30.81%，GJ 堿解氮含量高達65.33±2.69 g/kg，是FG 的1.39 倍，根際硝態(tài)氮含量比非根際含量低，上述指標均差異顯著（P＜0.05）；土壤有機碳、全磷、速效磷等GJ 指標的含量也均高于FG 含量。杜仲GJ 與FJ間土壤碳、磷含量在差異不顯著，土壤氮含量影響顯著（P＜0.05）。

表2 杜仲GJ 與FG 理化指標含量?Table 2 Content of physical and chemical indexes in GJ and FG of E.ulmoides

2.2 根際與非根際土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)變化分析

由圖1 可知，杜仲GJ、FG 微生物AWCD 值隨著培養(yǎng)時間的延長，對碳源的利用總量也都呈逐漸增加的趨勢，即微生物活性隨著培養(yǎng)時間的延長而變強；土壤微生物在培養(yǎng)24 h 后，逐漸適應了Biolog-Eco 微平板基質(zhì)環(huán)境，AWCD 值快速增長，直至144 h，此時其中微生物對于碳源的利用明顯增加，隨后又緩慢增長，直至最后趨于穩(wěn)定。不同培養(yǎng)階段杜仲GJ 的AWCD 均顯著高于FG，說明GJ 的微生物群落碳源利用量及代謝活性均高于FG。

圖1 土壤微生物群落AWCD 隨培養(yǎng)時間變化Fig.1 AWCD of soil microbial community changed with incubation time

由表3 可知，不同類型土壤微生物群落代謝存在活性差異，其中GJ 的總碳源的利用能力(AWCD)，物種McIntosh 指數(shù)(U)均顯著大于FG （P＜0.05），在Simpson 指數(shù)(D)、Shannon 指數(shù)(H)上無明顯差異。

表3 土壤微生物群落 144h AWCD 和多樣性指數(shù)Table 3 144h AWCD and diversity index of soil microbial community

2.3 根際與非根際土壤功能性微生物表達量的差異分析

6 種氮循環(huán)功能基因（nifH、nirS、nosZ、narG、amoA-AOA、amoA-AOB）以及Thermomicrobia和ITS基因的GJ 表達量均高于FG，其中ITS基因相差3.92E+05、nifH基因相差4.70E+04、nosZ基因相差2.40E+05，它們的GJ 與FG 表達量間多存在顯著差異（P＜0.05）；而GJAcidobacteria表達量為6.26E+05，遠遠低于其FG 該基因表達量，GJPhoD表達量也比其FG 表達量低43%，與上述基因恰好相反。Thermomicrobia、nifH、nirS、amoA-AOB、narG基因的拷貝數(shù)較低。

2.5 根際與非根際土壤理化指標與功能基因的相關(guān)分析

根據(jù)冗余分析（Redundancy analysis，RDA） 中箭頭的長度、各功能基因之間的夾角以及冗余分析排序可知（圖3），在杜仲GJ 中影響最大的是phoD和Acidobacteria基因，它們與土壤銨態(tài)氮、堿解氮、全磷呈正相關(guān)；與硝態(tài)氮、全氮等呈負相關(guān)，RDA 兩軸的累積貢獻率分別為76.45%和23.55%。杜仲FG 兩軸的累積貢獻率分別為81.94%和18.06%，nirS基因與phoD基因?qū)ζ渫寥览砘笜擞绊懽铒@著，它們與土壤全氮、速效磷、全磷呈正相關(guān)，與其他指標呈負相關(guān)。由表4 可知，phoD基因是GJ 微生物與功能基因間的最大影響因子，解釋率為70.3%（F=2.4，P=0.148），其次是Acidobacteria（F ＜0.1，P=1）；nirS基因是FG 微生物與功能基因間的最大影響因子，解釋率為81.9%（F=4.5，P=0.148），其次是phoD（F＜0.1，P=1）。

圖3 GJ 與FG 功能性微生物與理化指標的RDA 分析Fig.3 RDA analysis of functional microorganisms and physicochemical indexes in GJ and FG

表4 土壤功能性基因微生物與理化指標冗余分析排序結(jié)果Table 4 Ranking results of soil functional genes and physical and chemical indexes by redundancy analysis

3 結(jié)論與討論

有研究表明，草灌根際土壤全氮含量顯著（P＜ 0.05）高于非根際土壤83.33%；同一植被根際土壤全磷含量低于非根際土壤[15-16]。不同種植模式下油茶林地根際土壤中有效磷含量顯著高于非根際土壤[17]。紅花在不同的澆灌方式下的根際土壤理化指標（全氮、全鉀、全磷、有機質(zhì)、堿解氮、速效鉀、速效磷等含量,含水率）均高于或顯著高于非根際土壤[18]。本研究中，杜仲根際土壤碳、氮、磷含量均高于非根際土壤，且杜仲根際與非根際土壤間全氮、堿解氮、硝態(tài)氮含量均差異顯著 （P＜0.05），與上述結(jié)果（表2）一致。

碳在調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分循環(huán)、保持土壤肥力和作物產(chǎn)量等方面發(fā)揮著重要作用。有研究表明，土壤有機碳顯著影響微生物的活性和代謝，而微生物的豐度和結(jié)構(gòu)對土壤有機碳的積累和固定極其重要[19]。平均顏色變化率（average well color development，AWCD）表示土壤微生物群落對31種碳源的利用能力和代謝活性的變化，體現(xiàn)了土壤微生物群落生理功能多樣性[20]。AWCD 值越大，意味著土壤微生物密度越大，活性越高；反之，微生物密度越小，活性越低。有研究表明，在對雙季水稻不同的處理條件下，均可發(fā)現(xiàn)其土壤中的不同部位，根際土壤微生物生物量碳含量和土壤微生物基礎(chǔ)呼吸高于非根際土壤，而非根際土壤微生物生長速率和微生物線索均高于根際土壤[21]。 土壤微生物群落AWCD 以及各功能多樣性指數(shù)與土壤含水量和有機碳顯著正相關(guān)（P＜0.05），與pH 顯著負相關(guān)（P＜0.01）[22]，杜仲根際土壤pH 則顯著高于非根際土壤（表2），與其根際土壤與非根際土壤的含鹽量差異有關(guān)，土壤含鹽量變化對土壤電導率的影響呈顯著正相關(guān)[23]，本研究中，杜仲根際土壤電導率顯著低于非根際土壤，所以其根際土壤的含鹽量顯著低于非根際土壤。采用培養(yǎng)144 h 后的土壤微生物吸光值計算分析其McIntosh 指數(shù)（U）、Simpson 指數(shù)（D）和Shannon（H）指數(shù)，結(jié)果表明，杜仲根際的土壤微生物含量較高且能較早利用碳源，與多數(shù)結(jié)論相同[16-24]，且由表3 可知，杜仲根際土壤包含的植物養(yǎng)分更多，且均勻度指數(shù)顯著高于非根際土壤，為土壤微生物代謝活動提供營養(yǎng)元素和較好的生境，從而有利于微生物分解有機物和某些生物，加快了土壤有機物周轉(zhuǎn)速度。

土壤微生物參與了土壤中發(fā)生的所有過程，是土壤生態(tài)系統(tǒng)中養(yǎng)分源和匯的一個巨大的原動力，它們可以影響腐殖質(zhì)的形成，增加土壤肥力，通過分解有機物為植物提供養(yǎng)分，在植物凋落物分解、土壤能量轉(zhuǎn)移、養(yǎng)分循環(huán)與平衡、土壤理化性質(zhì)改善、林分發(fā)育及生態(tài)系統(tǒng)的長期穩(wěn)定性中發(fā)揮著重要的作用。本研究針對10 種不同功能類型土壤微生物基因（表1），及采用上述功能基因來評價土壤微生物參與的養(yǎng)分循環(huán)過程。以往的研究顯示，nifH、amoA-AOA、amoA-AOB、narG、nirS、nosZ基因豐度與氮儲量具有顯著線性關(guān)系，這表明含有這些基因的微生物量對于提高土壤氮儲量具有重要作用。本研究中結(jié)果表明：根際土壤基因表達量均高于非根際土壤，且其中nifH、amoA-AOA、nosZ差異顯著（P＜0.05），可以看出杜仲微生物豐度受土地利用變化的影響很大。Acidobacteria及phoD基因非根際土壤表達量高于根際土壤（P＜0.05），與杜仲分泌以及其土壤養(yǎng)分的差異有關(guān)，由表2 可知，杜仲根際土壤的pH 顯著高于非根際土壤，非根際土壤的酸性程度高于根際土壤，這可能就是其根際土壤Acidobacteria基因表達量顯著低于非根際土壤導致的。土壤全氮和速效磷含量是影響土壤氮循環(huán)基因的主要因素[25]。本研究中根際土壤與非根際土壤全氮的差異顯著（P＜0.05），速效磷有差異但不顯著（表2），這可能也與氮循環(huán)相關(guān)基因nifH、amoA-AOB、nirS等的拷貝數(shù)較低（圖2）有關(guān)。

圖2 土壤功能性微生物表達量Fig.2 Expression of soil functional microorganisms

本文選擇土壤電導率、pH，土壤碳氮磷，銨態(tài)氮、硝態(tài)氮以及C/N、C/P 等土壤理化指標與土壤功能性基因進行RDA 分析。RDA 分析表明，phoD基因是根際土壤微生物與功能基因間的最主要影響因子，nirS基因是非根際土壤微生物與功能基因間的最主要影響因子。有研究顯示，土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量變化是導致土壤反硝化菌群多樣性和反硝化酶活性差異的關(guān)鍵因子[26]，nirS基因是重要的起反硝化作用的基因之一，杜仲非根際土壤與銨態(tài)氮、硝態(tài)氮呈負相關(guān)，而根際與非根際間nirS基因表達量差異不顯著，這可能是因為其表達量均較低導致的。有研究表明，phoD基因豐度和Shannon 指數(shù)與土壤pH 顯著正相關(guān)，而與總磷、速效磷、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮均顯著負相關(guān)[27]，特定phoD微生物的功能可能因土壤中植物的不同而不同[28]，還有研究表明，大氣氮沉降可導致土壤微生物生長處于碳限制的狀態(tài)，從而使微生物量及其活性下降，其磷固持能力也隨之下降[29]。本文中phoD基因?qū)τ诙胖俑H與非根際的影響都很大。phoD基因在土壤循環(huán)中起到磷礦化的作用，杜仲根際土壤中的phoD基因表達量低于非根際土壤，可能就是導致其根際土壤與非根際土壤碳、磷含量差異不明顯的原因，這也充分驗證了phoD基因是杜仲土壤理化性質(zhì)變化的主要因素之一（表4）。

杜仲GJ 營養(yǎng)元素含量高于FG，其中pH、電導率、全氮、堿解氮、硝態(tài)氮差異顯著；杜仲GJ微生物含量比FG 高且能較早利用碳源、根際土壤的總碳源的利用能力(AWCD)，物種McIntosh 指數(shù)（U）均顯著高于FG；phoD和Acidobacteria基因及nirS和phoD基因分別與杜仲GJ 與FG 理化指標相關(guān)性最高，即phoD基因是杜仲土壤理化指標與功能基因間的主要影響因子。本研究僅對校園內(nèi)栽種的杜仲進行實驗分析，而不同的溫度、環(huán)境、樹齡和胸徑[30]等均會影響根際與非根際土壤元素的含量。為了進一步研究杜仲土壤營養(yǎng)元素與其土壤微生物含量間的關(guān)系，后續(xù)可以采集大田或林地杜仲的土壤進行相關(guān)分析，為今后更深入的研究杜仲微生物影響機制、分析其栽培管理方式提供一定的理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支撐。