新型三維網(wǎng)格宮內(nèi)節(jié)育器對(duì)獼猴子宮內(nèi)膜 ER、PR和PAX2影響

于建春 張美華 于 玲 宋 霞 邱 毅

山東大學(xué)附屬山東省婦幼保健院，國(guó)家衛(wèi)生健康委生育調(diào)控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(濟(jì)南，250014)

放置IUD的副作用或并發(fā)癥主要有IUD移位和排出、子宮穿孔、月經(jīng)失血增加、疼痛以及置器后子宮或盆腔發(fā)炎和異位妊娠[1-5]。研究認(rèn)為，IUD的形狀、大小和重量對(duì)避孕效果及副作用的發(fā)生有很大影響[2,5]，因此需要對(duì)IUD形狀、大小、重量及體積進(jìn)入研究。釋放孕酮類(lèi)的IUD對(duì)子宮雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)的表達(dá)有下調(diào)節(jié)作用[6-7]。配對(duì)盒子基因2(PAX2)是一種致癌基因，參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展。最近的免疫組織化學(xué)研究表明，子宮內(nèi)膜增生中PAX2缺失表達(dá)的發(fā)生隨著子宮內(nèi)膜癌變過(guò)程中的惡性進(jìn)展而增加[8-10]。目前少見(jiàn)IUD作為避孕方法對(duì)獼猴子宮內(nèi)膜PR、ER和PAX2表達(dá)影響的研究。筆者為獼猴設(shè)計(jì)并制造了一種新型的鎳鈦(Ni-Ti)和硅橡膠三維網(wǎng)格宮內(nèi)節(jié)育器(3-DG IUD)，觀(guān)察獼猴子放置后子宮內(nèi)膜的變化等。

1 材料和方法

1.1 3-DG IUD 和放置器

3-DG IUD 的框架由鎳鈦合金絲線(xiàn)(直徑0.05 mm)構(gòu)成，且覆蓋一層硅橡膠；設(shè)計(jì)大號(hào)和小號(hào)兩種，小號(hào)3-DG IUD上端橫徑長(zhǎng)度0.4 cm，下端橫徑長(zhǎng)度0.3 cm，高度0.6 cm，支架厚度0.2 cm；大號(hào)3-DG IUD上端橫徑長(zhǎng)度0.8 cm，下端橫徑長(zhǎng)度0.6 cm，高度1.2 cm，支架厚度0.4 cm。放置器材質(zhì)為不銹鋼，外套管直徑2.5mm，推桿直徑2.3mm[11]。

1.2 動(dòng)物

獼猴來(lái)自福建省非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。所有飼養(yǎng)程序均按照《福建省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)使用指南》進(jìn)行，并經(jīng)福建省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院動(dòng)物飼養(yǎng)使用委員會(huì)批準(zhǔn)。2016年12月，成年雌性獼猴20只分為3-DG IUD組(9只)、假手術(shù)組(9只)、對(duì)照組(不手術(shù)，2只)。動(dòng)物護(hù)理和使用的許可證號(hào)為SYXK(Min)2015-0007和SCXK(Min)2015-0002。所有獼猴均采用標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)的單籠。

1.3 外科手術(shù)

無(wú)菌條件下進(jìn)行。獼猴用硫酸阿托品(0.02 ml/kg肌內(nèi)注射)和鹽酸氯胺酮(0.1～0.2 ml/kg肌內(nèi)注射)鎮(zhèn)靜，腹部剃毛，置于仰臥位。下腹部區(qū)域用75%乙醇和碘酒消毒，并用消毒過(guò)的布巾覆蓋。然后進(jìn)行手術(shù)中線(xiàn)下腹部切口，暴露子宮。將放置器插入子宮，3-DG IUD組將3-DG IUD置入子宮腔，7只放置大號(hào)3-DG IUD， 2只放置小號(hào)3-DG IUD；假手術(shù)組僅將放置器插入子宮腔，未放置3-DG IUD。用可吸收縫線(xiàn)縫合子宮切口，接受預(yù)防性抗生素(頭孢唑啉，30 mg/kg)治療3d。

1.4 觀(guān)察期和超聲檢查

術(shù)后第10天，3-DG IUD組(n=9)和假手術(shù)組(n=9)18只雌性獼猴與可育雄性獼猴按1:1配對(duì)，觀(guān)察避孕效果。術(shù)后第3個(gè)月3-DG IUD 組中2只獼猴和對(duì)照組中的1只獼猴(1號(hào))行子宮切除術(shù)。術(shù)后12個(gè)月3-DG IUD組6只獼猴和對(duì)照組1只獼猴(2號(hào))接受子宮切除術(shù)。每個(gè)月對(duì)18只獼猴(3-DG IUD組9只，假手術(shù)組9只)進(jìn)行腹部超聲檢查(探頭頻率3.5 MHz，X300PE超聲檢查儀，德國(guó)西門(mén)子)，了解子宮、3-DG IUD和妊娠情況。

1.5 組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)

切除子宮用于組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢查。蘇木精和伊紅(HE)染色，對(duì)子宮內(nèi)膜進(jìn)行組織學(xué)檢查。免疫組化檢查：①石蠟包埋的組織切片；② 抗原修復(fù)；③單克隆抗 ER和抗 PR孵育，洗滌；④山羊抗小鼠/兔二抗和生物素化辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物(UltraSensitiveTMSP Mouse/Rabbit IHC Kit Maixin Bio) 孵育。對(duì)于 PAX2，樣本在65℃下干燥1 h，脫蠟、再水化和表位修復(fù)，染色觀(guān)察，蘇木精復(fù)染。樣本與 DAB孵育 5 min，蓋玻片覆蓋，顯微鏡觀(guān)察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

3-DG IUD組(n=9)和假手術(shù)組(n=9)獼猴體重和月齡分別為(6.4±1.0)kg和(129.6±1.6)個(gè)月和(6.5±0.8)kg、(130.8±8.4)個(gè)月，兩組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。另外2只雌性對(duì)照獼猴(未手術(shù))的體重和月齡分別為5.9kg和127個(gè)月，以及6.9kg和132個(gè)月。

2.2 妊娠情況

3-DG IUD組僅術(shù)后3個(gè)月后發(fā)現(xiàn)1只獼猴(1/9)3-DG IUD丟失(小型)并妊娠。假手術(shù)組術(shù)后3個(gè)月和12個(gè)月分別有6只(6/9)和3只(3/9)獼猴妊娠，與3-DG IUD組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.844，P=0.05；χ2=14.400，P<0.001)。

2.3 組織學(xué)變化

術(shù)后3個(gè)月和12個(gè)月獼猴均未發(fā)生盆腔感染。子宮切除術(shù)后，切開(kāi)子宮可以看出，3-DG IUD 沒(méi)有粘附到周?chē)M織或嵌入子宮肌層(圖1A，2013頁(yè))。對(duì)照組獼猴(1號(hào))子宮內(nèi)膜是正常基質(zhì)中的直管狀腺體(圖1B，2013頁(yè))。3-DG IUD 植入3個(gè)月組織學(xué)檢查見(jiàn)子宮內(nèi)膜上皮完整(圖1C、D，2013頁(yè))；間質(zhì)細(xì)胞水腫、短梭形且致密；少數(shù)腺體彎曲并呈空泡狀；螺旋動(dòng)脈增生(圖1C，2013頁(yè))。3-DG IUD置入12個(gè)月，子宮內(nèi)膜上皮成份大部分完整，可見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，一些腺體分泌液泡；基底層及淺表肌層可見(jiàn)玻璃體變性；間質(zhì)螺旋小動(dòng)脈發(fā)育良好(圖1D，2013頁(yè))。

2.4 免疫組化染色分析

免疫組化染色分析顯示，對(duì)照組(2號(hào))和 3-DG IUD 組子宮內(nèi)膜腺體細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)ER、PR和PAX2表達(dá)狀態(tài)正常，未見(jiàn)表達(dá)缺失、增加和減少。見(jiàn)圖2(2013頁(yè))。

3 討論

本研究使用鎳鈦合金絲設(shè)計(jì)編制了獼猴用3-DG IUD，觀(guān)察了獼猴放置3-DG IUD的子宮變化。獼猴的子宮形狀像倒梨形和三角形，與人類(lèi)相似，只是大小不同(比人類(lèi)小)。因此，獼猴等非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物可能是宮內(nèi)節(jié)育器(IUD)實(shí)驗(yàn)的最佳動(dòng)物模型。不同尺寸的 3-DG IUD 專(zhuān)為獼猴設(shè)計(jì)。IUD與宮腔的尺寸兼容性非常重要。本研究術(shù)后 3 個(gè)月時(shí)，1只(1/9)獼猴排出了小型3-DG IUD。術(shù)后12個(gè)月后6只(6/6)獼猴3-DG IUD仍在子宮內(nèi)且未受孕。因此，IUD的尺寸太小，容易脫落，導(dǎo)致避孕失敗。

本研究中，獼猴放置3-DG IUD后，組織學(xué)檢查見(jiàn)子宮內(nèi)膜僅有螺旋動(dòng)脈增生，少量腺體空泡，少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。這些可能只是由3-DG IUD對(duì)子宮內(nèi)膜的局部壓迫引起。據(jù)報(bào)道，慢性子宮內(nèi)膜炎癥的組織學(xué)特征在獼猴子宮中放置裸銅線(xiàn)避孕后也有發(fā)生[12]。慢性和非特異性子宮內(nèi)膜炎癥是 Cu-IUD 的避孕效果之一。

在本研究中，3-DG IUD 組術(shù)后 12 個(gè)月子宮內(nèi)膜 ER、PR 和 PAX2 的 表達(dá)與對(duì)照組相似。PR和ER的表達(dá)在3-DG IUD組中沒(méi)有上調(diào)或下調(diào)。據(jù)報(bào)道，LNG-IUS可以降低子宮內(nèi)膜中ER和PR的表達(dá)，抑制子宮內(nèi)膜增殖[13]。IUD 局部釋放的LNG對(duì)ER和PR有抑制作用，這可能有助于此類(lèi) IUD 的避孕效果，也可能是LNG-IUS引起的不規(guī)則出血和閉經(jīng)的原因[14]。

在本研究中，置入3-DG IUD后PAX2表達(dá)正常，無(wú)降低、缺失或過(guò)表達(dá)。PAX2 是類(lèi)固醇激素受體信號(hào)通路的下游基因。它在子宮內(nèi)膜癌和良性子宮內(nèi)膜增生中過(guò)度表達(dá)[15]。

綜上所述，在本研究中，獼猴放置3-DG IUD12個(gè)月的避孕效果較好。3-DG IUD置入后，子宮內(nèi)膜上皮ER、PR和PAX2的表達(dá)無(wú)明顯變化，僅少數(shù)中性粒細(xì)胞在3-DG IUD周?chē)?rùn)。因此，獼猴放置3-DG IUD是安全有效的。