羅漢果黃素及其主要代謝物抗糖基化活性研究

◎ 陳 楊，童優(yōu)蕓，李夢月，高藝笑，項(xiàng)穎芳，劉合生

（1.浙江萬里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100；2.諾安檢測服務(wù)有限公司，浙江 寧波 315000）

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平的迅速提高及生活方式的改變，高糖、高脂肪的飲食結(jié)構(gòu)及缺乏運(yùn)動(dòng)的生活方式使得糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病率、死亡率及醫(yī)療成本呈現(xiàn)快速上升趨勢[1]。目前商品化的抗糖尿病藥物根據(jù)其作用機(jī)制不同可以分為多種類型，如α-葡萄糖苷酶抑制劑、胰島素增敏劑、二肽基肽酶抑制劑以及糖基化抑制劑等[2]。其中糖基化抑制劑可顯著減輕糖尿病癥狀、延緩糖尿病進(jìn)程及降低糖尿病并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)[3]。但是長期服用這類藥物容易引發(fā)多種毒副作用，如胃腸道紊亂、肝臟疾病、流感樣癥狀、罕見血管炎以及腎臟腫瘤等[4]，因此天然來源、特別是膳食來源的AGEs抑制劑因其具有無或輕微毒副作用、來源廣泛、食用方便及相對廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注[5]。大量文獻(xiàn)報(bào)道了天然來源提取物或其活性成分具有強(qiáng)烈抗AGEs或抗糖基化作用[6]。羅漢果黃素是羅漢果（Siraitia grosvenorii）果實(shí)中的一種特征性黃酮類化合物，其主要代謝物有山奈苷、α-rhamnoisorobin、阿福豆苷和山奈酚，均具有明顯的抗氧化活性，且代謝物活性比原形物的更高[7]。而抗氧化與抗糖基化作用顯著相關(guān)，因此羅漢果黃素是否具有顯著的抗糖基化活性有待驗(yàn)證。經(jīng)胃腸道消化、轉(zhuǎn)化后，羅漢果黃素代謝產(chǎn)物是否也具有抗糖基化作用，以及代謝前后抗糖基化活性是否變化，目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本項(xiàng)目擬利用牛血清白蛋白-果糖-葡萄糖（BSA-Fru-Glu）體外糖基化體系，探討羅漢果黃素及3種胃腸道主要代謝物山奈苷、阿福豆苷和山奈酚對AGEs抑制活性，以期為羅漢果抗糖尿病功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅漢果黃素、阿福豆苷、山奈苷和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品購于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購于北京索萊寶科技有限公司；5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、葡萄糖以及果糖購于阿拉丁試劑有限公司；鹽酸氨基胍（AG）、硫黃素T來源于Sigma公司；果糖胺試劑盒購買于南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

F-380熒光分光光度計(jì)，天津港東科技股份有限公司；Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 體外糖基化體系

參照文獻(xiàn)[8]方法，略微修改。含10 mg·mL-1BSA的0.1 mol·L-1pH=7.4的磷酸鈉緩沖液（PBS），加入終濃度0.2 mol·L-1的果糖和0.2 mol·L-1的葡萄糖，再加入一定量溶解于10%二甲亞砜（DMSO）水溶液的羅漢果黃素、山奈苷、阿福豆苷、山奈酚和AG儲備溶液，使其終濃度分別為0.1 mmol L-1和1 mmol·L-1的羅漢果黃素、山奈苷、阿福豆苷和山奈酚的抑制劑組及陽性對照組，以含10 mg·L-1BSA、0.2 mol·L-1葡萄糖、0.2 mol·L-1果糖，不含抑制劑或陽性對照的 0.1 mol·L-1pH=7.4的PBS為模型組，以含10 mg·mL-1組，BSA的0.1 mol·L-1pH=7.4的PBS為 空 白 對 照組，同時(shí)做本底組（含相同濃度DMSO的抑制劑+PBS），所有組均加入終濃度為0.02%的疊氮化鈉，以抑制微生物生長。每個(gè)組設(shè)置3個(gè)平行，37 ℃恒溫水浴鍋中避光孵育4周，每周取樣測定下列指標(biāo)。

1.3.2 晚期糖基化產(chǎn)物（AGEs）的檢測

參照文獻(xiàn)[8]方法并略做修改。移取150 μL糖基化樣品，置于黑色96孔板中，酶標(biāo)儀于激發(fā)波長 350 nm，發(fā)射波長450 nm測定熒光強(qiáng)度。按下式計(jì)算抑制率：

式（1）中：F0為模型組（BSA-Fru-Glu）熒光強(qiáng)度；F1為抑制劑組熒光強(qiáng)度；F2為本底組熒光強(qiáng)度。

1.3.3 果糖胺含量測定

參照文獻(xiàn)[8]描述方法，略做修改。準(zhǔn)確移取100 μL糖化樣品置于96孔板中，加入0.25 mmol·L-1氮藍(lán)四唑溶液（溶于0.1 mol·L-1pH=10.35的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液）100 μL，37 ℃孵育30 min，于530 nm處測定吸光度，按下式計(jì)算果糖胺含量：

式（2）中：A為530 nm測定的吸光度；L為光程（cm）；ε為摩爾消光系數(shù)，為12640 L·mol-1·cm-1；V1為測量體系總體積（mL）；10-3為mL與L的換算系數(shù)；109為mol與nmol的換算系數(shù)；c為BSA濃度（mg·mL-1）；V2為取樣體積（mL）；結(jié)果表示為nmol果糖胺/mg蛋白質(zhì)。

1.3.4 蛋白羰基含量測定

參照報(bào)道[8]的方法，稍做修改。準(zhǔn)確移取糖化BSA溶液100 μL，加入10 mmol·L-12,4-二硝基苯肼溶液（溶于2.5 mol·L-1鹽酸）400 μL，充分混合，黑暗中孵育1 h后，加入0.5 mL的20%（m/v）的三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)，立即于冰上放置5 min，4 ℃，10000×g離心10 min，棄上清，沉淀用0.5 mL乙醇/乙酸乙酯（1∶1，v/v）混合液洗滌3次后，加入 6 mol·L-1的鹽酸胍溶液0.25 mL，反復(fù)渦旋至溶解，準(zhǔn)確移取200 μL旋至至96孔板，酶標(biāo)儀于370 nm處測定吸光度，樣品羰基含量按下式計(jì)算：

式（3）中：A為370 nm測定的吸光度；L為光程（cm），即96孔板液面高度；ε為2,4-二硝基苯肼的摩爾消光系數(shù)，為22000 L·mol-1·cm-1；V1為測定吸光度時(shí)樣液總體積，mL；10-3為mL與L的轉(zhuǎn)換系數(shù)；109為mol與nmol的轉(zhuǎn)換系數(shù)；c為BSA濃度，本試驗(yàn)c=10 mg·mL-1；V2為取樣體積，mL；結(jié)果表示為nmol羰基/mg蛋白質(zhì)。

1.3.5 巰基含量測定

參照文獻(xiàn)[8]方法，稍有修改。準(zhǔn)確移取70 μL糖 化BSA溶液于96孔酶標(biāo)板，加入130 μL的5 mmol·L-1DTNB溶 液（溶 于0.1 mol·L-1pH=7.4的PBS）， 25 ℃孵育15 min，酶標(biāo)儀于412 nm處測定吸光度，按照同樣方法，以L-半胱氨酸（100-350 μmol·L-1）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以不加樣品的DTNB溶液調(diào)零，按照下式計(jì)算巰基含量：

式（4）中：c1為L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算的濃度（μmol·L-1）；V1為取樣體積，μL；10-6為μL與L的轉(zhuǎn)換系數(shù)；c2為BSA濃度（mg·mL-1）；10-3為μL與mL的轉(zhuǎn)換系數(shù)；結(jié)果表示為μmol巰基/mg蛋白質(zhì)。

1.3.6 類淀粉蛋白β交聯(lián)結(jié)構(gòu)的測定

參照文獻(xiàn)[8]方法，略做修改。10 μL糖化BSA樣品置于黑色96孔板中，加入64 μmol·L-1硫磺素T溶液（溶于0.1 mol·L-1pH=7.4的PBS）100 μL，25 ℃孵育60 min，采用酶標(biāo)儀于激發(fā)波長435 nm，發(fā)射波長485 nm測定熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅漢果黃素與其主要代謝產(chǎn)物的抗糖基化效果

本研究首先比較了羅漢果黃素與其主要代謝物山奈苷、阿福豆苷和山奈酚在低濃度（0.1 mmol·L-1）和高濃度（1 mmol·L-1）下孵育4周對BSA-Fru-Glu體外 孵育體系熒光AGEs的影響。如圖1所示，0.1 mmol·L-1處理4周，羅漢果黃素?zé)o明顯AGEs抑制作用 （P＞0.05），而山奈苷、阿福豆苷和山奈酚均顯示出較低的抑制作用，抑制率分別為6.2%、8.6%和9.6%。當(dāng)1.0 mmol·L-1處理4周時(shí)，羅漢果黃素處理組的熒光強(qiáng)度無明顯變化（P＞0.05），而阿福豆苷、山奈苷和山奈酚處理組的熒光AGEs顯著減低（P＜0.05），呈現(xiàn)劑量依賴性，山奈酚的抑制作用最強(qiáng)，抑制率達(dá)62.6%，顯著高于羅漢果黃素和另外2種代謝物 （P＜0.05），為此后續(xù)試驗(yàn)以山奈酚為研究對象。

圖1 羅漢果黃素及其主要代謝產(chǎn)物山奈苷、 阿福豆苷和山奈酚對糖基化的抑制作用圖

2.2 山奈酚體外抗糖基化活性

2.2.1 山奈酚對果糖胺形成的影響

圖2表明，低劑量（0.1 mmol·L-1）山奈酚對果糖胺形成無明顯抑制作用（P＞0.05），而高劑量 （1 mmol·L-1）盡管在第1和第4周對果糖胺含量無顯著抑制作用（P＞0.05），但第2、3周對其具有顯著抑制作用（P＜0.05），抑制效果與陽性對照（氨基胍，AG）相當(dāng)，且該抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。與Fru-Glu-BSA組比較，1 mmol·L-1山奈酚或AG孵育 3周，果糖胺含量分別降低了27.7%和33.1%。

圖2 山奈酚對體外糖基化體系果糖胺形成的影響圖

2.2.2 山奈酚對蛋白質(zhì)氧化的影響

圖3a表明低濃度（0.1 mmol·L-1）山奈酚處理 4周對糖基化體系羰基水平無明顯影響（P＞0.05），但高濃度（1 mmol·L-1）山奈酚在前期的抑制效果優(yōu)于后期；類似地，0.1 mmol·L-1山奈酚在整個(gè)試驗(yàn)周期對體系的巰基水平無明顯影響（P＞0.05），但是與模型組比較，1 mmol·L-1山奈酚在前3周提升了巰基水平，但第4周與模型組無明顯差異（P＞0.05）。 與BSA-Fru-Glu組比較，1 mmol·L-1山奈酚孵育3周，羰基水平降低了19.4%，巰基水平上升了16.7%，提示山奈酚對糖基化誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)氧化有抑制 作用。

圖3 山奈酚對體外糖基化體系蛋白質(zhì)氧化的影響圖

2.2.3 山奈酚對糖基化誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)交聯(lián)的影響

蛋白質(zhì)糖基化形成的活性二羰基化合物加速蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，使其功能受損和缺失。圖4表明高濃度（1 mmol·L-1）山奈酚作用4周，明顯抑制β淀粉樣蛋白交聯(lián)結(jié)構(gòu)的形成（P＜0.05），與模型組比較，降低了49.2%；而低劑量（0.1 mmol·L-1）在糖基化初期，對β淀粉樣蛋白交聯(lián)結(jié)構(gòu)形成具有較弱的抑制作用，而后期表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用，這可能與山奈酚在低濃度有促氧化作用，而高濃度有抗氧化作用有關(guān)。

圖4 山奈酚對體外糖基化體系β淀粉樣蛋白交聯(lián)結(jié)構(gòu) 形成的影響圖

3 結(jié)論

羅漢果黃素在體外無明顯抗糖基化作用，但經(jīng)胃腸道消化酶及腸道菌群作用后，形成的主要代謝產(chǎn)物山奈苷、阿福豆苷和山奈酚具有明顯的體外抗糖基化活性，其活性次序?yàn)樯侥诬眨及⒏６管眨忌侥畏?，表明糖配基?shù)量與羅漢果黃素主要代謝物的抗糖基化活性負(fù)相關(guān)。