液相色譜-柱后衍生-原子熒光聯(lián)用測(cè)定 食品中硒形態(tài)

◎ 謝佩文

（廣東亨盛維嘉食品工業(yè)有限公司，廣東 潮州 515726）

硒作為動(dòng)物與人類必需微量元素，是合成硒蛋白，包含硫氧蛋白還原酶、谷胱甘肽過(guò)氧化酶、碘甲狀腺素脫碘酶的關(guān)鍵組成部分，對(duì)于甲狀腺激素代謝、繁殖、免疫力與抗氧化具有良好生物學(xué)功能。人體如果缺少硒元素，會(huì)降低人體免疫力，增加患癌癥與死亡風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦，成人攝硒量每天為50～250 μg，不能超過(guò)400 μg，攝入800 μg會(huì)出現(xiàn)人體中毒癥狀。硒元素多用于食品功能成分，特別是人們生活水平得到提高后，對(duì)硒產(chǎn)品的需求量也逐漸增加，但硒元素過(guò)量攝入會(huì)對(duì)人體造成危害，健康硒食品發(fā)展中，也需明確硒是把“雙刃劍”[1]。本文采取液相色譜-柱后衍生-原子熒光聯(lián)用方式，分析食品硒形態(tài)，推動(dòng)硒產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)規(guī)范發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 儀器與設(shè)備

液相色譜-原子熒光聯(lián)用儀AS-53（廣西路博環(huán)保科技有限公司）；純水機(jī)Direct-Pure（北京中程瑞源科技有限公司）；分析天平LE204E/02（上海贊維衡器有限公司）；超聲水?。?jì)南歐萊博電子商務(wù)有限公司）；抽濾設(shè)備（青島精誠(chéng)儀器儀表有限公司）；超聲波清洗器KH3200B（青島明博環(huán)?？萍加邢薰荆?/p>

1.1.2 材料與試劑

硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)品：甲基硒代半胱氨酸（96%純度）；硒代胱氨酸（98%純度）；亞硒酸鈉（99%純度）；硒代蛋氨酸（99%純度），用超純水配制上述標(biāo)準(zhǔn)品為1 mg·L-1濃度溶液，放置于4 ℃下進(jìn)行保存，配制溶液及處理樣品均使用超純水；硼氫化鈉、碘化鉀、氫氧化鈉、檸檬酸以及磷酸氫二胺，均為分析純（上海宏瑞化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

（1）碘化鉀堿溶液。氫氧化鈉稱取2.90 g倒入燒杯，以少量水溶解添加1 g碘化鉀，加水超聲溶解，稀釋定容至1000 mL。

（2）硼氫化鈉還原劑。鹽酸稱取100 mL，以水稀釋定容至1000 mL。

（3）超純水溶液。稱取超純水1 L后，超聲脫氣待用，根據(jù)實(shí)際以磷酸、氨水進(jìn)行調(diào)節(jié)pH=8.0。

1.2.2 儀器色譜條件

（1）色譜條件。使用Hamilton 10 μm陰離子色譜柱，利用磷酸氫二胺、硼氫化鈉流動(dòng)相分離硒形態(tài)。

（2）儀器條件。80 mA燈電流；270 V負(fù)高壓；500 L·min-1載氣流量；7 mm原子化器高度；1000 L·min-1屏蔽氣流量；2根15 W紫外燈；60 r·min-1泵速A； 70 r·min-1泵速B；300 ℃原子化器溫度。

1.2.3 樣品預(yù)處理

稱取1.00 g樣品放置在25 mL錐形瓶?jī)?nèi)，添加鏈霉蛋白酶E 10 mg溶于水，放入離心管內(nèi)均勻混合，設(shè)置溫度37 ℃完成超聲提取，以60 r·min-1離心 30 min，取上清液通過(guò)有機(jī)膜過(guò)濾[2]。

1.2.4 方法條件

進(jìn)樣量滿杯100 μL，開(kāi)啟紫外小結(jié)，流動(dòng)相A為超純水；流動(dòng)相B為磷酸氫二胺溶液170 mol·L-1、 160 mol·L-1、150 mol·L-1，利用磷酸調(diào)節(jié)pH=6.3；流動(dòng)相C為檸檬酸。衍生劑為300 mL·h-1碘化鉀堿溶液；500 mL·h-1鹽酸載流溶液；300 mL·h-1空氣；300 mL·h-1硼氫化鈉還原劑[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化儀器條件

2.1.1 選擇流動(dòng)相

流動(dòng)相選擇對(duì)分離目標(biāo)化合物十分重要，硒形態(tài)分析流動(dòng)相常見(jiàn)有醋酸鹽、檸檬酸、Tris緩沖液及磷酸鹽等，添加甲醇有花粉粒效果，綜合分析硒化合物性質(zhì)，采取陰離子色譜交換柱，探究檸檬酸與磷酸氫二胺為流動(dòng)相的分離硒形態(tài)，發(fā)現(xiàn)以檸檬酸為流動(dòng)相，降低了硒代蛋氨酸靈敏度，重復(fù)性差，甚至實(shí)驗(yàn)不會(huì)出峰，使用磷酸氫二胺溶液可避免上述缺陷，采取磷酸氫二胺成為流動(dòng)相，硒形態(tài)分離中20 min即可達(dá)到基線。

2.1.2 選擇流動(dòng)相濃度

流動(dòng)相濃度分析中，分析磷酸氫二胺170 mmol·L-1、160 mmol·L-1、150 mmol·L-1，pH=6.3的溶液分離硒形態(tài)效果，發(fā)現(xiàn)溶液濃度是150 mmol·L-1時(shí)，靈敏度較低，出峰時(shí)間是27 min，時(shí)間較長(zhǎng)；濃度是170 mmol·L-1時(shí)，顯示亞硒酸跟與甲基硒代胱氨酸峰值無(wú)法達(dá)到分離基線；濃度160 mmol·L-1時(shí)，分離硒形態(tài)效果更好，以此作為流動(dòng)相濃度。

2.1.3 流動(dòng)相pH值

考察流動(dòng)相不同pH值對(duì)硒形態(tài)分離影響。流動(dòng)相pH≤6.0時(shí)，未能檢測(cè)亞硒酸鈉響應(yīng)值，逐步增加流動(dòng)相pH值，pH=6.3可實(shí)現(xiàn)硒形態(tài)分離，縮短時(shí)間至24 min；將流動(dòng)相pH值繼續(xù)提高至pH=6.8時(shí)，分離硒代蛋氨酸、甲基硒代半胱氨酸程度降低。所以，選擇最佳流動(dòng)相pH=6.3，且流動(dòng)相pH=6.3時(shí)，4種硒形態(tài)均可分離，且甲基硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸、亞硒酸鈉以及硒代蛋氨酸的保留時(shí)間分別是 15.771 min、14.434 min、10.317 min以及5.381 min。

2.2 線性關(guān)系及檢出限

稱取硒代半胱氨酸0.0202 g，硒代胱氨酸0.0242 g、 亞硒酸鈉0.0234 g以及硒代蛋氨酸0.0226 g定容為100 mL，配制10～200 μg·L-1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù) 1.2方法操作測(cè)定，以硒化合物濃度為縱坐標(biāo)，橫坐標(biāo)為對(duì)應(yīng)峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得方法線性關(guān)系及檢出限，結(jié)果如表1所示。

表1 4種硒形態(tài)線性關(guān)系與檢出限化合物表

結(jié)果表明方法在硒化合物濃度為10～200 μg·L-1時(shí)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，檢出限處于2.16～3.78 μg?L-1。4種 硒 化 合 物 色 譜 圖 如 圖1 所示。

圖1 硒形態(tài)色譜圖

2.3 精密度

精密度測(cè)試中，以配制的標(biāo)準(zhǔn)濃度試劑進(jìn)行平行試驗(yàn)，可獲得精密度。由試驗(yàn)結(jié)果可知，甲基硒代半胱氨酸的精密度是3.6%，硒代胱氨酸精密度是2.8%，亞硒酸鈉精密度是3.2%，硒代蛋氨酸精密度是4.3%，均低于5%，滿足試驗(yàn)需求。

2.4 加標(biāo)回收率

選擇富硒大米不同硒含量作為試驗(yàn)樣品，測(cè)定總硒含量是1.25 mg·kg-1，測(cè)試樣品不同形態(tài)下硒本底值，完成加標(biāo)回收試驗(yàn)，對(duì)3個(gè)濃度加標(biāo)回收，不同濃度進(jìn)行6個(gè)平行試驗(yàn)，結(jié)果表明硒形態(tài)加標(biāo)回收率為86.3%～104.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于5.0%， 見(jiàn)表2。

表2 加標(biāo)回收率表（n=6）

2.5 樣品測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)中采取液相色譜-柱后衍生-原子熒光聯(lián)用方式測(cè)定富硒大米的有機(jī)硒形態(tài)，根據(jù)結(jié)果可知，富硒大米內(nèi)僅檢出有硒代蛋氨酸。

3 結(jié)論

硒作為典型雙功能元素，是人體必需微量元素的同時(shí)，也存在毒性。硒具有抗氧化、抗癌、增強(qiáng)人體免疫力等作用，可對(duì)維生素利用與吸收進(jìn)行調(diào)節(jié)，且參與調(diào)節(jié)合成蛋白質(zhì)。人體如果長(zhǎng)期缺硒會(huì)引發(fā)大骨節(jié)病、心腦血管疾病、糖尿病與克山病等[4]。而攝入硒過(guò)量超出安全閾值，也會(huì)損害人體，引發(fā)慢性或急性硒中毒，因此合理、科學(xué)攝入硒元素具有重要的作用。硒化合物形態(tài)多樣，且硒不同形態(tài)生物效應(yīng)、功能、毒性存在差異，不能僅測(cè)定硒總含量，還需分析食品硒形態(tài)[5]。食品不同，性質(zhì)也不同，硒蛋白形態(tài)與種類較為復(fù)雜，為迅速測(cè)定硒形態(tài)，本文結(jié)合硒的化學(xué)和物理性質(zhì)，通過(guò)使用液相色譜-柱后衍生-原子熒光聯(lián)用的方式測(cè)定硒形態(tài)，對(duì)食品硒形態(tài)進(jìn)行定量定性分析，精確度較高，可滿足測(cè)定要求。