葛仙米藻藍(lán)素鐵氧還蛋白還原酶基因Ns-Pcy A的克隆、表達(dá)及其分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

汪海洋,朱格格,盧 嬋,程 超,2,李 偉,方 慶,2

(1.湖北民族大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,湖北恩施 445000;2.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點實驗室,湖北恩施 445000)

原核藻類(prokaryotic algae),兼有細(xì)菌和高等植物部分重要特性,如較快速的細(xì)胞分裂繁殖與光合作用產(chǎn)能等,在生物進(jìn)化中地位特殊。其光合作用的主要細(xì)胞器是藻膽體(phycobilisome)。藍(lán)藻(blue green algae),即藍(lán)細(xì)菌,依靠藻膽體捕獲并傳遞光能,被認(rèn)為是某些藻類和高等植物葉綠體的祖細(xì)胞[1-3]。構(gòu)成上,藻膽體為多亞基蛋白與有色輔基等有序結(jié)合的超大分子復(fù)合物[4-5]。藻膽蛋白(phycobiliprotein)多由α/β兩類重要的亞基組成,而藻膽素(phycobilibins)即色基部分為開鏈四吡咯化合物。近年來,對藻膽體的作用機(jī)制及其體外有益活性研究較廣[4,6-9]。

目前,針對資源性藻藍(lán)蛋白研究[8,10-11]為該類型有機(jī)復(fù)合物或其單組分等深入開發(fā)運用提供了基礎(chǔ)。藻膽素包含多種類型,通常以共價硫醚鍵與藻膽蛋白中的多肽鏈結(jié)合,吸收和傳遞光能。一般認(rèn)為,藻膽蛋白只有結(jié)合色基后才具有光能捕獲與能量轉(zhuǎn)換的活性。試驗表明藻膽蛋白的純度愈高,對自由基清除的能力愈強(qiáng)[8]。由此可見,藻膽素對藻膽蛋白的體外活性具有促進(jìn)作用。而且藍(lán)藻含有4種藻膽素,互為同分異構(gòu)體,在光能捕獲和轉(zhuǎn)化中的作用因自身結(jié)構(gòu)而不同。這表明細(xì)胞內(nèi)藻膽素的酶促合成存在差異。早期研究發(fā)現(xiàn),藻藍(lán)膽素(phycocyanobilin,PCB)是以血紅素IX為前體,經(jīng)藻藍(lán)素鐵氧還蛋白還原酶(Pcy A)的催化作用而形成[6]。

葛仙米(Nostoc sphaeroidesKützing),也被稱為天仙米,學(xué)名擬球狀念珠藻,屬藍(lán)藻門念珠藻目,是中國重要的食藥兩用的藍(lán)藻之一[12]。研究顯示,葛仙米富含人體必需的多種氨基酸及多糖等活性物質(zhì),具較重要的藥源功效等[10]?，F(xiàn)今中國居民對健康的需求已進(jìn)入新時期,深入研究與開發(fā)葛仙米資源具有重要意義[12-13]。本研究克隆葛仙米藻藍(lán)素鐵氧還蛋白還原酶關(guān)鍵基因Ns-Pcy A,在原核細(xì)胞中表達(dá)并探究其蛋白高級結(jié)構(gòu),為進(jìn)一步深入了解和開發(fā)葛仙米藻藍(lán)膽素的細(xì)胞內(nèi)合成作用奠定試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試劑

葛仙米鮮樣采自湖北恩施鶴峰。分子克隆用基本工具酶,載體等購于大連寶生物等公司(TaKaRa);引物由金斯瑞公司合成。

1.2 DNA的提取

葛仙米總DNA提取參考前述方法[14]。具體步驟包括:鮮樣經(jīng)無菌水沖洗4～5次,接種于固體培養(yǎng)基上,經(jīng)3～4次反復(fù)繼代消除其他雜菌,待成體細(xì)胞直徑長至約2.5 mm后,進(jìn)行總DNA抽提。取0.1 mg鮮樣與800μL CTAB抽提液混勻,迅速研磨后65℃水浴30 min;離心5 min上清液置于新的離心管中,經(jīng)氯仿-異戊醇(24∶1)處理后取上清液異丙醇沉淀,75%的乙醇洗滌后晾干,含RNA酶的dd H2O溶解,于-20℃冰箱保存,備用。

1.3 PCR反應(yīng)

PCR反應(yīng)體系為:模板DNA 1μL,Go Tap G2 Green Master Mix 5μL,引物混合物1μL,補(bǔ)加dd H2O至10μL;反應(yīng)程序為95℃3 min,95℃30 s,50℃30 s,72℃45 s,72℃5 min,16℃10 min,擴(kuò)增循環(huán)數(shù)設(shè)為30。據(jù)Pcy A基因(O.lucimarinusCCE9901)同源序列分析葛仙米對應(yīng)基因組(Locus,NZ_CP031941)中的目的基因序列,設(shè)計Ns-Pcy A基因的引物為:上游Ns-phyA-F-Nde1:GGCATATGTCATTTACTTCTATAC;下游Ns-phy A-R-EcoR1:GAATT CTTATTTTAATGTTGGGAG。

1.4 克隆目的基因DNA

目的DNA與p MD18-T連接,采用42℃熱激轉(zhuǎn)化法將重組載體導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞。在含抗生素(Amp,100μg/m L)的固體LB培養(yǎng)基上篩選單菌落,挑取單菌落37℃培養(yǎng)14 h后進(jìn)行質(zhì)粒提取并測序。

1.5 表達(dá)載體構(gòu)建

采用限制性內(nèi)切酶EcoR I和NdeI分別對克隆目的基因的質(zhì)粒DNA和p Cold I載體進(jìn)行消化,然后回收基因片段和線性化的載體,進(jìn)行T4 DNA ligase連接反應(yīng)。連接體系轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞DH5α。再經(jīng)質(zhì)粒提取和測序鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒。目的基因測序由上海生工公司完成。

1.6 序列與蛋白結(jié)構(gòu)分析

對目的基因Pcy A編碼蛋白氨基酸序列,針對Nostoc種屬基因序列,NCBI(National Center for Biotechnology Information)在線比對BLAST和Clustalw(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)分析;采用MEGA構(gòu)建基于Neighbor-Joining方法的系統(tǒng)進(jìn)化樹;葛仙米Ns-Pcy A基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)分析采用Swiss-model(https://www.swissmodel.expasy.org/)基于序列相似性的分子模擬。

1.7 目的蛋白的表達(dá)

將測序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入表達(dá)菌株BL21細(xì)胞中,進(jìn)行0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4～12 h,超聲破碎細(xì)胞(破碎功率為66 W,時間4～10 s,重復(fù)3次,間隔10 s),制備表達(dá)樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葛仙米Ns-Pcy A基因克隆

以CTAB法提取葛仙米總DNA為模板進(jìn)行特異引物的PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳(圖1-A)。結(jié)果顯示,參照DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(D1),目的基因泳道(K1)擴(kuò)增得到1條長近800 bp的特異產(chǎn)物,與目的基因大小相符。

回收目的DNA,與載體p MD18-T連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌并挑取單菌落培養(yǎng),提取質(zhì)粒進(jìn)行Nde1/EcoR1雙酶切。瓊脂糖凝膠電泳顯示兩個正確克隆質(zhì)粒(p1,p2)相較對照DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(M1),均能夠切出2條DNA帶型,其中較小的近800 bp,p1與p2很可能為正確克隆(圖1-B)。測序分析顯示,擴(kuò)增克隆DNA產(chǎn)物與GenBank中一段目的基因DNA(CP031941.1,區(qū)段為4 451 478～4 452 221)完全相同,全長744 bp,包含起始密碼和終止密碼(TAA)。其預(yù)編碼藻藍(lán)素鐵氧還蛋白還原酶基因(phycocyanobilin:ferredoxin oxidoreductase)。以上結(jié)果表明葛仙米Ns-Pcy A克隆成功。

2.2 Pcy A基因編碼蛋白與分子進(jìn)化

Ns-Pcy A預(yù)編碼一含247個氨基酸的多肽鏈(Genbank,WP_118167897.1)。同源序列比對分析,發(fā)現(xiàn)該Ns-Pcy A與其他幾個同源蛋白氨基酸序列總相似性達(dá)95.66%,并為典型的富含半胱氨酸(7個Cysteine)蛋白(圖2“#”標(biāo)示);相較點型念珠藻(Nostoc punctiforme)的藻藍(lán)素鐵氧還蛋白還原酶,Ns-Pcy A氨基酸序列中存在8個較為顯著的位點替換,包括N41D,Q121E,T131N and V196A等(黑色三角標(biāo)示)(圖2)。分子進(jìn)化樹顯示,葛仙米Ns-Pcy A很可能源于點型念珠藻,而在發(fā)狀念珠藻(Nostoc flagelliforme)和普通念珠藻(Nostoc commune)同源蛋白中形成明顯分支(圖3)。這預(yù)示藻藍(lán)素鐵氧還蛋白還原酶生物學(xué)功能在不同念珠藻中可能存在變異。

2.3 目的蛋白表達(dá)

為進(jìn)一步研究葛仙米藻藍(lán)素鐵氧還蛋白還原酶,將目的基因Ns-Pcy A連接進(jìn)入表達(dá)載體pCold I。提取連接轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,6個質(zhì)粒(#1～#6)中第#4比對照#1略大,很可能為正確重組質(zhì)粒。測序鑒定顯示,#4質(zhì)粒目的基因序列處于載體pCold I上冷休克基因(csp A)啟動子下游,重組表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖4-A)。

目的基因Ns-Pcy A預(yù)編碼蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大小為28.24 ku。將表達(dá)載體#4質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21細(xì)胞經(jīng)0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo),分離上清和沉淀蛋白。12%SDS-PAGE電泳如圖4-B顯示,目的蛋白相較標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker(Pm泳道),在29.0 ku附近有明顯積累(P4泳道),而對照(P1與P2泳道,未誘導(dǎo)大腸桿菌細(xì)胞樣品上清和沉淀裂解樣品)中沒有出現(xiàn)相應(yīng)大小的蛋白條帶。目的蛋白在沉淀中較大量積累(P4泳道,箭頭標(biāo)示),上清中存量較少(P3泳道),表明目的基因在大腸桿菌中能夠順利表達(dá)。

2.4 藻藍(lán)素鐵氧還蛋白還原酶Ns-Pcy A分子構(gòu)型

蛋白肽鏈的分子內(nèi)折疊是形成其高級結(jié)構(gòu)進(jìn)而發(fā)揮功能的基礎(chǔ)。高級結(jié)構(gòu)模擬顯示,目的基因編碼蛋白Ns-Pcy A單分子主要包含α螺旋和β折疊等兩類主要的二級結(jié)構(gòu)。α螺旋和β折疊進(jìn)一步形成類似三面夾心的高級結(jié)構(gòu),其中5個α螺旋分布于外側(cè);而8個β折疊處于螺旋形成的封閉空間中(圖5-B),形成疏水內(nèi)核。Ns-Pcy A為富含半胱氨酸蛋白,其肽鏈中有4個半胱氨酸(從N端起第2至第5個半胱氨酸)分別分布于β折疊片層中(圖5-A)。膽綠素IV在藻藍(lán)素鐵氧還蛋白還原酶(Pcy A)作用下,還原D環(huán)與A環(huán)上的乙烯基團(tuán),從而形成藻藍(lán)膽素PCB.Ns-Pcy A這種夾式構(gòu)型有利于底物和產(chǎn)物的及時錨定或釋放。

3 討論

葛仙米(Nostoc sphaeroidesKützing)是中國重要的食藥同源性原核藻類,在服務(wù)地域經(jīng)濟(jì)和社會發(fā)展方面其生物資源潛能亟待深入發(fā)掘[12-13]。作為輔基色素,藻藍(lán)膽素是一類線性四吡咯結(jié)構(gòu)的化合物,在藻類細(xì)胞中具有捕獲和傳遞光能的功能[6,14-15]。這些同分異構(gòu)體,因雙鍵位置不同,引致吸收光譜不同并在特定的條件下呈現(xiàn)不同的顏色。同分異構(gòu)體存在,也表明此類色基合成的關(guān)鍵酶可能不同。藻藍(lán)膽素在細(xì)胞內(nèi)合成的途徑已經(jīng)明確:血紅素IX經(jīng)氧化作用形成膽綠素IV,后者在藻藍(lán)素鐵氧還蛋白還原酶(Pcy A)作用下形成藻藍(lán)膽素PCB[16-17]。藻藍(lán)蛋白具有抗氧化、抗炎癥、抑腫瘤與強(qiáng)免疫等重要活性[10,18-19]。本研究成功克隆葛仙米藻藍(lán)素鐵氧還蛋白還原酶基因Ns-Pcy A,為進(jìn)一步研究和開發(fā)葛仙米藻藍(lán)素等的生物資源奠定了重要基礎(chǔ)。

一般認(rèn)為,藻藍(lán)膽素對藻藍(lán)蛋白體外活性具有促進(jìn)作用。實際上,脫離多肽鏈的藻藍(lán)膽素清除自由基等活性已被證實。這為藻藍(lán)膽素和藻藍(lán)蛋白的深入開發(fā)提供了基礎(chǔ)[20-23]。生物體中,鐵氧還蛋白還原酶(Ferredoxin-NADP+Reductase,FNR)非共價鍵結(jié)合黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)輔基,并作為電子傳遞鏈中的重要組成部分,在眾多基礎(chǔ)代謝中發(fā)揮作用;其中,輔酶NADP+是FNR催化反應(yīng)的先決條件,分子偶極矩表面電荷的分布和數(shù)量保證了FNR與Fd定向關(guān)聯(lián),其中氫鍵、鹽橋、范德華力及疏水作用起到穩(wěn)定蛋白構(gòu)象和功能的作用[24-28]。依賴鐵氧還蛋白的膽色素還原酶氨基酸位點變異,或是其功能和進(jìn)化的重要證據(jù)。藍(lán)藻中Pcy A家族酶類功能或活性可能已經(jīng)發(fā)生改變[29-30]。分子進(jìn)化水平上,顯示Ns-Pcy A與幾個近源種內(nèi)的同源蛋白譜系關(guān)系較近,為念珠藻的進(jìn)化提供了分子證據(jù)[12]:即葛仙米可能是點型念珠藻的變異種,并以其為親本進(jìn)一步衍生出普通念珠藻和發(fā)狀念珠藻。

Ns-Pcy A在體外功能有待深入研究。Pcy A蛋白第一個高分辨率的晶體模型被發(fā)現(xiàn),為了解和發(fā)現(xiàn)其功能提供了基礎(chǔ)[30-31]。筆者借助分子模擬發(fā)現(xiàn),盡管存在部分氨基酸位點替換,但葛仙米Ns-Pcy A蛋白仍能夠形成一α/β/α夾心式結(jié)構(gòu),其夾心空間及反向平行的β折疊片層利于底物和產(chǎn)物的及時錨定或釋放。因此,筆者認(rèn)為這種夾心式結(jié)構(gòu)為其活性提供了重要支撐。并且,Ns-Pcy A為富含半胱氨酸蛋白,因此能夠借助低電位鐵硫基團(tuán)以加強(qiáng)對曝氧等的防御[32]。半胱氨酸可能對于Ns-Pcy A蛋白具有雙重意義:既能夠自我保護(hù)又能夠有利酶促底物反應(yīng)進(jìn)行。但是,Pcy A是否具備抑制某些超氧物氧化功能,需進(jìn)一步鑒別?？傊?克隆葛仙米Ns-Pcy A基因,為了解和運用葛仙米藻藍(lán)蛋白輔基色素關(guān)鍵合成酶功能及提供了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究克隆葛仙米藻藍(lán)素鐵氧還蛋白還原酶基因Ns-Pcy A,并在大腸桿菌中成功表達(dá)目的蛋白。序列和分子結(jié)構(gòu)模擬分析顯示,Ns-Pcy A為富含半胱氨酸蛋白,其氨基酸肽鏈主要包含α螺旋和β折疊等二級結(jié)構(gòu),并以其分別建構(gòu)蛋白親水外圍與疏水核心,從而形成三面夾心式高級構(gòu)型。研究結(jié)果為進(jìn)一步深入研究和開發(fā)葛仙米藻藍(lán)膽素細(xì)胞內(nèi)合成提供了重要基礎(chǔ)。