基于轉(zhuǎn)錄組測序分析牛不同脂肪組織的脂肪沉積差異研究

王思元,劉 迪,張偉紅,王國富,高樹新

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,內(nèi)蒙古通遼 028000;2.內(nèi)蒙古通遼市開魯縣獸醫(yī)局,內(nèi)蒙古通遼 028000)

脂肪組織是一個(gè)活躍的代謝器官,該組織對(duì)于脂質(zhì)積累、能量消耗、葡萄糖和胰島素代謝以及激素調(diào)節(jié)至關(guān)重要,對(duì)維持全身能量穩(wěn)態(tài)具有深遠(yuǎn)的作用[1]。脂肪組織的發(fā)育和積累程度受多種因素的調(diào)節(jié),包括飲食、年齡、品種以及脂肪組織類型等,同時(shí)脂肪代謝也是一個(gè)受多途徑、多基因共同調(diào)控的復(fù)雜過程[2]。目前已發(fā)現(xiàn)眾多參與脂肪代謝的分子,例如:脂肪酸結(jié)合蛋白4(Fatty Acid Binding Protein4,FABP4)、脂肪酸合成酶(Fatty Acid Synthase,FASN)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome Proliferator Activated Receptorγ,PPARγ)、CCAAT增 強(qiáng) 子 結(jié) 合蛋白α(CCAAT enhancer binding protein alpha,C/EBPα)和甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(sterol regulatory element binding protein 1,SREBP1)等,他們都在調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化沉積的過程中發(fā)揮重要作用[3-6]。

脂肪組織按部位主要分為內(nèi)臟脂肪和皮下脂肪,這2種脂肪組織在表型結(jié)構(gòu)、代謝途徑和脂質(zhì)積累上都有明顯的差異[7]。有研究表明,與皮下脂肪相比,內(nèi)臟脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)周轉(zhuǎn)率更高[8],成熟脂肪細(xì)胞比例更高,前體脂肪細(xì)胞分化能力較弱;同時(shí),內(nèi)臟脂肪中雄性激素受體更多且對(duì)β-腎上腺素敏感[9],其具有更強(qiáng)的脂解代謝活性、胰島素抵抗性以及攝取葡萄糖能力,而皮下脂肪吸收循環(huán)中的游離脂肪酸和甘油三酯(Triacylglyceride,TAG)的能力較強(qiáng)[10]。在肉牛養(yǎng)殖業(yè)中,最重要的就是低成本生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)肉,而內(nèi)臟脂肪的沉積會(huì)降低牛肉品質(zhì)并引發(fā)多種代謝疾病[11]。因此,了解肉牛不同脂肪組織的脂質(zhì)代謝差異的機(jī)制,有助于提高肉牛業(yè)的生產(chǎn)效率。

目前,轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于功能基因的挖掘和利用,可以加快對(duì)基因的系統(tǒng)性理解[12]。本試驗(yàn)采用高通量RNA-Seq(RNA Sequencing)技術(shù),以安格斯牛(Aberdeen Angus)和西門塔爾牛(Simmental cattle)為模型,研究不同部位脂肪組織(背皮下脂肪和腎周脂肪)的轉(zhuǎn)錄組圖譜,發(fā)掘與脂肪沉積相關(guān)的功能基因,以期為深入研究皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪的差異提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 試驗(yàn)所需的安格斯牛和西門塔爾牛由內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼余糧畜業(yè)開發(fā)有限公司提供。選取相同月齡且體質(zhì)量差異不顯著的西門塔爾牛和安格斯牛各3頭,屠宰后,采集每頭牛相同部位的腎周脂肪和背皮下脂肪,立即將所有樣品投入液氮,并在-80℃條件下保存,直至隨后使用。

1.1.2 主要試劑 Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(KR118)和Talent熒光定量檢測試劑盒SYBR Green(FP209-01)均購自天根(北京)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和轉(zhuǎn)錄組測序 使用Trizol提取不同脂肪組織中的總RNA。使用Nanodrop(Thermo,美國)檢測總RNA樣品的純度(D260/D280)和濃度。樣品檢測合格后,由深圳華大基因生物科技有限公司完成測序,使用平臺(tái)為BGISEQ-500。

1.2.2 測序數(shù)據(jù)處理與注釋 將測序所得的原始數(shù)據(jù)(Raw data),過濾掉低質(zhì)量、接頭及未知堿基含量過高的reads后,獲得高質(zhì)量的Clean Data,然后利用HISAT軟件將Clean Data與牛的參考基因進(jìn)行對(duì)比。其次利用String Tie軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本重構(gòu),并使用Cuffcompare挑選出新的轉(zhuǎn)錄本,使用CPC對(duì)新轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行蛋白編碼潛力預(yù)測,隨后將預(yù)測具有蛋白編碼潛力的新轉(zhuǎn)錄本加入到參考基因中,得到一個(gè)完整的參考轉(zhuǎn)錄本。最后使用Bowtie2將clean reads比對(duì)到參考序列以統(tǒng)計(jì)基因比對(duì)率,并利用RSEM計(jì)算基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平,使用FPKM作為基因表達(dá)水平的衡量指標(biāo)。

1.2.3 基因表達(dá)分析 在所有樣本中均檢測到的基因稱為共基因。使用OmicShare在線工具(www.omicshare.com/tools),基于log2FPKM值生成了一個(gè)熱圖,該熱圖顯示了表達(dá)量最高的共同基因。

使用DEGseq方法確定安格斯、西門塔爾牛,腎周脂肪和背皮下脂肪樣品組間的差異表達(dá)基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)。以q-value(校正后的p-value)≤0.001和差異倍數(shù)(|log2(Foldchang-e)|＞1)2個(gè)水平作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 差異基因分析 用基因本體(Gene Ontology,GO)來分析DE基因的功能。將DEG與基因本體數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)進(jìn)行比對(duì),對(duì)計(jì)算出的P值進(jìn)行校正,將校正后的P值≤0.05作為所有DE基因GO項(xiàng)的閾值。基于通路的分析有助于理解DE基因在某些生物學(xué)過程中的特定功能。將DEG與京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)數(shù)據(jù)庫(http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)進(jìn)行比對(duì),Q值≤0.05的途徑被認(rèn)為DE基因顯著富集。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證差異基因表達(dá)使用Trizol提取西門塔爾牛和安格斯牛的腎周脂肪和背皮下脂肪總RNA,然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板,對(duì)差異基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。PCR反應(yīng)體系:2×Talent qPCRPre Mix 10μL,正 反 向 引 物(10 μmol/L)各0.6μL,ROX Reference Dye(50×)2μL,cDNA模 板1.25μL,dd H2O 5.55μL。PCR反 應(yīng) 程 序:95℃預(yù) 變 性3 min;95℃變 性5 s,57℃退火10 s,72℃延伸15 s,40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因,每個(gè)樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。引物由Primer(6.0)設(shè)計(jì)并由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1),用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物信息Table1 Primer information

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)分析

使用BGISEQ-500平臺(tái)檢測安格斯牛、西門塔爾牛的腎周脂肪和背皮下脂肪共12個(gè)樣品,每個(gè)樣品平均產(chǎn)出10.99 Gb數(shù)據(jù)。Q20、Q30是指測序過程中,對(duì)所識(shí)別的堿基給出的錯(cuò)誤概率。Q20代表錯(cuò)誤識(shí)別的概率是1%,即正確率是99%;Q30則代表錯(cuò)誤識(shí)別的概率是0.1%,即正確率是99.9%。由表2可知,各樣品clean reads Q30(過濾后的reads中質(zhì)量值大于30的堿基數(shù)占總堿基數(shù)的比例)百分比均在88.2%以上,滿足后續(xù)分析要求。通過對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,樣品比對(duì)基因組的平均比對(duì)率為92.32%,同時(shí)樣品間比對(duì)率較均勻,樣品之間的數(shù)據(jù)具有可比性;共檢測到23 472個(gè)基因,其中已知的基因?yàn)?2 582個(gè),預(yù)測的新基因?yàn)?33個(gè);共檢測出19 747個(gè)新轉(zhuǎn)錄本,其中15 643個(gè)屬于已知蛋白編碼基因的新的可變剪接亞型,933個(gè)屬于新的蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄本,剩下的3 171個(gè)屬于長鏈非編碼RNA。

表2 過濾后的reads質(zhì)量統(tǒng)計(jì)Table2 Quality statistics of filtered reads

2.2 共同高表達(dá)基因

為了進(jìn)一步研究脂肪組織中特定基因的表達(dá)模式,在每個(gè)樣本的前100個(gè)高表達(dá)基因中篩選出50個(gè)共同基因,并根據(jù)FPKM值將它們分為3個(gè)主要簇(圖1)。第一組由32個(gè)基因組成,主要是編碼核糖體蛋白或核糖體蛋白同源物的基因。而與脂肪沉積有關(guān)的幾個(gè)基因,即脂肪酸結(jié)合蛋白4(Fatty Acid Binding Protein4,FABP4),脂肪形成調(diào)節(jié)因子(Adipogenesis Regulatory Factor,ADIRF)和硬脂酰輔酶A去飽和酶(Stearoyl-Co A Desaturase,SCD),與其他基因一起組成第二組和第三組。在熱圖中,不同的顏色代表不同的表達(dá)水平。紅色代表較高的表達(dá),綠色代表較低的表達(dá)。在第一組和第二組中,所有基因在2個(gè)脂肪組織之間均表現(xiàn)出相似的差異表達(dá)模式。特別是在腎周脂肪中,核糖體蛋白基因和2個(gè)脂肪沉積相關(guān)基因(FABP4、ADIRF)的表達(dá)比在背皮下脂肪中更高。第三組的大多數(shù)基因在背皮下脂肪中的表達(dá)水平高于腎周脂肪。在所有測試的脂肪組織中,SCD的m RNA表達(dá)水平最高。

2.3 差異表達(dá)基因的篩選

為了全面了解腎周脂肪和背皮下脂肪組織中DEGs,選擇安格斯牛和西門塔爾牛2個(gè)不同品種牛進(jìn)行分析。使用q-value值≤0.001和|log2Foldchang-e|＞1的篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選DEGs。在安格斯牛腎周和皮下脂肪中,發(fā)現(xiàn)731個(gè)上調(diào)基因和947個(gè)下調(diào)基因;在西門塔爾牛腎周和皮下脂肪中,發(fā)現(xiàn)1 193個(gè)上調(diào)基因和762個(gè)下調(diào)基因(圖2)。

2.4 差異表達(dá)基因的分析

根據(jù)細(xì)胞成分,分子功能和生物學(xué)過程,對(duì)DEGs進(jìn)行GO功能分類,結(jié)果顯示,安格斯牛、西門塔爾牛2個(gè)脂肪組織間的差異基因,在生物過程中,富集最多的是細(xì)胞過程和單細(xì)胞生物過程,代謝過程次之;細(xì)胞組分中,細(xì)胞和細(xì)胞部分富集最多,其次是膜和膜部分;分子功能中,主要是結(jié)合和催化活性(圖3和圖4)。

為了確定與脂肪沉積有關(guān)的生物學(xué)途徑,將DEGs對(duì)比到KEGG數(shù)據(jù)庫中,認(rèn)為Q值≤0.05的途徑是顯著富集的。在安格斯牛腎周脂肪和皮下脂肪中發(fā)現(xiàn)與脂質(zhì)代謝有關(guān)的幾種途徑,PPAR信號(hào)通路(21個(gè)基因,Q=0.007 745 447 6)、甘油脂代謝(14個(gè)基因,Q=0.001 507 545)、類固醇生物合成(7個(gè)基因,Q=0.002 561 65)、甘油磷脂代謝(17個(gè)基因,Q=0.009 139 934)和ECM-受體相互作用(37個(gè)基因,Q=0.007 264 252 3)等途徑得到了顯著富集。

在西門塔爾牛2種脂肪組織中,顯著富集的途徑包含PPAR信號(hào)通路(16個(gè)基因,Q=0.044 426 68),甘油脂代謝(12個(gè)基因,Q=0.033 519),胰島素分泌(19個(gè)基因,Q=0.002 077 858),脂肪細(xì)胞脂解作用的調(diào)控(15個(gè)基因,Q=0.001 166 248)和ECM-受體相互作用(44個(gè)基因,Q=0.000 009 415 021),這些途徑可能有助于脂肪沉積或脂肪酸代謝。

在所有比較中,PPAR信號(hào)途徑、甘油脂代謝和ECM-受體相互作用是富集豐富的共同途徑。因此,將重點(diǎn)放在這3個(gè)途徑以進(jìn)行下一步的研究。表3列出在3種途徑中富集的DEG。在PPAR信號(hào)傳導(dǎo)途徑和甘油脂代謝中,發(fā)現(xiàn)9個(gè)表達(dá)差異較大且共同的DEGs,包括3個(gè)上調(diào)基因:視黃酸X受體α(retinoid X receptor alpha,RXRA)、C1q腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白7(C1q and TNF related 7,C1QTNF7)、單酰甘油-O-?；D(zhuǎn)移酶2(Monoacylglycerol O-acyltransferase 2,MOGAT2)和6個(gè)下調(diào)基因:肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1B(Carnitine Palmitoyltransferase 1B,CPT1B)、解偶聯(lián)蛋白1(Uncoupling Protein 1,UCP1)、脂肪酸結(jié)合蛋白3(Fatty Acid Binding Protein 3,FABP3)、脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(Fatty Acid Translocation enzyme,CD36)、脂蛋白1(LPIN1)、甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶3(Glycerol-3-phosphate Acyltransferase 3,GPAT3)。在ECM-受體相互作用中,Ⅰ型膠原Α(Collagen Type I alpha 1 Chain,COL1A1)、III型膠原Α1(Collagen Type III alpha 1 Chain,COL3A1)、膠原Α2(Collagen Type I alpha 2 Chain,COL1A2)和II型膠原Α1(Collagen Type II alpha 1 Chain,COL2A1)在背皮下脂肪中上調(diào),而層粘連蛋白γ3(Laminin Subunit gamma 3,LAMC3)和粘連蛋白γ2(Laminin Subunit gamma 2,LAMC2)的表達(dá)量下調(diào)(表4)。

表3 富集在PPAR通路、甘油脂代謝和ECM-受體相互作用的差異表達(dá)基因Table3 Differentially expressed genes enriched in PPAR pathway,glycerol metabolism and ECM-receptor interaction

表4 富集在PPAR通路、甘油脂代謝和ECM-受體相互作用的共同差異表達(dá)基因Table4 Common differentially expressed genes enriched in PPAR pathway,glycerol metabolism and ECM-receptor interaction

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組的準(zhǔn)確性,對(duì)差異表達(dá)基因COL1A1、COL3A1、RXRA、LPIN1和GPAT 3進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。圖5結(jié)果顯示,實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)基本一致。

3 討論

脂肪代謝的機(jī)制是很復(fù)雜的,在肉牛養(yǎng)殖業(yè)中操縱脂肪沉積來生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牛肉非常重要。本研究以安格斯牛和西門塔爾牛為模型,通過轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)分析,篩選出不同脂肪組織與脂肪沉積相關(guān)的高表達(dá)共基因和差異基因,探討了差異形成的可能分子機(jī)制。

3.1 牛脂肪沉積的高表達(dá)候選基因

此次研究中,發(fā)現(xiàn)3個(gè)脂肪沉積的候選基因,即FABP4、ADIRF和SCD,它們在牛的脂肪組織中大量表達(dá)。FABP4是一種脂肪細(xì)胞特異性的脂肪酸結(jié)合蛋白,與脂肪酸有很高的親和力,被認(rèn)為在動(dòng)物的脂肪酸運(yùn)輸和脂肪沉積中發(fā)揮作用[13]。研究證實(shí),FABP4參與牛的脂肪積累,且其多態(tài)性與牛羊肉的嫩度有關(guān)[14]。ADIRF特異性分布于細(xì)胞核,在脂肪組織高度表達(dá),在人類肥胖者的脂肪組織中該基因表達(dá)量顯著上調(diào)。Ni等[15]研究發(fā)現(xiàn),在3T3-L1細(xì)胞中過表達(dá)ADIRF基因可上調(diào)PPARγ和C/EBPα的水平,并在脂肪形成的早期促進(jìn)成脂分化;此外,還可刺激前體脂肪增殖并抑制凋亡,同時(shí)通過增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(Facilitated Glucose Transporter 4,GLUT4)的表達(dá)水平,增強(qiáng)了脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取能力[16]。表明,ADIRF可以調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞增殖分化和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn),促進(jìn)脂肪沉積。但目前,對(duì)于該基因的研究十分有限,且僅局限于人類,其在家畜中的功能特性需要進(jìn)一步發(fā)掘。SCD是催化飽和脂肪酸向單不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶,其表達(dá)量和活性與脂肪沉積和單不飽和脂肪酸含量呈正相關(guān)[13],可以通過調(diào)節(jié)脂肪沉積和脂肪酸組成來改善肉質(zhì)。Am等[17]研究

顯示,SCD是脂肪生成轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1C的靶基因,并在UTR區(qū)域受SREBP-1C正調(diào)控,SCD基因的敲除會(huì)顯著降低SREBP-1C的表達(dá)水平,并抑制前體脂肪的分化[18]。有報(bào)道稱,油酸可激活SCD敲除小鼠中SREBP-1C的表達(dá)和活性[19]。表明,SCD作為油酸生物合成的關(guān)鍵酶,其可能通過調(diào)控油酸的合成來影響SREBP-1C的表達(dá)與活性,并進(jìn)一步調(diào)節(jié)其他脂肪生成基因,最終影響脂肪生成。

3.2 幾種差異基因?qū)χ境练e的影響

在本研究中,發(fā)現(xiàn)在牛的背皮下脂肪和腎周脂肪中差異化表達(dá)PPAR信號(hào)通路和甘油酯代謝通路中的多個(gè)基因(表4),其中RXRA、C1QTNF7和MOGAT2在背皮下脂肪中被上調(diào)。RXRA屬于配體依賴性核受體家族成員,RXRA可作為一個(gè)有活性的配體結(jié)合亞單位與PPARs形成異二聚體作用于靶基因[20]。當(dāng)PPARγ與RXRA進(jìn)行異二聚化才能產(chǎn)生活化的核受體結(jié)構(gòu),并與靶基因啟動(dòng)子上的過氧化物酶體增殖物反應(yīng)原件(Peroxisome Proliferator Response Element,PPRE)結(jié)合,從而調(diào)控靶基因的表達(dá)[21];同時(shí)Xue等[22]的研究發(fā)現(xiàn),PPARA/RXRA信號(hào)可調(diào)節(jié)綿羊肝臟中脂肪酸的代謝。表明,RXRA的表達(dá)與活性能調(diào)節(jié)PPARs生物功能的發(fā)揮,進(jìn)而影響脂肪的代謝。C1QTNF7與脂聯(lián)素具有高度結(jié)構(gòu)相似性,主要在脂肪組織中表達(dá)[13]。肥胖人的循環(huán)和肝臟中C1QTNF7水平顯著升高,并且與體質(zhì)量指數(shù)、葡萄糖、胰島素和TAG水平呈正相關(guān)[23]。體內(nèi)試驗(yàn)表明,與野生型小鼠(Ferox genus murium)相比,C1QTNF7敲除小鼠會(huì)減弱肥胖所引起的胰島素抵抗,改善葡萄糖代謝和脂肪組織炎癥[23]。以上結(jié)果表明,C1QTNF7基因的表達(dá)可能會(huì)對(duì)脂肪代謝有著重要的作用。MOGAT2是酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶家族的關(guān)鍵成員,能催化甘油一酯的酯化生成甘油二酯,該基因的缺失會(huì)使得機(jī)體食物攝入和脂肪吸收減少,增加能量消耗,并減輕由飲食誘導(dǎo)的葡萄糖耐受不良和脂肪積累[24]。

在腎 周 脂 肪 中CPT1B、LPIN1、GPAT3和CD36基因表達(dá)水平上調(diào)。CPT1B是脂肪分解代謝的關(guān)鍵酶,也是脂肪酸β-氧化的限速酶,催化脂酰輔酶A與肉毒堿結(jié)合生成脂酰肉堿,并將其轉(zhuǎn)移到線粒體內(nèi)膜進(jìn)行β-氧化,從而為機(jī)體提供能量并減少脂肪沉積。CPT1B在腎周脂肪中的表達(dá)量上調(diào),可能是內(nèi)臟脂肪脂解代謝活性強(qiáng)于皮下脂肪的部分原因。但目前,CPT1B對(duì)脂肪沉積的調(diào)控頗有爭議,俞雨陽等[25]研究顯示,綿羊肌肉組織中的CPT1B基因的表達(dá)量與肌間脂肪沉積量呈顯著正相關(guān),而Zhao等[26]以豬為研究對(duì)象發(fā)現(xiàn),CPT1B表達(dá)量與肌間脂肪呈負(fù)相關(guān);高明[27]發(fā)現(xiàn)在牛胎兒成纖維細(xì)胞中隨著CPT1B的表達(dá)量升高,TAG的含量呈現(xiàn)顯著上升的趨勢,而Zhang等[28]在前體脂肪細(xì)胞中則顯示CPT1B的高表達(dá)量會(huì)抑制TAG的生成。推測這些差異可能與種間特異性以及組織間特異性有關(guān),CPT1B在脂肪代謝中的具體功能及作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。LPIN1是脂類家族成員,在維持脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用,一方面LPIN1是催化磷脂酸轉(zhuǎn)化為TAG和磷脂所必需的磷脂酸磷酸酶,另一方面,其可以與PPARα和PPARγ共激活劑α(PGC-1α)作用,共同調(diào)節(jié)脂肪分化和脂類合成等過程[29]。GPAT是TAG從頭合成途徑中的限速酶,可催化TAG合成的第一步,將3-磷酸甘油轉(zhuǎn)化為溶血磷脂酸(LPA),具有四種亞型GPAT1-4。其中GPAT3定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),最重要的是GPAT3被認(rèn)為是脂肪細(xì)胞中合成TAG的主要亞型[30]。在前脂肪細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),GPAT3m RNA的表達(dá)量在分化過程中顯著上調(diào);另外,過表達(dá)GPAT3后,胞內(nèi)的TAG含量顯著增加(約3～4倍),而敲低該基因,幾乎完全阻止了脂滴的形成[31],表明GPAT3對(duì)脂質(zhì)的形成有促進(jìn)作用。體內(nèi)試驗(yàn)顯示,與野生型小鼠相比,高脂飲食飼喂的GPAT3敲除小鼠能減少脂肪的沉積,改善葡萄糖和脂質(zhì)代謝,減輕胰島素抵抗[32]。CD36對(duì)長鏈脂肪酸具有高親和力,其高表達(dá)有助于組織對(duì)脂肪酸的吸收,可促進(jìn)脂質(zhì)在組織中的積累。此外大量研究證實(shí),CD36可以介導(dǎo)其他信號(hào)通路,造成機(jī)體的代謝紊亂,并引發(fā)一系列疾病,如:胰島素抵抗、II型糖尿病和炎癥反應(yīng)等[33-34]。本 試 驗(yàn) 中LPIN1、CPAT3和CD36在牛腎周脂肪中上調(diào)表達(dá),表明LPIN1、CPAT3和CD36可能是促進(jìn)內(nèi)臟脂肪含量增加,進(jìn)而引發(fā)代謝性疾病的候選基因。

UCP1和FABP3在2個(gè) 脂 肪 組 織 間 的 表 達(dá)量也不同。UCP1在棕色脂肪脂肪中發(fā)現(xiàn),在生熱和脂解調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[35]。研究表明,UCP1的多態(tài)性與奶牛的乳品質(zhì)[36]和綿羊的胴體性狀[37]有關(guān)。FABP3與FABP4具有相似的功能,主要在心臟和骨骼肌中表達(dá),調(diào)節(jié)肌肉脂肪含量和脂肪組織發(fā)育。

3.3 細(xì)胞外基質(zhì)在脂肪組織中的作用

在脂肪組織中,脂肪細(xì)胞嵌入在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)網(wǎng)絡(luò)中,該網(wǎng)絡(luò)可以支持和錨固脂肪細(xì)胞并調(diào)節(jié)脂肪生成,主要由膠原蛋白組成[38]。不同的膠原蛋白構(gòu)成不同的成分,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原形成原纖維,Ⅳ型膠原形成基膜。在脂肪細(xì)胞分化早期,Ⅰ、Ⅲ型膠原由前體脂肪細(xì)胞分泌,Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型膠原在分化的中期達(dá)到峰值[13]。在本研究中,ECM途徑相關(guān)的基因,如:COL1A1、COL1A2、COL2A1、COL3A1和其他基因的差異表達(dá),顯示了在牛腎周脂肪和背皮下脂肪間ECM結(jié)構(gòu)和成脂能力的差異。

4 結(jié)論

本研究提供牛2個(gè)不同脂肪組織的轉(zhuǎn)錄圖譜,鑒定出高度轉(zhuǎn)錄的共同基因,并利用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫分析了腎周脂肪和背皮下脂肪之間的差異基因。數(shù)據(jù)顯示FABP4、ADIRF和SCD與脂肪沉積相關(guān),并有很高的轉(zhuǎn)錄水平。9個(gè)與脂肪沉積相關(guān)的基因(RXRA、C1QTNF7、MOGAT2、CPT1B、LPIN1、GPAT3、UCP1、FABP3和CD36)和6個(gè)ECM相 關(guān) 基 因(COL1A1、COL1A2、COL2A1、COL3A1、LAMC2和LAMC3)可能是造成腎周脂肪與背皮下脂肪之間脂肪代謝差異的候選基因。需要進(jìn)一步研究候選基因在脂肪代謝中的作用,以改善肉牛的育種過程。