阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者外周血自噬相關(guān)分子和趨化因子的表達及臨床意義*

林俏麗 李際強 白曉輝 陳麗琴 陳劍坤

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院綜合三科，廣東 廣州 510006；2.廣州中醫(yī)院大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006)

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(Obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS)是一種常見的慢性睡眠呼吸性疾病，患者入睡后常出現(xiàn)不明原因的上氣道阻塞，引起呼吸暫停和低通氣，導(dǎo)致間歇性低氧血癥、高碳酸血癥和睡眠結(jié)構(gòu)紊亂等癥狀，并伴有白天嗜睡、心腦血管及多臟器損害等并發(fā)癥。成年人OSAHS患病率為4%～9%，中年女性發(fā)病率為1%～2%[1-5]。 經(jīng)研究證實，OSAHS患者低氧、缺氧將導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，ROS能夠誘導(dǎo)細胞因子釋放入血，和炎癥因子、趨化因子共同引起機體多種病理生理變化[6-8]。此外，OSAHS的氧化應(yīng)激與自噬(Autophagy)之間存在密切聯(lián)系[9-11]。自噬是真核細胞中廣泛存在，能夠降解細胞內(nèi)受損傷細胞器和長壽命蛋白質(zhì)的生理現(xiàn)象，為細胞在應(yīng)激條件下再次利用營養(yǎng)物質(zhì)，維持自身生存的關(guān)鍵細胞修復(fù)途徑之一[12-14]。

目前，自噬相關(guān)分子和趨化因子在OSAHS中的病理作用相關(guān)研究較少報道。本研究通過對不同嚴重程度OSAHS患者外周血中的自噬相關(guān)分子ATG16L1、Beclin1，及趨化因子CCL2、CCL5表達水平進行研究，旨在探討其與OSAHS病情程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年9月～2020年8月廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院綜合三科就診并接受治療的OSAHS患者90例為研究對象，患者包括輕度、中度和重度OSAHS患者，各30例，匹配同期健康對照30例。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，患者及家屬均知情同意。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 參照2011 年中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會睡眠呼吸障礙學(xué)組制定的《阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診療指南》[15]和2009年睡眠呼吸暫停與心血管疾病專家共識組制定的《睡眠呼吸暫停與心血管專家共識標(biāo)準(zhǔn)》[16]，經(jīng)PSG 監(jiān)測提示每夜7 h 睡眠中呼吸暫停及低通氣反復(fù)發(fā)作在30 次以上或呼吸暫停低通氣指數(shù)(the Apnea-hypopnea index,AHI)>5 次/h診斷為OSAHS。按照AHI 值將OSAHS患者分為輕、中、重度，AHI 5～15 次/h為輕度； AHI 16～29 次/h為中度；重度：AHI>30 次/ h為重度。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有高脂血癥、糖尿病、肺部疾病、急慢性感染、惡性腫瘤、腦卒中、過敏性疾病、血液系統(tǒng)疾病等。②伴有心肝腎等重要臟器功能不全者。③既往接受過口腔矯正器和懸雍垂顎咽成形術(shù)等治療者。

1.4 方法

1.4.1 PSG監(jiān)測 采用多導(dǎo)睡眠監(jiān)測儀(PSG，美國衛(wèi)康公司)監(jiān)測患者的睡眠呼吸情況[17]，監(jiān)測時間為每晚7 h睡眠期間，并在檢測當(dāng)天，禁服鎮(zhèn)靜劑、催眠藥與咖啡因等，禁止飲酒；同步監(jiān)測睡眠腦電活動、睡眠呼吸情況(包括腦電圖、口鼻氣流、胸式呼吸、腹式呼吸和SaO2)。所有數(shù)據(jù)自動記錄并存儲在計算機內(nèi)，次日監(jiān)測結(jié)束后，人工判讀監(jiān)測數(shù)據(jù)后形成檢查報告。

1.4.2 ELISA檢測血漿中ATG16L1和Beclin 1水平 于PSG 監(jiān)測次日清晨，使用肝素鈉抗凝采血管收集所有研究對象清晨空腹靜脈血4 mL，經(jīng)2000 r/min 離心15 min，分離上層血漿，置于4℃冰箱中待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測ATG16L1和Beclin 1表達水平，嚴格遵守試劑盒(ATG16L1 ELISA檢測試劑盒，上海晶抗生物工程有限公司，生產(chǎn)批號：AS521；Beclin 1 ELISA檢測試劑盒，上海一研生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：EY3592)說明書進行。

1.4.3 分離外周血單核細胞 使用淋巴細胞分離液以Ficoll密度梯度法分離出外周血單核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，置-80℃冰箱保存。

1.4.4 RT-PCR檢測PBMC中趨化因子CCL2、CCL5的表達 將500 μL Trizol加入外周血單核細胞中進行吹打混勻，混合液中加入200 μL氯仿進行渦旋， 4℃離心20 min(12 000 r/min)，靜置后分離上清液，在上清液中加入預(yù)冷異丙醇，4℃離心15 min(12 000 r/min)，棄上清后加入無酶水1 mL，4℃離心15 min(12 000 r/min)，最終用10 μL DEPC 水加熱溶解沉淀。使用Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR 引物由Invitrogen生物有限公司設(shè)計合成，引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列

PCR反應(yīng)過程和條件為：預(yù)變性：95℃下3 min；變性：95℃下30 s；退火時間0.05 s，延伸時間35 s，循環(huán)次數(shù)為35 次。以GAPDH 作為內(nèi)參， 將所得Ct 值按2-△△Ct 方法進行處理。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 使用秩和檢驗分析分類變量和連續(xù)變量，使用tukey法進行組間比較。統(tǒng)計分析由SAS 9.4軟件完成，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。圖1 由Prism 8軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 4組一般資料的比較 對照組，輕度、中度和重度OSAHS組性別、年齡、體重指數(shù)(Body mass index,BMI)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而AHI和最低血氧飽和度比較，4個組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 研究對象一般情況比較

2.2 AHI與性別、BMI、年齡和最低血氧飽和度的相關(guān)性 將性別、BMI、年齡和最低血氧飽和度分別與AHI進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明：性別、BMI、年齡的分布與AHI無明顯相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.03、0.06和0.17，且3組相關(guān)系數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；最低血氧飽和度水平與AHI呈負相關(guān)，最低血氧飽和度相關(guān)系數(shù)為-0.93，見圖1。

圖1 性別、BMI、年齡和最低血氧飽和度水平與AHI相關(guān)性分析

2.3 各組外周血中自噬相關(guān)分子ATG16L1、Beclin1和趨化因子CCL2、CCL5表達情況 輕、中、重度OSAHS組血漿中自噬相關(guān)分子ATG16L1、Beclin1的濃度明顯低于對照組(均P<0.01)；與對照組相比，輕、中、重度OSAHS組患者外周血單核細胞中趨化因子CCL2和CCL5 mRNA表達水平顯著升高(均P<0.01)，見表3。

表3 各組自噬相關(guān)分子和趨化因子表達水平比較

2.4 AHI與自噬相關(guān)分子、趨化因子表達水平的相關(guān)性 將ATG16L1、Beclin1、CCL2和CCL5分別與AHI進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：血漿中ATG16L1、Beclin1的表達水平與AHI呈負相關(guān)，ATG16L1和Beclin1相關(guān)系數(shù)均為-0.94，且兩組相關(guān)系數(shù)有統(tǒng)計學(xué)差異(均P<0.01)。外周血單核細胞中CCL2、CCL5的mRNA含量與AHI呈正相關(guān)，CCL2和CCL5的相關(guān)系數(shù)均為0.94，且兩組相關(guān)系數(shù)有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)，見圖2。

圖2 ATG16L1、Beclin1、CCL2和CCL5的表達水平與AHI相關(guān)性分析

3 討論

自噬是普遍存在于真核生物中正常代謝過程，具有維持細胞內(nèi)環(huán)境自穩(wěn)的作用[18]；作為重要的自我保護機制，自噬參與機體的多種代謝過程，影響多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[19-20]。有研究發(fā)現(xiàn)，自噬參與氧化應(yīng)激反應(yīng)[21-22]，自噬能減少及清除氧化應(yīng)激制造的損傷，減緩細胞死亡；而當(dāng)自噬過程被阻斷時，導(dǎo)致毒性蛋白質(zhì)聚集和線粒體功能損傷，從而進一步加劇氧化應(yīng)激[23-25]。OSAHS患者存在一種很特殊的缺氧模式：間斷缺氧，表現(xiàn)為缺氧程度嚴重、血氧變化幅度大，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)[26]。細胞在低氧條件下能通過上調(diào)低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)，激活BNIP3/BNIP3L及Beclin-1介導(dǎo)的通路誘導(dǎo)線粒體自噬，最終減少ROS的產(chǎn)生，促進細胞的存活，使機體產(chǎn)生低氧適應(yīng)[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，輕、中、重度OSAHS患者外周血單核細胞中CCL2和CCL5表達升高，血漿中Beclin1 和ATG16L1表達降低，并且OSAHS患者病情程度與外周血中自噬分子表達水平呈負相關(guān)，與趨化因子表達水平成正相關(guān)。此外，本研究團隊前期連續(xù)8周每周檢測OSAHS患者自噬相關(guān)分子和趨化因子的表達水平，兩者表達水平較為穩(wěn)定，并未發(fā)現(xiàn)明顯動態(tài)變化，且兩者表達水平與疾病嚴重程度密切相關(guān)。

OSAHS患者的典型表現(xiàn)是慢性間斷性缺氧[28-29]。OSAHS患者長期間歇性缺氧、高碳酸血癥能夠誘導(dǎo)中性粒細胞等炎癥細胞釋放大量炎癥因子[28]。有研究表明，自噬、炎癥和氧化應(yīng)激存在交互反應(yīng)，自噬水平降低可加重炎癥反應(yīng)[24]。趨化因子是由炎性細胞衍生的能夠趨化和激活各種白細胞的細胞因子，能夠引導(dǎo)白細胞亞群的定向游走和組織內(nèi)聚集；趨化因子CCL2、CCL5及其受體對免疫炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用[30]。自噬水平降低導(dǎo)致趨化因子為代表的炎癥分子分泌增多，是誘發(fā)和加重OSAHS的重要調(diào)控機制之一。

目前，OSAHS診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是PSG，AHI是評價其嚴重程度的主要指標(biāo)[31-32]。本研究顯示，OSAHS患者外周血中自噬相關(guān)分子ATG16L1和Beclin1水平降低，趨化因子CCL2和CCL5表達水平升高；并且CCL2、CCL5表達水平和AHI呈正相關(guān)，自噬相關(guān)分子ATG16L1、Beclin1表達水平和AHI呈負相關(guān)，提示自噬相關(guān)分子和趨化因子可能參與OSAHS的發(fā)生、發(fā)展。但由于本研究樣本量的局限性，自噬分子和趨化因子能否作為評價OSAHS嚴重程度的指標(biāo)，還有待進一步驗證。因此，自噬相關(guān)分子、趨化因子與OSAHS的嚴重程度相關(guān)，為 OSAHS診斷和治療提供了新的靶點和方向。

4 結(jié)論

OSAHS患者外周血中，自噬相關(guān)分子水平降低，趨化因子表達水平升高，并且兩者與OSAHS嚴重程度相關(guān)，提示兩者可能參與OSAHS的發(fā)生、發(fā)展。