加味消毒飲顆粒微生物限度檢查方法學驗證

劉 鈺 吳無畏 付書婕 蔣雅娜 王國倩 潘 宇 陳 路

1.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西南寧 530023；2.廣西壯要方醫(yī)院藥劑科，廣西南寧 530150；3.右江民族醫(yī)學院，廣西百色 533000

五味消毒飲方出自清代吳謙編纂的《醫(yī)宗金鑒》，處方由金銀花、野菊花、蒲公英、紫花地丁、紫背天葵子五味中藥組成，為中醫(yī)治療瘡疔庸腫的常用方劑，廣泛用于急性咽炎、扁桃體炎、嚴重外耳道癤腫等耳鼻喉科感染，麥粒腫、復發(fā)性單純皰疹性角膜炎、色素膜炎等眼科感染，體表化膿性疾病、頜面部蜂窩織炎、痤瘡等多種外科及外邪熱毒（病原體）所侵導致的疾病[1-11]。廣西壯要方醫(yī)院在長期的臨床醫(yī)療實踐中，根據(jù)風熱感冒的疾病特點，對五味消毒飲處方進行了調整，形成了加味消毒飲方藥，該方藥由黃芩、山銀花、穿心蓮、野菊花、蒲公英、梔子6 味藥組成，此方藥對熱毒所侵引發(fā)的風熱感冒如肺熱咳嗽、急性扁桃體炎及多種感染性疾病都有較好的治療效果。加味消毒飲顆粒作為新出方藥，為保證用藥安全性，對其進行微生物限度檢查非常必要。本研究以《中華人民共和國藥典》的標準為依據(jù)[12]，建立了加味消毒飲顆粒微生物限度檢查方法，并進行驗證，為臨床用藥安全提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

YXQ-LS-100SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；SW-CJ-2FD 型潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；BSA124S 型電子分析天平（德國Sartoriu 公司，精度：0.0001 g）；LHS-2C80型恒溫恒濕箱（上?？瞥綄嶒炘O備有限公司）；SPX-100B-Z 型生化培養(yǎng)箱（蘇州江東精密儀器有限公司）；JBQ-ZD8 型金溫振蕩器（常州普天儀器制造有限公司金壇市晶玻實驗儀器廠）；JBZL-08 型智能氣浴恒溫振蕩器（常州普天儀器制造有限公司金壇市晶玻實驗儀器廠）。

1.2 材料

1.2.1 試藥 加味消毒飲顆粒（廣西壯要方醫(yī)院，批號：20200901、20200902、20200903，規(guī)格：15 g/袋）。

1.2.2 培養(yǎng)基 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（中國食品藥品檢定研究院，批號：135025-201804）；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（中國食品藥品檢定研究院，批號：135026-201401）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（中國食品藥品檢定研究院，批號：135013-201001）；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（中國食品藥品檢定研究院，批號：135008-201503）；pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液（北京陸橋技術股份有限公司，批號：200706）；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋技術股份有限公司，批號：190902）；麥康凱液體培養(yǎng)基（北京陸橋技術股份有限公司，批號：190802）；聚山梨酯80（北京陸橋技術股份有限公司，批號：171206）。

1.2.3 菌種 大腸埃希氏菌[CMCC（B）44102，中國食品藥品檢定研究院]；金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003，中國食品藥品檢定研究院]；白色念珠菌[CMCC（F）98001，中國食品藥品檢定研究院]；枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501，中國食品藥品檢定研究院]；綠膿假單胞菌[CMCC（B）10104，中國食品藥品檢定研究院]；黑曲霉菌[CMCC（F）98003，中國食品藥品檢定研究院]，本研究所用的均為第3 代菌株。

2 方法與結果

2.1 菌液制備

分別取“1.2.3”項下的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和綠膿假單胞菌，在胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中于34℃條件下培養(yǎng)24 h。取上述培養(yǎng)物用氯化鈉-蛋白胨緩沖液（pH=7.0）制備成菌懸液，備用；取“1.2.3”項下的白色念珠菌在沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中于25℃條件下培養(yǎng)3 d，取所得培養(yǎng)物用氯化鈉-蛋白胨緩沖液（pH=7.0）制備成菌懸液，備用；取“1.2.3”項下的黑曲霉菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中于25℃條件下培養(yǎng)5 d，所得培養(yǎng)物加5 ml 含0.05%聚山梨酯80 的氯化鈉-蛋白胨緩沖液（pH=7.0），洗下霉菌孢子，制備成菌懸液，備用。

2.2 供試液制備

取“1.2.1”項下批號為20200901 的加味消毒飲顆粒1 袋（15 g），用氯化鈉-蛋白胨緩沖液（pH=7.0）制成1∶10 的供試液。取所制得供試液50 ml，加氯化鈉-蛋白胨緩沖液（pH=7.0）至100 ml 稀釋成1∶20 供試液，備用。

2.3 需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法的驗證

2.3.1 常規(guī)法 試驗組：精密吸取“2.2”項下1∶10 供試液5 份，各9.9 ml，每份供試液分別加入金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、綠膿假單胞菌及黑曲霉菌菌懸液各0.1 ml（每1 ml 所含菌數(shù)≤100 cfu），混合均勻制得染菌供試液。在平皿中分別注入上述各染菌供試液1 ml，注入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌及枯草芽孢桿菌在34℃溫度條件下培養(yǎng)3 d，白色念珠菌及黑曲霉菌在25℃溫度條件下培養(yǎng)5 d。每份染菌供試液平行制備2 個平皿進行平行試驗。

菌液對照組：精密吸取氯化鈉-蛋白胨緩沖液（pH=7.0）5 份，各9.9 ml，每份中分別加入的菌懸液與試驗組相同，其余操作步驟同試驗組。

供試品對照組：精密吸取1∶10 供試液9.9 ml，加入pH=7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.1 ml，不加菌懸液，其余操作步驟同試驗組。

回收率測定結果：試驗組的加菌回收率比值=（試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù)）/菌液對照組的平均菌落數(shù)。按國家《中華人民共和國藥典》[12]標準，回收率比值應為0.5～2.0。常規(guī)法中金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率比值分別為0.38、0.39、1.04、0.91、1.02。本試驗中，金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌的回收率比值均<0.50，由此可知采用常規(guī)法制備供試液，平皿法進行加味消毒飲顆粒的需氧菌總數(shù)測定不可行，需要更換檢測方法。常規(guī)法中白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率比值都在0.5～2.0 范圍內，可見采用供試液常規(guī)法對加味消毒飲顆粒的霉菌及酵母菌總數(shù)進行測定具有可行性。見表1。

表1 常規(guī)法加味消毒飲顆粒-需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)回收試驗結果（cfu/ml）

2.3.2 供試液稀釋法 試驗組：分別精密吸取“2.2”項下1∶20 供試液9.9 ml，共5 份，每份中分別加入的菌懸液與常規(guī)法的試驗組相同，其余操作步驟同常規(guī)法的試驗組。

菌液對照組：精密吸取氯化鈉-蛋白胨緩沖液（pH=7.0）5 份，各9.9 ml，每份中分別加入的菌懸液與試驗組相同，其余操作步驟同試驗組。

供試品對照組：精密吸取1∶20 供試液9.9 ml，加入pH=7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.1 ml，不加菌懸液，其余操作步驟同試驗組。

回收率測定結果：稀釋法中金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率比值分別為0.98、1.02、1.16、1.10、1.03。5 種試驗菌的回收率比值都在0.5～2.0 范圍內，由此可知采用供試液稀釋法，將供試液稀釋至1∶20，平皿法進行加味消毒飲顆粒的需氧菌總數(shù)測定可行。見表2。

表2 稀釋法加味消毒飲顆粒-需氧菌總數(shù)回收試驗結果（cfu/ml）

2.4 控制菌（大腸埃希菌）檢查方法的驗證

試驗組：取“2.2”項下1∶10 供試液及每1 ml 含菌量≤100 cfu 的大腸埃希菌菌懸液10 ml，與100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基混合均勻，于35℃溫度條件下培養(yǎng)24 h。取所得培養(yǎng)物1 ml 注入100 ml 麥康凱液體培養(yǎng)基中，在42℃條件下培養(yǎng)24 h 后，將所得培養(yǎng)物劃線法接種在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，于35℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。

菌液對照組：不含供試液，其余操作同試驗組。

供試品對照組：取10 ml“2.2”項下1∶10 供試液，接種在100 ml 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，其余操作同試驗組。

大腸埃希菌檢查試驗結果：試驗組、菌液對照組麥康凱液體培養(yǎng)基顯渾濁，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基顯粉色或紅色菌落，判定檢出大腸埃希菌；供試品對照組麥康凱液體培養(yǎng)基澄清，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基無菌落生長。提示常規(guī)法可用于加味消毒飲顆?？刂凭鷻z查。

2.5 3 批樣品微生物限度檢查

根據(jù)所建立的微生物限度檢查法，對3 批樣品進行檢驗，分別平行試驗3 次，結果見表3。

表3 3 批加味消毒飲顆粒微生物限度檢查結果（cfu/ml）

綜上所述，加味消毒飲顆粒的微生物限度檢查方法需氧菌總數(shù)檢查采用供試液稀釋法（1∶20）、霉菌及酵母菌總數(shù)檢查及控制菌的檢查可采用供試液常規(guī)法，試驗菌的回收率及控制菌檢查結果均符合2020年版《中華人民共和國藥典》[12]中的規(guī)定。

3 討論

加味消毒飲顆粒由五味消毒飲通過組方調整、劑型變化而來，是首次報道的經(jīng)過長期臨床實踐證明確有療效的新制劑。方中山銀花清熱解毒、疏散風熱，野菊花疏風平肝，二者合為君藥；黃芩清熱瀉火解毒，穿心蓮清熱解毒、消炎止痛，梔子清熱瀉火涼血，蒲公英清熱利尿，整方清熱解毒功效見長，對各型風熱感冒有良效[13-19]。加味消毒飲顆粒在微生物限度檢查方法適用性試驗中，采用常規(guī)法（1∶10）制備供試液檢查需氧菌總數(shù)時，金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌的回收率均＜0.5，低于2020 年版《中華人民共和國藥典》[12]規(guī)定的限度范圍（0.5～2.0）。這提示采用常規(guī)法（1∶10）的稀釋倍數(shù)時，樣品的溶液仍然具有一定的抑菌活性，影響了金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌的回收率。文獻關于中藥制劑微生物限度檢查的報道也表明，中藥制劑的本身也含有一定的抑菌作用，是微生物限度檢驗干擾因素之一，可以通過采取一定的方法消除中成藥藥品本身抑菌成分的干擾[20-25]。如本研究所示，當供試品稀釋制成1∶20 的供試液，平皿法進行加味消毒飲顆粒需氧菌總數(shù)測定時，5 種試驗菌的回收率均＞0.5 且＜2.0，提示當供試品稀釋制成1∶20 的供試液時其抑菌效力有所降低。

微生物體積小，種類多，分布廣泛，代謝類型及代謝產(chǎn)物多樣，對人類生產(chǎn)、生活的影響巨大。藥品微生物限度檢查是確保藥品質量和保障患者的用藥安全的重要手段，也是藥品監(jiān)管的重要內容。此外，中藥制劑的處方、制法都可能對試驗結果產(chǎn)生影響，檢驗人員對方法適用性試驗工作的理解認知也還存在許多不足，日常微生物檢驗時更需要對中藥制劑具體品種進行具體分析，也預示著未來對中藥制劑進行微生物限度檢查將面臨一定的復雜性和挑戰(zhàn)性。