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      人參皂苷Rg1 對人臍血間充質(zhì)干細胞活性和成血管分化的影響

      2022-01-19 07:26:10周奇妙彭阿建朱芙蓉譚梅鑫王曉琴彭佳蕊
      中國醫(yī)藥導報 2021年36期
      關(guān)鍵詞:緩沖液內(nèi)皮細胞分化

      周奇妙 彭阿建 張 熙 朱芙蓉 譚梅鑫 王曉琴 彭佳蕊 熊 武

      1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院燒傷整形科,湖南長沙 410007;2.湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院,湖南長沙 410208;3.湖南中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院,湖南長沙 410007

      間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)是一種可以多向分化的成體干細胞,具有很強的修復重建能力,可以促進內(nèi)皮細胞增殖和遷移,甚至在特定環(huán)境下可分化為內(nèi)皮細胞,促進損傷部位的血管再生和內(nèi)皮重建[1]。目前關(guān)于MSCs 參與血管新生的研究已成為血管新生領(lǐng)域的研究熱點,而這與其細胞活性和增殖能力關(guān)系緊密。現(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn),中藥干預可提高MSCs 的活性和增殖能力,有助于MSCs 發(fā)揮促進血管新生的作用[2-3]?,F(xiàn)代藥理研究表明,人參含人參皂苷(ginsenoside,GS)Ro、Rb1、Re、Rg1 等多種皂苷類成分,以及多糖、氨基酸、黃酮類等,其中GS-Rg1 為其主要活性成分之一[4]。GS-Rg1 具有降血糖[5]、降血脂[6]、促血管新生[7]、抗氧化應激[8]、減輕炎癥反應[9]等作用。目前關(guān)于GS-Rg1 發(fā)揮血管新生作用的研究主要集中在血管內(nèi)皮細胞,而針對GS-Rg1 是否能通過誘導非內(nèi)皮細胞促進血管新生的研究鮮有報道。本研究將GS-Rg1 聯(lián)合具有血管內(nèi)皮分化潛能的人臍血MSCs 進行細胞活性和體外成血管分化研究。

      1 材料與方法

      1.1 主要藥品試劑

      胎牛血清(10270-106),購自美國GIBCO;抗血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子-1(anti-platelet endothelial cell adhesion molecule-1,anti-CD31)抗體(ab28364),抗血管性血友病因子(anti-von Willebrand factor,antivWF)抗體(ab154193),山羊抗小鼠IgG H&L(異硫氰酸熒光素)(ab6785),購自英國Abcam;CCK-8 試劑盒(C0037),購自上海碧云天生物技術(shù)研究所;DMEM/F12 培養(yǎng)基(SH30023.01B)、磷酸鹽緩沖液(SH30256.01B),購自美國Hyclone;Matrigel 基質(zhì)膠(354234),購自美國BD BioCoat;成骨誘導分化培養(yǎng)基(HUXMA-90021),成脂誘導分化培養(yǎng)基(RASMD-90031),購自美國Cyagen;成軟骨誘導分化培養(yǎng)基試劑盒(HUXUB-90042),購自美國OriCell;DAPI 染液(D9542)、油紅O 溶液(O1391-250ML)、茜素紅染液(130-22-3RT),購自美國Sigma;阿利新藍染液(MAS0981),購自中國MesGen;抗人CD44 抗體(異硫氰酸熒光素)(338803)、抗人CD73 抗體(藻紅蛋白)(344003)、抗人CD105 抗體(別藻藍蛋白)(323207),購自美國Biolegend。

      1.2 主要儀器

      CO2培養(yǎng)箱(XD-101),日本SANYO;生物倒置顯微鏡(BX51),日本OLYMPUS;臺式低速離心機(5804R),德國Eppendorf;熱電酶標儀(MK3),美國Thermo;共聚焦顯微鏡(LSM800),德國蔡司。

      1.3 研究方法

      1.3.1 人臍血MSCs 的培養(yǎng)和鑒定 無菌條件下取足月健康新生兒臍帶血10 ml(標本采集獲得產(chǎn)婦和家屬同意,簽署知情同意書并獲湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會同意,批準文號:HN-LL-KY-2020-013-01),用密度梯度離心得到單個核細胞,移入含5%胎牛血清、1%雙抗的DMEM/F12 培養(yǎng)基中,放在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后換液,去除漂浮細胞,換培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)至第7 天,細胞生長達90%融合時進行傳代培養(yǎng),每隔2 d 換液1 次。取第3 代人臍血MSCs 于光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài),取第4 代分別進行成骨、成軟骨和成脂誘導分化鑒定。

      1.3.2 最佳濃度GS-Rg1 的確定 收集對數(shù)生長期人臍血MSCs,胰酶消化后調(diào)整細胞懸液濃度,置于96 孔板中,1×105個/孔;在37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)24 h,待細胞貼壁。在96 孔板中配制100 μl 的細胞懸液,將培養(yǎng)板在37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱預培養(yǎng)24 h;然后向培養(yǎng)板分別加入0、5、10、20、40、80 mg/L GS-Rg1 與人臍血MSCs 進行聯(lián)合培養(yǎng)。經(jīng)孵育48 h 后,依據(jù)CCK-8 試劑盒說明書要求,用酶標儀測定各濃度下細胞在450 nm 處的光密度(optical density,OD)值,并設(shè)置對照孔,每組設(shè)定3 個復孔,篩選出GS-Rg1 促人MSCs 增殖的最佳濃度。

      1.3.3 實驗分組 將第4 代人臍血MSCs 分為實驗組和對照組,實驗組用最佳濃度的GS-Rg1 處理;對照組用等體積的磷酸鹽緩沖液處理。

      1.3.4 GS-Rg1 對人臍血MSCs 細胞活性的影響 將細胞置于37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)24 h,使細胞貼壁。取處于指數(shù)生長期的細胞接種到96 孔板上,實驗組中加入最佳濃度的GS-Rg1,對照組用等體積磷酸鹽液處理,將96 孔板中配制100 μl 的細胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預培養(yǎng)24 h,再孵育24 h,向每孔加入10 μl CCK-8 溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h,同時設(shè)置空白組,用酶標儀測定各組在450 nm 處的OD 值,每組設(shè)定3 個復孔,細胞活性=[(實驗組OD 值-空白組OD 值)/(對照組OD 值-空白組OD 值)]×100%。

      1.3.5 GS-Rg1 誘導人MSCs 體外血管生成實驗 基質(zhì)膠4℃過夜溶解,移液槍槍頭盒、EP 管、96 孔板均4℃過夜預冷;第2 天于冰盒上鋪膠,50 μl/孔加入96 孔板,37℃孵箱放置30 min;當人臍血MSCs 增殖至培養(yǎng)皿底部的80%~90%時,使用胰酶消化并重懸,每孔加入1 ml 重懸液,細胞密度達到1×105個/孔;實驗組用最佳濃度GS-Rg1 加入基質(zhì)膠,對照組用等體積磷酸鹽緩沖液處理;37℃孵育,培養(yǎng)24 h 后,倒置顯微鏡下觀察并拍照3 張,選取最典型的圖片展示,采用Image J 分析內(nèi)皮細胞形成的管腔長度,管腔長度=主干長度+分支長度,成管長度取3 次平均值。

      1.3.6 內(nèi)皮分化指標CD31、vWF 測定 將載玻片放入培養(yǎng)板里,然后將2 ml 含有1×106個/ml 第4 代人臍血MSCs 懸液滴加在玻片上,加入最佳濃度GSRg1,48 h 后取出載玻片;放入-20℃冷丙酮中固定30 min,用磷酸鹽緩沖液沖洗3 次,2 min/次;滴加3%過氧化氫溶液室溫孵育10 min,磷酸鹽緩沖液沖洗3 次,2 min/次,0.5%Triton X-100 室溫通透20 min;磷酸鹽緩沖液浸洗3 次,3 min/次,吸干緩沖液,再滴加正常山羊血清,室溫封閉30 min;吸掉封閉液,每孔分別滴加CD31 及vWF 一抗并放入濕盒,4℃孵育過夜;磷酸鹽吐溫緩沖液浸洗細胞3 次,3 min/次,吸取一抗,再滴加稀釋后的熒光二抗,濕盒中孵育1 h,磷酸鹽吐溫緩沖液浸洗3 次;滴加DAPI 避光孵育5 min,對標本進行染核,洗去DAPI;吸干液體,熒光顯微鏡下觀察采集圖像,使用Image-Pro Plus6.0 軟件進行定量分析。

      1.4 統(tǒng)計學方法

      采用SPSS 24.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,計量資料采用均數(shù)±標準差()表示,組間比較采用t檢驗。多組計量資料比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

      2 結(jié)果

      2.1 細胞培養(yǎng)結(jié)果

      顯微鏡下可見細胞形態(tài)均一,呈長梭形的成纖維細胞樣形態(tài),是MSCs 的典型形態(tài)。見圖1。

      圖1 光學顯微鏡下第3 代人臍血間充質(zhì)干細胞(200×)

      2.2 第4 代細胞誘導分化鑒定結(jié)果

      成骨、成軟骨和成脂誘導分化鑒定染色結(jié)果均可見大量深染色部分,顯示其為MSCs。見圖2。

      圖2 人臍血間充質(zhì)干細胞成骨、成軟骨和成脂分化鑒定結(jié)果(400×)

      2.3 不同濃度GS-Rg1 作用下人臍血MSCs 增殖能力比較

      GS-Rg1 濃度為40、80 mg/L 時,人臍血MSCs OD值高于其濃度為0、5、10、20 mg/L 時,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。GS-Rg1 濃度為80 mg/L 時,人臍血MSCs OD 值與其濃度為40 mg/L 時比較,差異無統(tǒng)計學意義(P >0.05)。見圖3。

      圖3 不同濃度GS-Rg1 作用下人臍血間充質(zhì)干細胞增殖能力比較

      2.4 兩組細胞活性比較

      實驗組細胞活性為(97.36±0.72)%,對照組細胞活性為(83.61±3.14)%,實驗組高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(t=13.75,P <0.05)。

      2.5 兩組體外成管情況

      實驗組可見網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成,對照組則多為細胞分散存在,見圖4。實驗組管腔長度長于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05),見圖5。

      圖4 兩組體外成管情況

      2.6 兩組CD31、vWF 熒光強度比較

      實驗組CD31、vWF 熒光強度強于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。見圖6。

      圖6 兩組CD31、vWF 熒光強度比較

      3 討論

      GS-Rg1 是人參的重要活性組分之一,其生理活性作用極為廣泛,而在細胞層面上,具有上述類似功能的MSCs 為進一步研究其相關(guān)機制開辟了新途徑。目前已有研究表明,GS-Rg1 可促進人或動物組織來源的MSCs 增殖[10-11]、血管新生[12],并能誘導MSCs 在不同環(huán)境中定向分化成各種體細胞。目前研究表明,GS-Rg1 可誘導MSCs 表達神經(jīng)元特異性烯醇化酶、膠質(zhì)纖維酸性蛋白及神經(jīng)生長因子,促進MSCs 增殖及向神經(jīng)細胞分化[13]。Yin 等[14]研究發(fā)現(xiàn),10 μmol/L的GS-Rg1 溶液可促進人牙周膜源MSCs 增殖,上調(diào)MSCs 堿性磷酸酶、骨橋蛋白和骨鈣素等因子的表達,最終促進人牙周膜源MSCs 的成骨分化。Xu 等[15]發(fā)現(xiàn),GS-Rg1 可提高第3 代人乳腺脂肪源MSCs 增殖能力,且能促進其向軟骨細胞分化。GS-Rg1 可通過上調(diào)Ⅱ型膠原、酸性磷酸酶及彈性蛋白mRNA 水平來促進人乳腺脂肪源MSCs 向軟骨細胞分化。由此可知,在一定條件下GS-Rg1 可誘導不同來源MSCs 向神經(jīng)細胞、骨細胞及軟骨細胞等定向分化。

      MSCs 已經(jīng)被證明在細胞實驗和動物實驗及臨床中有促進血管生成的作用。MSCs 血管生成特性可歸因于直接分化為內(nèi)皮細胞[16]和旁分泌效應[17]。目前MSCs 主要的誘導分化方法包括外源性生長因子誘導MSCs 分化、基因修飾誘導MSCs 分化、將MSCs 與其他細胞共培養(yǎng)的方式誘導MSCs 分化等[18-19]。目前體外研究MSCs 向血管內(nèi)皮細胞分化常使用的誘導因子有血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子及表皮生長因子等。其中血管內(nèi)皮生長因子是血管內(nèi)皮中最具特異性的分泌性生長因子,是正常血管形成和血管新生的必需調(diào)控因子[20-21]。此外,目前有多種中藥活性成分及復方能誘導MSCs 向內(nèi)皮細胞分化。周細胞是血管內(nèi)壁的重要構(gòu)件之一,能調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的功能,支撐血管的管腔結(jié)構(gòu)。黃芪甲苷可激活TGF/Smad2 途徑介導MSCs 分化為周細胞[22]。黃芪甲苷、丹參酮ⅡA 干預MSCs 后,能提高血管壁主要連接蛋白Cx37、Cx40 和Cx43 表達,促進MSCs 分化為內(nèi)皮細胞[23]。由此可知,中藥可以促進MSCs 定向分化成血管相關(guān)細胞。GS-Rg1 被證實能促進血管新生,但GS-Rg1能否通過誘導MSCs 實現(xiàn)定向成血管分化,目前鮮見相關(guān)研究。

      種宗雷等[24]通過研究不同濃度GS-Rg1 干預人臍帶MSCs 發(fā)現(xiàn)GS-Rg1 對其增殖有顯著的促進作用,可減輕H2O2對人臍帶MSCs 的損傷。但該研究設(shè)置的低、中、高3 個劑量組分別為0.5、4.0、32.0 μmol/L,研究結(jié)果提示GS-Rg1 的濃度與人臍帶MSCs 的增殖呈正相關(guān),而高劑量組32.0 μmol/L 不是促進人臍帶MSCs 增殖的最佳濃度。本研究通過設(shè)置GS-Rg1 濃度梯度,研究其對人臍血MSCs 增殖功能的影響,發(fā)現(xiàn)GS-Rg1 促人臍血MSCs 增殖的最佳濃度為40 mg/L。進一步研究結(jié)果提示GS-Rg1 對人臍血MSCs 的細胞活性有促進作用,是具有制藥前景的細胞活性藥物。本研究結(jié)果提示,GS-Rg1 干預后人臍血MSCs 體外成管能力及表達內(nèi)皮細胞特異性標志物CD31、vWF能力增強,為進一步探尋GS-Rg1 干預人臍血MSCs 后發(fā)揮促進血管新生的分子機制做鋪墊,并為未來GSRg1 更好地應用于臨床提供理論依據(jù)。然而,本研究未涉及分子通路和動物實驗驗證,GS-Rg1 促進MSCs發(fā)揮血管新生功能的具體機制亟待更深入的研究。

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