水豆豉發(fā)酵前后理化特性變化及其提取物對(duì)前列腺癌細(xì)胞抑制作用的初探

游 蘭，董 科，羅若城，何 迅，羅姝菡，陳嘉熠，裴曉方

（四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院(華西第四醫(yī)院), 四川成都610041）

水豆豉（Shuidouchi, SDC），一種中國傳統(tǒng)的發(fā)酵豆制品，具有獨(dú)特的風(fēng)味與較高的營養(yǎng)價(jià)值。在微生物發(fā)酵過程中，大豆蛋白被分解成小分子的氨基酸和多肽，以及發(fā)酵后的總酸、pH、還原糖等理化特性是評(píng)價(jià)水豆豉成熟和營養(yǎng)價(jià)值的主要參考指標(biāo)。此外，發(fā)酵后的大豆中大豆異黃酮、大豆皂苷、豆豉溶纖酶等生物活性成分的存在，進(jìn)一步增加了大豆發(fā)酵產(chǎn)物的保健功能[1]。迄今為止，我國水豆豉的生產(chǎn)多以自然發(fā)酵為主[2]，因而發(fā)酵微生物種類不受人為控制，從而無法保證市售水豆豉的營養(yǎng)價(jià)值和品質(zhì)，存在一定的食用安全隱患。因此，通過單菌發(fā)酵水豆豉，并研究其發(fā)酵后的生物活性物質(zhì)、理化特性、抗氧化能力，對(duì)保障并提高水豆豉食用的安全性尤為重要，且目前對(duì)單菌發(fā)酵水豆豉類似的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。

已有研究證實(shí)發(fā)酵大豆的主要活性成分是大豆異黃酮[3]，具有抗自由基、抗氧化、抗溶血、抗腫瘤等生物活性，其抗腫瘤活性受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，主要表現(xiàn)在抗乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等方面[4-6]。前列腺癌是一類雄激素依賴性腫瘤，目前雄激素剝奪治療是一線治療方法，但只在前列腺癌早期有效，大多數(shù)患者在治療14～30個(gè)月后，腫瘤局部復(fù)發(fā)，同時(shí)對(duì)內(nèi)分泌治療產(chǎn)生抵抗，進(jìn)而便進(jìn)入“去勢(shì)抵抗”階段，發(fā)展成為去勢(shì)抵抗前列腺癌（castrationresistant prostate cancer, CRPC）[7-8]，且CRPC患者的生存期通常小于24個(gè)月。目前，在前列腺癌的治療中除了雄激素剝奪療法，還主要有化療和放射治療。當(dāng)疾病發(fā)展成為CRPC后，這些方法都存在起效慢、副作用大等缺點(diǎn)，因此，尋找安全有效的抗CRPC策略成為亟待解決的公共衛(wèi)生問題。國內(nèi)外學(xué)者在這方面不斷探索，特別是近年來有研究提示[9-10]，膳食中攝入大豆異黃酮能夠降低罹患前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)，并且流行病學(xué)研究也證實(shí)[11]，亞洲人群前列腺癌的低發(fā)生率與膳食中豆類食品或豆制品的較高攝入量相關(guān)。生活方式中膳食的調(diào)節(jié)作用越來越引起人們的關(guān)注，所以，通過食療的方式預(yù)防并延緩CRPC發(fā)生與發(fā)展具有重要的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，尋找一種富含大豆異黃酮的食品也成為研究CRPC的熱點(diǎn)。水豆豉，作為富含大豆異黃酮的發(fā)酵豆制品，是否能抑制前列腺癌的發(fā)生與發(fā)展，目前還未見報(bào)道。

因此，本研究采用從市售水豆豉中篩選出的3株高產(chǎn)蛋白酶菌株發(fā)酵黃豆，測(cè)定發(fā)酵前后氨基酸態(tài)氮、總酸、pH、還原糖含量變化，比較6種大豆異黃酮、總酚、總黃酮含量和抗氧化能力的差異，并初步探討水豆豉提取物對(duì)人去勢(shì)抵抗前列腺癌細(xì)胞Vcap、22RV1的抑制作用。一方面，為水豆豉的保健功能價(jià)值評(píng)價(jià)提供了一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；另一方面，為水豆豉相關(guān)健康產(chǎn)品的研發(fā)、以及深入探討水豆豉抗前列腺癌可能的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)菌株和細(xì)胞株 選擇從市售水豆豉中篩選出的3株高產(chǎn)蛋白酶菌株，編號(hào)為B19、B20、B61，經(jīng)鑒定，B19和B20菌株為枯草芽孢桿菌，B61菌株為貝萊斯芽孢桿菌[12-13]；人去勢(shì)抵抗前列腺癌細(xì)胞（Vcap） 中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；人正常前列腺上皮細(xì)胞（RWPE-1）和人去勢(shì)抵抗前列腺癌細(xì)胞（22RV1） 重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院感染實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（ABTS法、FRAP法）上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DPPH、Hoechst染色試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；人特異性抗原（PSA）、人睪酮（T）、人二氫睪酮（DHT）ELISA檢測(cè)試劑盒 武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司

6種大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品（大豆苷、染料木苷、黃豆黃苷、大豆黃素、染料木素、黃豆黃素） 成都德思特生物科技有限公司；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品大連美侖生物技術(shù)有限公司；UltiMate3000 HPLC儀（色譜柱RPC18柱：柱長250 nm，柱內(nèi)徑4.6 mm，柱填料粒徑5 μm） 美國戴安公司；multiskan GO 1510全波長酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾科技公司；ECLIPSE Ti熒光倒置顯微鏡 日本尼康公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水豆豉的制備 水豆豉的制備如流程圖1所示，具體操作要點(diǎn)如下。挑選：選擇完整、均勻大小的黃豆，除去腐爛、發(fā)霉的黃豆和其他雜質(zhì)。

圖1 水豆豉制備流程圖Fig.1 Flowchart of preparation of Shuidouchi

浸泡：稱取30 g黃豆于250 mL錐形瓶中，加入90 mL蒸餾水后浸泡12 h。瀝干水后稱量，并記錄黃豆?jié)裰刂亓俊?/p>

蒸煮：將瀝干后的黃豆置于高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)121 ℃高壓30 min。

接種菌液：蒸熟黃豆待自然冷卻后接種B19、B20、B61菌株菌液，接菌量為3.00%。

恒溫發(fā)酵：接種菌液搖勻后置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)間為4 d，將其他條件相同，不加入菌液發(fā)酵的黃豆（蒸熟黃豆）作為對(duì)照組。

1.2.2 理化特性的測(cè)定 氨基酸態(tài)氮、總酸、pH、還原糖的測(cè)定方法分別參照國家標(biāo)準(zhǔn)《GB 5009.235-2016 食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》[14]、《GB 12456-2008 食品中總酸的測(cè)定》[15]、《GB 5009.237-2016 食品pH的測(cè)定》[16]、《GB 5009.7-2016 食品中還原糖的測(cè)定》[17]。

1.2.3 大豆異黃酮的測(cè)定 參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 26625-2011《糧油檢驗(yàn)大豆異黃酮含量測(cè)定高效液相色譜法》進(jìn)行測(cè)定[18]。檢測(cè)指標(biāo)包括大豆苷、染料木苷、黃豆黃苷、大豆黃素、染料木素、黃豆黃素6種大豆異黃酮類物質(zhì)。

1.2.4 總酚、總黃酮及抗氧化能力的測(cè)定

1.2.4.1 水豆豉提取物中總酚含量的測(cè)定 參照HE等[19]的實(shí)驗(yàn)方法，用蒸餾水將綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品配制成1 mg/mL的儲(chǔ)備液，再將其稀釋成0.00～0.20 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，將不同濃度的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和提取物溶液混合，依次經(jīng)福林酚試劑、20%碳酸鈉溶液處理后于760 nm處測(cè)定吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)品綠原酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算水豆豉提取物中總酚含量。

1.2.4.2 水豆豉提取物中總黃酮含量的測(cè)定 參照勞佳麗等[20]的實(shí)驗(yàn)方法，用70%乙醇將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品配制1 mg/mL的儲(chǔ)備液，再將其稀釋成0～200 μg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，以不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和提取物溶液混合，依次經(jīng)5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液、4%氫氧化鈉溶液處理后于510 nm處測(cè)定吸光度值，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算水豆豉提取物中總黃酮含量。

1.2.4.3 抗氧化能力的測(cè)定 參照ERCAN等[21]的實(shí)驗(yàn)方法，用蒸餾水將10 mmol/L Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至0～2.0 mmol/L，取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)系列溶液及提取物溶液經(jīng)DPPH 乙醇溶液處理后，混勻后避光放置30 min，于517 nm處測(cè)定吸光度值；ABTS自由基陽離子清除實(shí)驗(yàn)按照試劑盒操作說明進(jìn)行測(cè)定，以Trolox標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算水豆豉提取物清除DPPH和ABTS自由基的能力；FRAP法總抗氧化能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)按照試劑盒操作說明進(jìn)行測(cè)定，以FeSO4·H2O標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定總抗氧化能力。

1.2.5 水豆豉提取物對(duì)CRPC細(xì)胞的抑制作用

1.2.5.1 水豆豉提取物制備 在本課題組前期確定的水豆豉純種發(fā)酵的最優(yōu)條件下[22]，即采用B19菌株發(fā)酵、發(fā)酵溫度40 °C、發(fā)酵時(shí)間4 d、接菌量3.00%。稱取最優(yōu)條件下發(fā)酵的黃豆發(fā)酵物，置于超聲波清洗器中60 ℃提取30 min，重復(fù)2次提取，合并提取液，用布氏漏斗抽濾后，濃縮蒸發(fā)溶解后，得到1 g/mL（以提取物凈重計(jì)）的黃豆發(fā)酵提取物，過0.22 μm濾膜，分裝后于-80 ℃保存。

1.2.5.2 細(xì)胞培養(yǎng) DMEM完全培養(yǎng)液（含5%胎牛血清、1%青、鏈霉素）用于培養(yǎng)Vcap細(xì)胞、RPMI-1640培養(yǎng)液（含5%胎牛血清、1%青、鏈霉素）用于培養(yǎng)RWPE-1和22RV1細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.5.3 水豆豉提取物作用濃度及時(shí)間篩選 對(duì)數(shù)生長期的Vcap、22RV1及RWPE-1細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞數(shù)調(diào)節(jié)至5×104個(gè)/mL后接種于96孔板，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。水豆豉提取物設(shè)置為0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 mg/mL系列濃度，同時(shí)設(shè)置空白組（只含完全培養(yǎng)基）和對(duì)照組（只含細(xì)胞和完全培養(yǎng)基），于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24、48 h。CCK8法測(cè)定細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率（%）=（A實(shí)驗(yàn)組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）×100，根據(jù)結(jié)果篩選出對(duì)正常細(xì)胞RWPE-1無明顯毒性的水豆豉提取物作用濃度和時(shí)間。

1.2.5.4 Hoechst染色觀察CRPC細(xì)胞形態(tài) 根據(jù)篩選出水豆豉提取物的有效濃度和作用時(shí)間，對(duì)干預(yù)后的Vcap、22RV1細(xì)胞進(jìn)行Hoechst染色，置于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5.5 ELISA檢測(cè)培養(yǎng)基中PSA、DHT及T的含量 對(duì)PSA、T及DHT含量的檢測(cè)，參照PSA、DHT及T ELISA檢測(cè)試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

組間對(duì)比采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNKq檢驗(yàn)，均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有數(shù)值均由均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 水豆豉發(fā)酵前后理化特性與活性成分的變化

2.1.1 理化特性分析 樣品中氨基酸態(tài)氮、總酸、pH、還原糖的測(cè)定含量如表1所示。B19、B20、B61號(hào)菌株發(fā)酵的水豆豉中氨基酸態(tài)氮、總酸、還原糖含量均高于蒸熟黃豆，其中B19號(hào)菌株發(fā)酵的水豆豉中氨基酸態(tài)氮、還原糖含量最高。B19菌株發(fā)酵水豆豉的氨基酸態(tài)氮含量最高（7.76 g/kg），高于同屬細(xì)菌發(fā)酵的日本納豆中平均氨基酸態(tài)氮含量（6.0 g/kg）[23]，但低于曲霉發(fā)酵的瀏陽豆豉中氨基酸態(tài)氮（13.7 g/kg）[24]，這可能與發(fā)酵選用菌種及其產(chǎn)蛋白酶特性有關(guān)[25]。樣品均為弱酸性或中性，其pH大小差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），本研究發(fā)酵品總酸的含量均低于別的產(chǎn)品，可能由發(fā)酵不完全導(dǎo)致。

表1 樣品中理化成分的檢測(cè)結(jié)果Table 1 Test results of physicochemical components in samples

2.1.2 大豆異黃酮變化分析 根據(jù)國標(biāo)方法測(cè)定水豆豉中大豆異黃酮含量，6種大豆異黃酮色譜峰形及分離效果較好，如圖2所示，方法的靈敏度和特異度均滿足實(shí)驗(yàn)要求，加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示回收率均在（100%±10%）之間。樣品中6種大豆異黃酮均有檢出，含量如圖3所示?？偞蠖巩慄S酮的比較如圖4所示，B19、B20、B61號(hào)菌株發(fā)酵的水豆豉中總大豆異黃酮均高于蒸熟黃豆，三株菌中，B19號(hào)菌株發(fā)酵的水豆豉中總大豆異黃酮含量最高。發(fā)酵水豆豉中總大豆異黃酮總含量均＞1000 mg/kg，高于其他豆類食品（嫩豆腐、腐乳等）（100～600 mg/kg）[26]。但值得注意的是，與其他研究報(bào)道的發(fā)酵豆豉如永川豆豉、瀏陽豆豉不同[27]，這些豆豉在發(fā)酵過程中其總大豆異黃酮含量呈下降趨勢(shì)，提示發(fā)酵菌種和加工工藝等因素對(duì)豆豉的營養(yǎng)活性成分有重要的影響[28]。

圖2 6種大豆異黃酮色譜圖Fig.2 Chromatogram of 6 soybean isoflavones

圖3 樣品中6種大豆異黃酮含量的比較Fig.3 Comparison of isoflavones contents of 6 soybean isoflavones in samples

圖4 不同樣品中總大豆異黃酮含量的比較Fig.4 Comparison of total soybean isoflavones in different samples

2.1.3 總酚、總黃酮含量分析 不同菌株發(fā)酵水豆豉總酚、總黃酮測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。B19、B20、B61號(hào)菌株發(fā)酵后總黃酮含量均高于蒸熟黃豆，三株菌中B19、B61菌株發(fā)酵后總黃酮含量高于B20號(hào)；總酚含量測(cè)定顯示，B19、B61號(hào)菌株發(fā)酵后總酚均高于蒸熟黃豆，其中B19號(hào)菌株發(fā)酵后總酚含量最高。

表2 不同菌株發(fā)酵水豆豉的總酚、總黃酮含量結(jié)果Table 2 Experimental results of the contents of total phenols and flavonoids in SDC fermented by different strains

2.1.4 抗氧化能力的測(cè)定 FRAP實(shí)驗(yàn)，DPPH、ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。B19、B61號(hào)菌株發(fā)酵的水豆豉抗氧化能力均強(qiáng)于蒸熟黃豆；而B20號(hào)菌株發(fā)酵后水豆豉DPPH自由基清除能力與蒸熟黃豆相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。發(fā)酵后總酚、總黃酮含量及抗氧化能力明顯提高，而抗氧化能力的提高可能與發(fā)酵后總酚含量增加，或是與增加的游離氨基酸和多肽相關(guān)[29]。后者提示發(fā)酵過程中游離氨基酸和多肽的增加或?qū)Χ怪破房寡趸钚蕴嵘哂兄匾饬x。但在不同豆制品理化特性與活性成分的比較中，大豆種類、發(fā)酵菌種、加工工藝等因素的影響是多樣性的，需綜合評(píng)價(jià)。

表3 不同菌株發(fā)酵水豆豉抗氧化能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Experimental results of antioxidant capacity of SDC fermented by different strains

2.2 B19菌株發(fā)酵水豆豉提取物對(duì)CRPC細(xì)胞的抑制作用

2.2.1 提取物中大豆異黃酮的測(cè)定 水豆豉提取物中大豆異黃酮的含量如圖5所示，6種大豆異黃酮均有檢出，總大豆異黃酮含量為（1713.25±75.38） mg/kg（以黃豆干重計(jì)）。其中，在糖苷型中，大豆苷含量最高，為（711.15±35.21） mg/kg；在苷元型中，染料木素含量最高，為（86.17±25.17） mg/kg。

圖5 SDC提取物中6種大豆異黃酮含量Fig.5 Contents of 6 soybean isoflavones in SDC extracts

2.2.2 提取物作用濃度及時(shí)間篩選 作用時(shí)間為12、24、48 h時(shí)，RWPE-1、22RV1和Vcap細(xì)胞的存活率均隨提取物濃度增大而降低，呈現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系。在不同作用時(shí)間、濃度下，細(xì)胞存活率：RWPE-1＞Vcap＞22RV1細(xì)胞。當(dāng)作用濃度為64 mg/mL時(shí)，三種細(xì)胞存活率均低于2%。22RV1細(xì)胞隨著作用時(shí)間的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低，呈現(xiàn)出時(shí)間-反應(yīng)關(guān)系；而RWPE-1和Vcap細(xì)胞在作用濃度大于2 mg/mL時(shí)呈時(shí)間-反應(yīng)關(guān)系，在作用濃度小于2 mg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率反而隨作用時(shí)間的增加而有上升趨勢(shì)。因此，為保證水豆豉提取物對(duì)前列腺正常細(xì)胞RWPE-1無明顯損傷作用，又能保證對(duì)前列腺癌細(xì)胞22RV1和Vcap細(xì)胞的殺傷作用，故選擇水豆豉提取物濃度為2、4、8 mg/mL，作用時(shí)間為24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖6)。

圖6 不同作用時(shí)間細(xì)胞的存活率Fig.6 Cell survival rate at different time of treatment

2.2.3 提取物對(duì)CRPC細(xì)胞形態(tài)的影響 經(jīng)篩選出的2、4、8 mg/mL水豆豉提取物干預(yù)22RV1和Vcap細(xì)胞24 h后，Hoechst染色對(duì)CRPC細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測(cè)，于倒置熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如圖7所示。隨著作用濃度的增加，凋亡細(xì)胞明顯增多，且凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染或呈塊狀致密濃染，并可見凋亡小體。提示其對(duì)22RV1、Vcap細(xì)胞具有選擇性殺傷作用，并能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞的增殖是通過周期來實(shí)現(xiàn)的，而調(diào)控細(xì)胞周期主要依靠細(xì)胞周期蛋白和周期素依賴性激酶，其過表達(dá)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。李飛等[30]的研究表明，染料木黃酮能抑制周期蛋白的表達(dá)，且能阻滯CRPC細(xì)胞于G2/M期，從而抑制細(xì)胞進(jìn)行分裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而細(xì)胞凋亡可能是抑制細(xì)胞增殖的原因之一，細(xì)胞凋亡在抑制腫瘤發(fā)展中起重要作用。提示大豆異黃酮可能是水豆豉提取物中促進(jìn)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵活性成分。

圖7 SDC對(duì)CRPC細(xì)胞形態(tài)的影響（100×）Fig.7 Influence of SDC on CRPC cell morphology（100×）

2.2.4 提取物對(duì)CRPC細(xì)胞中PSA含量的影響 與對(duì)照組相比，各劑量組均能抑制22RV1細(xì)胞中PSA的分泌，但水豆豉提取物對(duì)Vcap細(xì)胞中PSA的分泌沒有抑制作用。PSA作為前列腺癌特異性標(biāo)志物，其含量與疾病的發(fā)展息息相關(guān)，可及時(shí)反映前列腺癌患者的治療情況。在本研究中，水豆豉取物能夠抑制22RV1細(xì)胞PSA的分泌， CRPC細(xì)胞擁有雄激素合成所需的酶及調(diào)節(jié)蛋白，可以通過從頭合成途徑將膽固醇合成雄激素，從而激活 AR信號(hào)通路，但該提取物是否是通過作用于AR信號(hào)通路進(jìn)而抑制其分泌還需進(jìn)一步研究(圖8)。

圖8 SDC對(duì)CRPC細(xì)胞分泌PSA的影響Fig.8 Effects of SDC on PSA secretion by CRPC cells

2.2.5 提取物對(duì)CRPC細(xì)胞中DHT及T含量的影響提取物濃度≥4 mg/mL時(shí)抑制22RV1細(xì)胞DHT的合成，提取物濃度≥8 mg/mL時(shí)抑制Vcap細(xì)胞DHT的合成。各劑量組的提取物均能抑制22RV1和Vcap細(xì)胞T的合成。DHT是前腺癌細(xì)胞通過從頭合成途徑合成的最終產(chǎn)物，水豆豉提取物能下調(diào)CRPC細(xì)胞DHT的表達(dá)水平，這提示水豆豉提取物能夠有效的抑制CRPC細(xì)胞雄激素的合成，但其抑制機(jī)制還需進(jìn)一步研究(圖9)。

圖9 SDC對(duì)CRPC細(xì)胞分泌DHT及T的影響Fig.9 Effects of SDC on DHT and T secretion by CRPC cells

3 結(jié)論

比較3株高產(chǎn)蛋白酶菌株單菌發(fā)酵水豆豉后理化特性、活性成分及抗氧還能力的改變，發(fā)現(xiàn)均有不同程度地改變和提升，并篩選出一株具有較好理化特性及抗氧化活性的B19菌株，為進(jìn)一步研發(fā)水豆豉健康相關(guān)產(chǎn)品提供理論依據(jù)；以B19菌株在前期確定的最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵制備水豆豉，發(fā)現(xiàn)其水提物對(duì)CRPC細(xì)胞具有選擇性殺傷作用，并能促進(jìn)其凋亡，同時(shí)對(duì)前列腺特異性抗原（PSA）、雄激素睪酮（T）和二氫睪酮（DHT）分泌有抑制作用，為后續(xù)探討水豆豉對(duì)前列腺癌作用的相關(guān)機(jī)制提供思路和數(shù)據(jù)參考，水豆豉提取物抑制CRPC細(xì)胞的潛在機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。